Hoher Durchsatz, Echtzeit, Doppel-Ausleseprüfung intrazellulärer antimikrobieller Aktivität und eukaryotischen Zelle Zytotoxizität

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, mithilfe eines einzigen kombinatorischen Echtzeit-Assays spezifische kleine Molekül-Inhibitoren des intrazellulären Bakterienwachstums zu identifizieren, die für Wirtszellen nicht toxisch sind. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der antimikrobiellen Wirkstoffentdeckung zu beantworten. Insbesondere welche Arten von Verbindungen in der Lage sind, in intrazelluläre Kompartimente einzudringen und Krankheitserreger abzutöten, ohne die Wirtszelle zu schädigen?

Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass bakterielles Wachstum und toxische Wirkungen auf Säugerzellen gleichzeitig mithilfe nicht-destruktiver, echtzeitfähiger Tests nachgewiesen werden. In der Regel haben Personen, die mit dieser Methode neu beginnen, Schwierigkeiten mit der Skalierbarkeit, die sie bietet. Die Analyse von mehr als zehntausend Verbindungen in einer Sitzung erfordert eine völlig neue Reihe von Techniken und Geräten.

Neben Lucius zeigen die Postdoktoranden KP Smith, Yoon-Suk Kang, Jennifer Tsang, Thea Brennan-Krohn sowie die Bachelor-Studentin Kat Truelson ein gemeinschaftliches Engagement für die akademische Entdeckung von Antimikrobiellen Wirkstoffen und die translationale diagnostische Mikrobiologie. Zum Vorbereiten der Wirtszellen kultivieren Sie J774A.1-Makrophagen in Suspension in RPMI 1640 mit neun Prozent eisensupplementiertem Kälberserum.

Erstmalige Passage der Zellen in Zellkulturgefäßen. Nachdem die Zellen in einem 75 cm²-Zellkulturgefäß bei 15 mL Medium konfluent geworden sind, die Zellen durch Abkratzen aufspalten und mit dem gleichen Medium auf 65 mL verdünnen. Geben Sie 15 mL zurück in das Zellkulturgefäß und überführen Sie 50 mL in ein 250 mL-Bakterien-Schüttelgefäß.

Begasen Sie, indem Sie die Rotationsgeschwindigkeit auf etwa 120 Umdrehungen pro Minute einstellen. Inkubieren Sie zur konsistenten Zellvermehrung exakt bei fünf Prozent Kohlendioxid und 37 Grad Celsius. Ernten Sie die Zellen, wenn sie eine Dichte im Bereich von zweieinhalb Millionen Zellen pro Milliliter bis fünf Millionen Zellen pro Milliliter erreicht haben.

Stellen Sie sicher, dass der Anteil an toten Zellen 25 Prozent nicht übersteigt, da tote Zellen das Hintergrundrauschen in Zytotoxizitätsassays erhöhen. Es ist entscheidend, das Absinken von Zellen in den Reservoirs zu verhindern, wenn Sie große Volumina von Makrophagen und Bakterien mit Flüssigkeitsmanagern dosieren. Rühren Sie die Reservoirs alle paar Minuten vorsichtig durch, um Inhomogenitäten und Ungleichmäßigkeit in den Assay-Plattenmulden zu vermeiden.

Pflanzen Sie die Zellen in weißen, für Zellkultur behandelten Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen mit jeweils 50.000 Zellen in 30 µL Zellkulturmedium pro Vertiefung aus. Inkubieren Sie die Mikrotiterplatten über Nacht, um am Tag des Experiments eine Konfluenz von neunzig Prozent zu erreichen. Bereiten Sie Bakterieninseln für die Experimente vor, indem Sie die Organismen dicht auf einer neuen BCYE-Platte ausstreichen und einen Tag lang inkubieren, um konfluentes Wachstum zu erhalten.

Suspendieren Sie die Organismen erneut in dem gleichen Zellkulturmedium, das für die J774A.1-Zellen verwendet wird. Um die Makrophageninfektion durchzuführen, geben Sie die gewünschten Testverbindungen hinzu, einschließlich Screening-Substanzen sowie positiver und negativer Kontrollen zur Hemmung des bakteriellen Wachstums in der lysierten eukaryotischen Zelle.

Die Stammlösungen sollten in DMSO oder einer wässrigen Lösung mit mindestens 500facher Konzentration gelöst werden, um eine ausreichende Verdünnung des Lösungsmittels zu ermöglichen. Verdünnen Sie lumineszierende Bakterien auf ein Ziel von zweieinhalb Millionen KBE pro Milliliter in Zellkulturmedium. Fügen Sie dann einen geeigneten, nicht toxischen, membranimpermeablen Nukleinsäure-Färbefarbstoff in einer endgültigen Assay-Konzentration von zweieinhalbmal hinzu.

Fügen Sie 20 Mikroliter dieser Mischung zu jedem Kulturbrunnen hinzu. Das endgültige Testvolumen beträgt 50 Mikroliter und die endgültige Bakterienkonzentration sollte eine Million CFU pro Milliliter für den lux-epron-Reporter oder vier Millionen CFU pro Milliliter für den fluoreszierenden Protein-Reporter betragen. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für ein bis drei Tage in fünf Prozent Kohlendioxid bei 100 Prozent relativer Luftfeuchtigkeit, um verdunstungsbedingte Randeffekte zu vermeiden.

Um temperaturbedingte Randeffekte beim Auslesen von Assayergebnissen zu vermeiden, sollten Mikroplatten vor dem Lumineszenzlesen durch Einlegen in einer einfachen Schicht auf dem Labortisch mit angelehnten Deckeln für etwa 20 Minuten thermisch äquilibratisiert werden. Lesen Sie das bakterielle Wachstum und die Toxizität eukaryotischer Zellen mit einem Mikroplatten-Luminometer und Fluorometer, je nach den verwendeten Reportern. Falls eine Echtzeitauslesung zu späteren Zeitpunkten gewünscht ist, bringen Sie die Mikroplatten zurück in den Inkubator.

Analysieren Sie die Daten wie im Textprotokoll beschrieben. Für Dosis-Wirkungs- und Synergietestexperimente bereiten Sie Makrophagen in Bakterien wie zuvor vor. Unmittelbar vor der Makrophageninfektion oder der axenischen Inkubation verwenden Sie ein automatisiertes Flüssigkeitsmanagementsystem, um die Einzeldosis-Wirkung in der kombinatorischen Synergietestanordnung durch direkte automatisierte Zugabe von Antimikrobiellverdünnungen gemäß Herstellervorschrift zu ermöglichen.

Fügen Sie Antimikrobielle mit experimentellem Interesse in einer seriellen Verdünnungsreihe mit Verdoppelungsschritten hinzu. Ziel ist es, eine Konzentrationsspanne zu erreichen, die an der oberen Grenze das Wachstum vollständig unterdrückt und an der unteren Grenze keine offensichtliche Wirkung zeigt. Dargestellt sind hier repräsentative Ergebnisse im Zeitverlauf für bakterielle Lumineszenz und mit Zytotoxizität assoziiierte Fluoreszenz.

Beachten Sie die gegensätzlichen Wirkungen der antimikrobiellen Behandlung und des zytotoxischen Detergens für eukaryotische Zellen. Die gleichzeitige Bestimmung der Dosis-Wirkungs-Kurven für IC50 und CC50 in denselben Testansätzen wurde verwendet, um die Selektivität von Doxycyclin als Antibiotikum zu ermitteln. Die bakterielle Vermehrung wurde durch mittlere Konzentrationen des Antibiotikums gehemmt.

Jedoch wurde bei hohen Konzentrationen eine Zytotoxizität beobachtet, was mit einer Selektivität von etwa 100 übereinstimmt. Derselbe Testaufbau wurde verwendet, um die zweidimensionale Dosis-Wirkungsbeziehung für Kombinationen von Minocyclin und Azithromycin zu untersuchen. Isocontouren verbinden Punkte gleicher intrazellulärer Wachstumshemmung.

Hier deuteten konkave Isoflächen auf starke synergistische Effekte der beiden Wirkstoffe hin. Digitale Dosierrobotik für die Assay-Präparation, Echtzeit-Auslesung und das Hochdurchsatzformat ermöglichten die Testung kombinatorischer dreifacher Synergien. Hier legt die Beobachtung einer deutlich konkaven Oberfläche einen hohen Grad synergistischer Wirkung von Kombinationen aus Minocyclin, Azithromycin und Rifampicin gegen das intrazelluläre Wachstum von Legionella pneumophila nahe.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man entweder fluoreszierende oder lumineszierende Assayauslesungen mit Echtzeit-Testverfahren zur Zytotoxizität im Hochdurchsatzformat kombiniert. Nach diesem Verfahren können auch andere Methoden wie die konfokale Mikroskopie angewendet werden, um Fragen zu biologischen Vorgängen in der gesamten Zelle zu beantworten, die ebenfalls im Zusammenhang mit ihrer antimikrobiellen Wirkung oder Gesamtzellzytotoxizität stehen. Obwohl wir die Auswirkungen auf die Vermehrung von Legionellen untersucht haben, können dieselben Techniken auch auf andere intrazelluläre Pathogene wie Brucella und Mikrobakterien angewendet werden.

Wir entwickelten dieses Protokoll ursprünglich, um einen einfachen und zuverlässigen Assay zu finden, der für ein Format mit sehr hohem Durchsatz geeignet ist. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit bakteriellen Krankheitserregern, Zelllinien und Roboterausrüstung gewisse inhärente Risiken birgt und entsprechende Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, beispielsweise die Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung während der Durchführung dieses Verfahrens.