Hoher Durchsatz, Echtzeit, Doppel-Ausleseprüfung intrazellulärer antimikrobieller Aktivität und eukaryotischen Zelle Zytotoxizität

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, einen einzigen kombinierten Echtzeit-Assay zu verwenden, um spezifische niedermolekulare Inhibitoren des intrazellulären Bakterienwachstums zu identifizieren, die für Wirtszellen nicht toxisch sind. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der antimikrobiellen Forschung zu beantworten. Welche Arten von Verbindungen können in intrazelluläre Kompartimente eindringen und Krankheitserreger abtöten, ohne die Wirtszelle zu schädigen?

Die Hauptvorteile dieser Technik sind das bakterielle Wachstum: Die Toxizität von Säugetierzellen wird gleichzeitig mit zerstörungsfreien Echtzeit-Assays nachgewiesen. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, mit der Skalierbarkeit zu kämpfen haben, die sie bietet. Die Analyse von mehr als zehntausend Verbindungen in einer Sitzung erfordert eine ganze Reihe neuer Techniken und Geräte.

Neben Lucius zeigen die Postdoktoranden KP Smith, Yoon-Suk Kang, Jennifer Tsang, Thea Brennan-Krohn und die Studentin Kat Truelson ein gemeinsames Engagement für die akademische antimikrobielle Entdeckung und die translationale diagnostische Mikrobiologie. Zur Präparation der Wirtszellen wird J774A kultiviert. 1 Makrophage befindet sich in Suspension in RPMI 1640 mit neun Prozent eisenhaltigem Kälberserum.

Zunächst Passagezellen in Gewebekulturflaschen. Nachdem die Zellen in einem 75 Quadratzentimeter großen Gewebekulturkolben in 15 Millilitern Medium konfluierend geworden sind, spalten Sie die Zellen, indem Sie sie abkratzen und auf 65 Milliliter mit der gleichen Art von Medium verdünnen. 15 Milliliter werden wieder in den Gewebekulturkolben gegeben und 50 Milliliter in einen 250-Milliliter-Bakterienschüttelkolben umgefüllt.

Belüften Sie, indem Sie die Drehzahl auf ca. 120 Umdrehungen pro Minute einstellen. Für ein gleichmäßiges Wachstum inkubieren Sie bei genau fünf Prozent Kohlendioxid und 37 Grad Celsius. Ernten Sie die Zellen, wenn sie eine Dichte im Bereich von zwei Komma fünf Millionen Zellen pro Milliliter bis zu fünf Millionen Zellen pro Milliliter erreichen.

Stellen Sie sicher, dass der Anteil toter Zellen 25 Prozent nicht überschreitet, da tote Zellen das Hintergrundrauschen in Zytotoxizitätstests erhöhen. Es ist wichtig, die Ansiedlung von Zellen in Reservoirs zu verhindern, wenn Sie große Mengen an Makrophagen und Bakterien mit Liquid Handlern abgeben. Schwenken Sie die Reservoire während der Abgabe alle paar Minuten, um Ungleichmäßigkeiten zu vermeiden und die Plattenvertiefungen zu untersuchen.

Plattieren Sie die Zellen in mit weißer Gewebekultur behandelten, 384-Well-Mikrotiterplatten mit 50.000 Zellen in 30 Mikrolitern Gewebekulturmedium pro Well. Inkubieren Sie Mikrotiterplatten über Nacht, um am Tag des Experiments eine konfluenz von neunzig Prozent zu erreichen. Bereiten Sie Bakterienflecken für Experimente vor, indem Sie die Organismen dick auf einer neuen BCYE-Platte verteilen und einen Tag lang inkubieren, um ein konfluentes Wachstum zu erhalten.

Die Organismen werden in demselben Gewebekulturmedium resuspendiert, das auch für die J774A.1-Zellen verwendet wurde. Um die Makrophageninfektion durchzuführen, fügen Sie Testverbindungen von Interesse, einschließlich Screening-Verbindungen, sowie Positiv- und Negativkontrollen für die Hemmung des bakteriellen Wachstums bei der eukaryotischen Zelllyse hinzu.

Stammlösungen sollten mit mindestens 500x in DMSO oder einer wässrigen Lösung gelöst werden, um eine ausreichende Verdünnung des Vehikels zu ermöglichen. Verdünnen Sie lumineszierende Bakterien auf ein Ziel von zwei Komma fünf Millionen KBE pro Millileter in Gewebekulturmedium. Fügen Sie dann einen geeigneten, ungiftigen, membranverunreinigten Nukleinsäure-Findungsfarbstoff in einer Konzentration von zwei Komma und fünf x dem endgültigen Assay hinzu.

Geben Sie 20 Mikroliter dieser Mischung in jede Kulturvertiefung. Das endgültige Assay-Volumen beträgt 50 Mikroliter, und die endgültige Bakterienkonzentration sollte eine Million KBE pro Milliliter für den Lux-Epron-Reporter oder vier Millionen KBE pro Milliliter für den fluoreszierenden Proteinreporter betragen. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius, ein bis drei Tage lang in fünf Prozent Kohlendioxid bei 100 Prozent relativer Luftfeuchtigkeit, um Verdunstungskanteneffekte zu vermeiden.

Um temperaturbedingte Kanteneffekte beim Ablesen von Assay-Ergebnissen zu vermeiden, gleichen Sie Mikrotiterplatten vor der Lumineszenzmessung thermisch aus, indem Sie sie in einer einzigen Schicht auf einem Labortisch mit angelehnten Deckeln für etwa 20 Minuten platzieren. Lesen Sie das Bakterienwachstum und die Toxizität eukaryotischer Zellen auf einem Mikroplatten-Luminometer und einem Fluorometer ab, je nach den verwendeten Reportern. Bringen Sie die Mikrotiterplatten wieder in den Inkubator zurück, wenn eine Echtzeitauslesung zu einem späteren Zeitpunkt gewünscht wird.

Analysieren Sie die Daten, wie im Textprotokoll beschrieben. Bereiten Sie für Dosis-Wirkungs- und Synergie-Testexperimente wie bisher Makrophagen in Bakterien vor. Kurz vor einer Makrophageninfektion oder axenischen Inkubation sollte ein automatisiertes Liquid-Handling-System verwendet werden, um das Ansprechen der Einzeldosis in kombinatorischen Synergietests zu erleichtern, die durch direkte automatisierte Zugabe von antimikrobiellen Verdünnungen gemäß dem Herstellerprotokoll eingerichtet sind.

Fügen Sie antimikrobielle Wirkstoffe von experimentellem Interesse in einer seriellen Verdopplungsverdünnungsreihe hinzu. Das Ziel ist es, am oberen Ende eine Konzentration zu erstrecken, die das Wachstum vollständig eliminiert, und am unteren Ende eine Konzentration, die keine offensichtliche Aktivität zeigt. Hier sind repräsentative Ergebnisse über die Zeit für bakterielle Lumineszenz und zytotoxizitätsassoziierte Fluoreszenz dargestellt.

Beachten Sie die gegensätzlichen Wirkungen von antimikrobieller Behandlung und zytotoxischem Detergens für eukaryotische Zellen. Die duale IC50- und CC50-Dosis-Wirkungs-Bestimmung in denselben Screening-Wells wurde verwendet, um die Selektivität für das Antibiotikum Doxycyclin zu bestimmen. Die bakterielle Replikation wurde durch mittlere Konzentrationen des Antibiotikums gehemmt.

Zytotoxizität wurde jedoch bei hohen Konzentrationen beobachtet, die mit der Selektivität von etwa 100 vereinbar waren. Das gleiche Assay-Format wurde verwendet, um die zweidimensionale Dosis-Wirkungs-Beziehung für Kombinationen von Minocyclin und Azithromycin zu testen. Isokonturen verbinden Punkte mit gleicher intrazellulärer Wachstumshemmung.

Hier deuteten konkave Isokonturen auf starke synergistische Effekte für die beiden Medikamente hin. Digitale Dispensierrobotik für die Einrichtung von Assays, Echtzeit-Auslesung und Hochdurchsatzformat ermöglichten kombinatorische Triple-Synergie-Tests. Hier deutet die Beobachtung einer deutlich konkaven Oberfläche auf einen hohen Grad an synergistischem Effekt für Kombinationen von Minocyclin, Azithromycin und Rifampicin gegen das intrazelluläre Wachstum von Legionella pheumophila hin.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Auslesung von Fluoreszenz- oder Lumineszenz-Assays mit Echtzeit-Zytotoxizitätstests im Hochdurchsatz-Assay-Format kombinieren können. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie das konfokale Mikroskop angewendet werden, um Fragen zum biologischen Geschehen in der gesamten Zelle zu beantworten, die ebenfalls mit ihrer antimikrobiellen Aktivität oder Ganzzellzytotoxizität verbunden sind. Obwohl wir die Auswirkungen auf die Replikation von Legionellen untersucht haben, können die gleichen Techniken auch auf andere intrazelluläre Krankheitserreger wie Brucella und Mikrobakterien angewendet werden.

Wir haben dieses Protokoll zum ersten Mal entwickelt, als wir versuchten, einen Assay zu finden, der einfach und zuverlässig genug ist, um in einem Screening-Format mit sehr hohem Durchsatz verwendet zu werden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit bakteriellen Krankheitserregern, Zelllinien und Robotergeräten einige inhärente Risiken birgt und geeignete Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. die Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung bei der Durchführung dieses Verfahrens.