Nachweis der Zielenzymexpression in genetisch veränderten bakteriellen Zellen

Beginnen Sie mit Röhrchen mit genetisch veränderten Bakterienzellen. Jedes Bakterium trägt hochkopierte Fosmide, die verschiedene Enzyme codieren.

Inkubieren Sie die Röhren mit Schütteln, um die Expression verschiedener intrazellulärer Enzyme zu erleichtern.

Füge ein Substrat, das dem Zielenzym entspricht, dem Reagenzglas hinzu und füge dem Kontrollröhrchen ein gleiches Volumen Puffer hinzu.

Inkubieren Sie mit Zittern. Das Substrat dringt in die Zellen ein, wo die Zielenzyme es spalten und ein fluoreszierendes Produkt erzeugen.

Laden Sie das Steuerrohr in ein vorkalibriertes Durchflusszytometer.

Wenn jede Zelle einen Laserstrahl durchquert, streut sie Licht. Erstellen Sie ein Streudiagramm, um einzelne Zellen zu identifizieren, die weniger Licht streuen als Klumpen.

Schließen Sie die Zellklumpen aus und zeichnen Sie das Fluoreszenzsignal der einzelnen Zellen, um Ausgangsfluoreszenz zu bestimmen.

Setzen Sie das substratbehandelte Rohr in das Durchflusszytometer, um das Fluoreszenzsignal zu messen.

Ein erhöhtes Fluoreszenzsignal in substratbehandelten Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen bestätigt die Zielexpression des Enzyms.

Um die interessanten metagenomischen Enzyme zu screenen, inkubieren Sie die sortierten Zellen bei 37 Grad Celsius und 200 U/min, bis der OD₆₀₀ 0,5 erreicht. Dann fügen Sie 1 Mikroliter Kopieninduktionslösung hinzu, um die intrazelluläre Fosmid-Kopienzahl zu verstärken.

Nach drei Stunden bei 37 Grad Celsius und 250 U/min werden 0,5 Milliliter der Zellen mit dem entsprechenden Substrat in einem 14-Milliliter-Rundbodenrohr zu einer Endkonzentration von 100 Mikromolaren kombiniert. Dann inkubieren Sie die Kontroll- und experimentellen Proben bei 37 Grad Celsius und 200 U/min für weitere drei Stunden.

Während die Proben schütteln, stellen Sie die Parameter der FACS-Maschine wie gerade demonstriert ein. Anschließend geben Sie 5 Mikroliter Zellen aus jeder Probe in einzelne 5-Milliliter-Rundbodenröhrchen mit 1 Milliliter PBS ein. Als Nächstes laden Sie die Stichprobenzellen und stellen Sie die Ereignisrate auf 1000 bis 3000 Ereignisse pro Sekunde ein.

Erstellen Sie ein log-skaliertes Vorwärts-Streu-Areal versus ein log-skaliertes Seiten-Streuflächen-Streudiagramm und passen Sie das R1-Streugatter so an, dass es die Singulet-Event-Bakterienzellen umfasst. Dann erstellen Sie ein log-skaliertes Vorwärts-Streudiagramm im Vergleich zu log-skalierten FITC-Flächen-Streudiagramm und setzen ein R2-Sortiergatter so, dass weniger als 0,1 % der negativen Zellen erkannt werden. Laden Sie nun das Probenröhrchen und passen Sie die Ereignisrate bei Bedarf auf 1000 bis 3000 Ereignisse pro Sekunde an.