Screening von zyklischen di-GMP-Modulatoren unter Verwendung von Bakterien, die ein fluoreszierendes Reporterprotein exprimieren

Nehmen Sie eine Multi-Well-Platte mit gentechnisch veränderten pathogenen Bakterien, die mit verschiedenen Testverbindungen gezüchtet wurden, zusammen mit Negativkontrollen.

Die Bakterien tragen ein Plasmid mit einem Gen, das für das grün fluoreszierende Protein (GFP) kodiert.

Der Promotor für das Gen wird durch ein Protein aktiviert, das auf intrazelluläre zyklische di-GMP- oder c-di-GMP-Konzentrationen reagiert.

Legen Sie die Platte in einen Tellerleser.

Verwenden Sie die Negativkontrolle, die aufgrund des Fehlens eines c-di-GMP-Inhibitors maximal fluoresziert, um die Einstellungen für eine optimale Fluoreszenzsignalmessung anzupassen.

Hemmt eine Testsubstanz die c-di-GMP-Bildung, sinkt der intrazelluläre c-di-GMP-Spiegel.

Reduzierte c-di-GMP-Spiegel lösen eine Konformationsänderung des Proteins aus, die zu einer Repression des Promotors und einer niedrigen GFP-Expression führt, was zu einer verminderten Fluoreszenz führt.

Messen Sie die Fluoreszenz und analysieren Sie die Daten, um Testverbindungen zu identifizieren, die den intrazellulären c-di-GMP-Spiegel in pathogenen Bakterien modulieren.

Etwa 30 Minuten vor der spektrophotometrischen Messung den Plattenleser auf 37 Grad Celsius vorwärmen, um Kondensation zu vermeiden. Entfernen Sie vor dem Lesen vorsichtig die luftdurchlässige Deckeldichtung von der Platte.

Messen Sie dann die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 Nanometern mit einer Einstellung von 10 Blitzen pro Vertiefung und einer Einschwingzeit von 0,2 Sekunden. Nehmen Sie vor der Messung der Fluoreszenz eine automatische Verstärkungs- und Fokusanpassung basierend auf der negativen Kontrollvertiefung A24 vor und stellen Sie den Verstärkungszielwert auf 75 % ein.

Wählen Sie die Fokuseinstellung und einen Kanal A auf der rechten Seite des Fensters aus. Messen Sie die Fluoreszenz des GFP-Reporters bei einem Anregungsmaximum von 485 Nanometern und einem Emissionsmaximum von 520 Nanometern mit einer Einstellung von 10 Blitzen pro Vertiefung und einer Einschwingzeit von 0,2 Sekunden.

Sammeln Sie Daten von allen untersuchten Platten. Die Messwerte werden von der Steuerungssoftware des Plattenlesers automatisch als Standard gespeichert.

Um die Daten zu analysieren, sehen Sie sich die Messwerte an, indem Sie auf das Mars-Symbol in der Steuerungssoftware klicken, um das statistische Analysepaket zu öffnen. Rufen Sie die Daten ab, indem Sie auf die gewünschte Plattennummer doppelklicken, um auf die Daten für die Analyse zuzugreifen.

Bewerten Sie die Gleichmäßigkeit und Reproduzierbarkeit des Assays mit einer robusten Z-Prime-Analyse.

Berechnen Sie dann die prozentuale Hemmung des Wachstums und bewerten Sie die prozentuale Hemmung des intrazellulären Spiegels von c-di-GMP, wie im Textprotokoll beschrieben.