Screening von zyklischen di-GMP-Modulatoren unter Verwendung von Bakterien, die ein fluoreszierendes Reporterprotein exprimieren
JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologie
0 Ansichten • 3:15 Min. • October 30th, 2025
Nehmen Sie eine Multi-Well-Platte mit gentechnisch veränderten pathogenen Bakterien, die mit verschiedenen Testverbindungen gezüchtet wurden, zusammen mit Negativkontrollen.
Die Bakterien tragen ein Plasmid mit einem Gen, das für das grün fluoreszierende Protein (GFP) kodiert.
Der Promotor für das Gen wird durch ein Protein aktiviert, das auf intrazelluläre zyklische di-GMP- oder c-di-GMP-Konzentrationen reagiert.
Legen Sie die Platte in einen Tellerleser.
Verwenden Sie die Negativkontrolle, die aufgrund des Fehlens eines c-di-GMP-Inhibitors maximal fluoresziert, um die Einstellungen für eine optimale Fluoreszenzsignalmessung anzupassen.
Hemmt eine Testsubstanz die c-di-GMP-Bildung, sinkt der intrazelluläre c-di-GMP-Spiegel.
Reduzierte c-di-GMP-Spiegel lösen eine Konformationsänderung des Proteins aus, die zu einer Repression des Promotors und einer niedrigen GFP-Expression führt, was zu einer verminderten Fluoreszenz führt.
Messen Sie die Fluoreszenz und analysieren Sie die Daten, um Testverbindungen zu identifizieren, die den intrazellulären c-di-GMP-Spiegel in pathogenen Bakterien modulieren.
Etwa 30 Minuten vor der spektrophotometrischen Messung den Plattenleser auf 37 Grad Celsius vorwärmen, um Kondensation zu vermeiden. Entfernen Sie vor dem Lesen vorsichtig die luftdurchlässige Deckeldichtung von der Platte.
Messen Sie dann die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 Nanometern mit einer Einstellung von 10 Blitzen pro Vertiefung und einer Einschwingzeit von 0,2 Sekunden. Nehmen Sie vor der Messung der Fluoreszenz eine automatische Verstärkungs- und Fokusanpassung basierend auf der negativen Kontrollvertiefung A24 vor und stellen Sie den Verstärkungszielwert auf 75 % ein.
Wählen Sie die Fokuseinstellung und einen Kanal A auf der rechten Seite des Fensters aus. Messen Sie die Fluoreszenz des GFP-Reporters bei einem Anregungsmaximum von 485 Nanometern und einem Emissionsmaximum von 520 Nanometern mit einer Einstellung von 10 Blitzen pro Vertiefung und einer Einschwingzeit von 0,2 Sekunden.
Sammeln Sie Daten von allen untersuchten Platten. Die Messwerte werden von der Steuerungssoftware des Plattenlesers automatisch als Standard gespeichert.
Um die Daten zu analysieren, sehen Sie sich die Messwerte an, indem Sie auf das Mars-Symbol in der Steuerungssoftware klicken, um das statistische Analysepaket zu öffnen. Rufen Sie die Daten ab, indem Sie auf die gewünschte Plattennummer doppelklicken, um auf die Daten für die Analyse zuzugreifen.
Bewerten Sie die Gleichmäßigkeit und Reproduzierbarkeit des Assays mit einer robusten Z-Prime-Analyse.
Berechnen Sie dann die prozentuale Hemmung des Wachstums und bewerten Sie die prozentuale Hemmung des intrazellulären Spiegels von c-di-GMP, wie im Textprotokoll beschrieben.
Übersicht
Diese Studie untersucht die Modulation der intrazellulären c-di-GMP-Spiegel in genetisch veränderten pathogenen Bakterien mittels Fluoreszenzmessungen. Der Ansatz nutzt ein GFP-Reportersystem, um die Wirkung verschiedener Testsubstanzen auf das bakterielle Verhalten zu bewerten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Mikrobiologie
- Genetic Engineering
- Fluoreszenzmessung
Hintergrund
- Cyclisches di-GMP ist ein sekundärer Botenstoff in Bakterien, der verschiedene zelluläre Prozesse reguliert.
- Fluoreszierende Proteine wie GFP werden als Reporter zur Visualisierung der Genexpression verwendet.
- Das Verständnis der Modulation von c-di-GMP kann Einblicke in die bakterielle Pathogenität liefern.
- Testsubstanzen können die c-di-GMP-Konzentration beeinflussen und damit das bakterielle Verhalten verändern.
Zweck der Studie
- Identifizierung von Verbindungen, die die Bildung von c-di-GMP in pathogenen Bakterien hemmen.
- Messung der resultierenden Änderungen der GFP-Expression als Indikator für die Modulation von c-di-GMP.
- Beurteilung der Wirksamkeit des Assays bei der Identifizierung potenzieller Inhibitoren.
Verwendete Methoden
- Verwendung einer Mehrfachbrunnenplatte mit genetisch veränderten Bakterien, die ein GFP-Plasmid tragen.
- Fluoreszenzmessungen werden nach dem Vorwärmen mit einem Plattenreader durchgeführt.
- Die optische Dichte und Fluoreszenz werden bei spezifischen Wellenlängen gemessen.
- Die Datenanalyse umfasst die statistische Auswertung und Berechnung der prozentualen Hemmung.
Hauptergebnisse
- Testverbindungen, die die Bildung von c-di-GMP hemmen, führten zu einer verminderten GFP-Expression.
- Die Fluoreszenzsignale korrelierten mit den Konzentrationen von intrazellulärem c-di-GMP.
- Der Assay zeigte Reproduzierbarkeit und Gleichförmigkeit der Ergebnisse.
- Die statistische Analyse bestätigte die Wirksamkeit der Screening-Methode.
Schlussfolgerungen
- Die Studie identifizierte erfolgreich Verbindungen, die die c-di-GMP-Spiegel modulieren.
- Fluoreszenzbasierte Assays können wirksam sein, um potenzielle Inhibitoren zu screenen.
- Weitere Untersuchungen könnten die therapeutischen Implikationen dieser Ergebnisse erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieser Test ermöglicht die Hochdurchsatz-Screening von kleinen Molekülen, die die zyklische Di-GMP-Signalübertragung modulieren, einen zentralen Virulenzregulator in pathogenen Bakterien. Durch die Kopplung von c-di-GMP-Spiegeln an die GFP-Fluoreszenz liefert er eine quantitative, reproduzierbare Messgröße für die Zielentlastung bei der Entdeckung von Antimikrobiellen. Der Ansatz unterstützt die frühe Identifizierung von Verbindungen, die die bakterielle Pathogenität ohne bakterizide Wirkung abschwächen und somit das Risiko der Resistenzentwicklung verringern.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft die therapeutische Hypothese, dass die Modulation von c-di-GMP die Virulenz bei gramnegativen Krankheitserregern abschwächt.
- Operationaler Wert: Verwendet einen genetisch kodierten Reporter, um c-di-GMP als pharmakologisch angreifbares Target in Pseudomonas aeruginosa funktionell zu validieren.
- Prädiktiver Wert: Ermöglicht eine mechanismenbasierte Vorauswahl von Verbindungen, die die intrazelluläre Signalübertragung statt des Wachstums unterdrücken.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet ein standardisiertes, fluoreszenzbasiertes System für die Bibliotheksscreening von Verbindungen im Mehrfachbrunnenformat vor.
- Quantitative Ausgabe: Misst die GFP-Fluoreszenz bei 485/520 nm, um die Behandlung mit Verbindungen mit der c-di-GMP-abhängigen Promotoraktivität zu korrelieren.
- Reproduzierbarkeit: Verwendet Z-Prime-Analyse und negative Kontrollen, um die Assay-Uniformität über mehrere Platten und Durchläufe hinweg sicherzustellen.
Translationale und präklinische Forschung
- Klinische Relevanz: Zielstruktur ist c-di-GMP, ein konservierter Regulator der Biofilmbildung und Virulenz bei klinisch relevanten Krankheitserregern.
- Translationale Kontinuität: Unterstützt den Übergang von der Trefferidentifizierung zur Lead-Optimierung, indem ein mechanistischer Biomarker für das Target-Engagement bereitgestellt wird.
- Risikominderung: Verringert falsch-positive Ergebnisse, indem spezifische Signalinhibitoren durch Normalisierung auf den OD600 von allgemein zytotoxischen Verbindungen unterschieden werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Test eignet sich für die frühe Entdeckungsphase und ermöglicht die Primärscreening chemischer Bibliotheken auf Anti-Virulenz-Treffer, bevor eine sekundäre Validierung in Infektionsmodellen erfolgt.
- Entdeckungsbiochemie: Prüft die Zielstrukturenbindung, indem Fluoreszenzänderungen gemessen werden, die intrazelluläre c-di-GMP-Dynamiken widerspiegeln.
- Screening: Liefert dosisabhängige, plattenbasierte Messwerte, die für die Automatisierung und mittelhochdurchsatzfähige Kampagnen geeignet sind.
- Analytik: Erzeugt prozentuale Hemmungsdaten, die auf negative und positive Kontrollen normalisiert sind, zur Rangfolge von Verbindungen.
- Translationale Forschung: Verbindet die in vitro-Modulation des Targets mit verringerten Virulenzeigenschaften und unterstützt Entscheidungen über den Übergang in die präklinische Entwicklung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine Plug-and-Play-Plattform, die an andere c-di-GMP-regulierte Pathogene oder Promotor-Reporter-Systeme angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet mechanistische Sicherheit hinsichtlich der Zielmodulation und verringert Mehrdeutigkeiten bei phänotypischen Screening-Ergebnissen.
- Operationaler Wert: Standardisiert Protokolle zur Fluoreszenzmessung, einschließlich Verstärkung, Fokus- und Temperaturkontrollen für die Reproduzierbarkeit zwischen Laboren.
- Strategischer Wert: Ermöglicht die Priorisierung von Verbindungen mit selektiver anti-virulenter Wirkung gegenüber einer breiten Wachstumshemmung.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt eine risikoadjustierte Investition in neuartige antimikrobielle Wirkstoffklassen mit geringerer Resistenzanfälligkeit.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der bakteriellen Genetik, Plasmid-Transformation und Validierung von Promotor-Reporter-Systemen.
- Benötigt einen Mikrotiterplattenreader, der in der Lage ist, die Doppelwellenlänge OD600 und Fluoreszenz mit programmierbarer Verstärkung/Fokusierung zu detektieren.
- Setzt eine standardisierte Herstellung der Verbindungen und eine Testung der DMSO-Toleranz voraus, um falsche Signale zu vermeiden.
- Erfordert die Optimierung von Inkubationszeit, Temperatur und Belüftung für ein konsistentes bakterielles Wachstum und die Expression des Reporters.
- Auf Pathogene oder Modelle beschränkt, bei denen c-di-GMP einen GFP-exprimierenden Promotor reguliert; ohne genetische Modifikation nicht universell anwendbar.
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Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026