Screening von zyklischen di-GMP-Modulatoren unter Verwendung von Bakterien, die ein fluoreszierendes Reporterprotein exprimieren

Nehmen Sie eine Multi-Well-Platte mit gentechnisch veränderten pathogenen Bakterien, die mit verschiedenen Testverbindungen gezüchtet wurden, zusammen mit Negativkontrollen.

Die Bakterien tragen ein Plasmid mit einem Gen, das für das grün fluoreszierende Protein (GFP) kodiert.

Der Promotor für das Gen wird durch ein Protein aktiviert, das auf intrazelluläre zyklische di-GMP- oder c-di-GMP-Konzentrationen reagiert.

Legen Sie die Platte in einen Tellerleser.

Verwenden Sie die Negativkontrolle, die aufgrund des Fehlens eines c-di-GMP-Inhibitors maximal fluoresziert, um die Einstellungen für eine optimale Fluoreszenzsignalmessung anzupassen.

Hemmt eine Testsubstanz die c-di-GMP-Bildung, sinkt der intrazelluläre c-di-GMP-Spiegel.

Reduzierte c-di-GMP-Spiegel lösen eine Konformationsänderung des Proteins aus, die zu einer Repression des Promotors und einer niedrigen GFP-Expression führt, was zu einer verminderten Fluoreszenz führt.

Messen Sie die Fluoreszenz und analysieren Sie die Daten, um Testverbindungen zu identifizieren, die den intrazellulären c-di-GMP-Spiegel in pathogenen Bakterien modulieren.

Etwa 30 Minuten vor der spektrophotometrischen Messung den Plattenleser auf 37 Grad Celsius vor