Nachweis der Zielenzymexpression in genetisch veränderten bakteriellen Zellen

Beginnen Sie mit Röhrchen mit genetisch veränderten Bakterienzellen. Jedes Bakterium trägt hochkopierte Fosmide, die verschiedene Enzyme codieren.

Inkubieren Sie die Röhren mit Schütteln, um die Expression verschiedener intrazellulärer Enzyme zu erleichtern.

Füge ein Substrat, das dem Zielenzym entspricht, dem Reagenzglas hinzu und füge dem Kontrollröhrchen ein gleiches Volumen Puffer hinzu.

Inkubieren Sie mit Zittern. Das Substrat dringt in die Zellen ein, wo die Zielenzyme es spalten und ein fluoreszierendes Produkt erzeugen.

Laden Sie das Steuerrohr in ein vorkalibriertes Durchflusszytometer.

Wenn jede Zelle einen Laserstrahl durchquert, streut sie Licht. Erstellen Sie ein Streudiagramm, um einzelne Zellen zu identifizieren, die weniger Licht streuen als Klumpen.

Schließen Sie die Zellklumpen aus und zeichnen Sie das Fluoreszenzsignal der einzelnen Zellen, um Ausgangsfluoreszenz zu bestimmen.

Setzen Sie das substratbehandelte Rohr in das Durchflusszytometer, um das Fluoreszenzsignal zu messen.

Ein erhöhtes Fluoreszenzsignal in substratbehandelten Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen bestätigt die Zielexpression des Enzyms.

Um die interessanten metagenomischen Enzyme zu screenen, ink