Name: Hoher Durchsatz, Echtzeit, Doppel-Ausleseprüfung intrazellulärer antimikrobieller Aktivität und eukaryotischen Zelle Zytotoxizität (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Erfahren Sie eine Hochdurchsatz-Methode zur Echtzeit-Erfassung antimikrobieller Aktivität und Zytotoxizität in eukaryotischen Zellen. Dieses Protokoll ermöglicht die Identifizierung zellpenetranter Wirkstoffe gegen intrazelluläre Bakterien.

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Die in diesem Manuskript berichtete Forschung wurde vom National Institute of Allergy and Infectious Diseases der National Institutes of Health unter der Preisnummer R01AI099122 an J.E.K. unterstützt. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health wieder. Wir danken Jennifer Smith, David Wrobel, Su Chiang, Doug Flood, Sean Johnston, Jennifer Nale, Stewart Rudnicki, Paul Yan, Richard Siu und Rachel Warden von der ICCB-Longwood Screening Facility und/oder dem National Screening Laboratory for the New England Regional Centers of Excellence in Biodefense and Emerging Infectious Diseases (unterstützt von U54AI057159) für ihre Unterstützung bei der Entwicklung und Durchführung von Hochdurchsatz-Screening-Assays. Wir möchten uns auch bei Kenneth P. Smith für hilfreiche Kommentare zum Manuskript bedanken.

1. Echtzeit intrazelluläres Wachstum und eukaryotischen Zelle Zytotoxizitätstest <ol><li> Vorbereiten Wirtszellen (J774A.1 Zellen) <ol><li> Kultur J774A.1 Mus musculus Makrophagen-ähnlichen Zellen in Suspension in RPMI 1640 mit 9% Eisen ergänzt Kälberserum. Zunächst Passage in Zellkulturflaschen. Nachdem die Zellen konfluent in einem 75 cm 2 Gewebekulturkolben in 15 ml Medium geworden sind, geteilt durch Abkratzen und Verdünnen auf 65 ml mit dem gleichen Typ des Mediums, von denen 15 ml in die Gewebekulturkolben zurückgeführt wird , und 50 ml transferiert in einen 250 ml Bakterien Schüttelkolben. </li><li> Für Scale-up-Kultur in Suspension in 250 ml und / oder 1000 ml bis zu einem Fünftel Volumen gefüllt Bakterienflaschen mit Gewebekulturmedium. Belüften, indem Rotationsgeschwindigkeit bei etwa 120 Umdrehungen pro Minute. Für ein stetiges Wachstum, genau 5% CO 2 und 37 ° C inkubiert. </li><li> Ernte Zellen , wenn sie erreichen Dichte im Bereich von 2,5 x 10 6 Zellen/ ml bis 5 x 10 6 Zellen / ml. Stellen Sie sicher, tote Zelle Prozentsatz (am einfachsten durch Trypan-Blau-Färbung getestet) 25% nicht überschreiten, da tote Zellen werden Hintergrundgeräusche in Zytotoxizitätstests erhöhen. </li><li> Platte in weiß, Gewebekultur-behandelten 384-Well - Mikrotiterplatten mit 5 × 10 4 J774A.1 - Zellen in 30 &amp; mgr; l Gewebekulturmedium pro Vertiefung. Mikrotiterplatten über Nacht inkubieren 90% Konfluenz am Tag des Experimentes zu erreichen. </li></ol></li><li> Vorbereiten Lumineszenz- oder Fluoreszenz - Legionella pneumophila <ol><li> Passage L. pneumophila (LP02 :: flaA :: Lux 8) Bakterien auf geeigneten Medium, dh gepufferte Kohle Hefeextrakt (BCYE) Medium. Wenn ein Thymidin-auxotrophen Stamm verwenden, ergänzen Medium mit 100 ug / ml Thymidin. Bereiten Sie Patches von Bakterien, die für Experimente von Organismen dicht an einem neuen BCYE Platte und Inkubation 1 Tag verbreitet (wenn aus einer früheren Plattendurchgang) oder zwei bis drei Tage (wenn aus gefrorenem Lager) konfluent zu erhaltenWachstum. <ol><li> Bereiten BCYE Platten durch Lösen von 10 g Hefeextrakt, 10 g N - (2-Acetamido) -2-aminoethansulfonsäure, 0,35 g K 2 HPO 4 und 1 g monobasisches Kalium α-Ketoglutarat in 950 ml deionisiertem Wasser hergestellt . Passen Sie auf pH 6,9 bei Kaliumhydroxid (≥2.5 ml von 11,9 Mol-Lösung). </li><li> In 15 g Agar und 2 g Aktivkohle; und bringen auf 1 l Endvolumen. Fügen Sie einen magnetischen Rührstab und Autoklaven. Kühles Medium auf 55 ° C und Addier-Filter-sterilisierten Lösungen, die 0,4 g L-Cystein und 0,42 g Ammoniumeisen (III) -citrat in deionisiertem Wasser gelöst. Verwenden Magnet Rührplatte zu gießen Petrischalen vor mischen. </li><li> Für die Prüfung des Wachstums von L. pneumophila in axenic Wachstumsmedium, bereiten ACES-Hefeextraktbrühe (AYE) durch alle chemischen Reagenzien für BCYE mit Ausnahme von Kohle und Agar verwendet zu kombinieren. Filter sterilisieren und sofort verwenden oder für spätere Experimente einzufrieren. </li></ol></li><li> Resuspendieren Organismen im same Gewebekulturmedium für J774A.1-Zellen mit 100 ug / ml Thymidin Supplementierung entsprechend verwendet. </li></ol></li><li> Makrophagen-Infektion <ol><li> In Testverbindungen von Interesse (Screening-Verbindungen und positive und negative Kontrollen für die bakterielle Wachstumshemmung und eukaryotischen Zell-Lyse). Vorzugsweise Stammlösungen bei ≥500x in DMSO (Dimethylsulfoxid) oder einer wässrigen Lösung zu ermöglichen, eine ausreichende Verdünnung des Fahrzeugs zu lösen. <ol><li> Obwohl Stammlösungen können eingefroren gelagert werden, vermeiden Sie Frost-Tau-Zyklen für labile Verbindungen und antimikrobielle Mittel. </li></ol></li><li> Verdünnte Leuchtbakterien von 2,5 x 10 6 CFU (koloniebildende Einheit) / m und fluoreszierende Reporter-markierten Bakterien bis 1,0 x 10 7 CFU / ml in Gewebekulturmedium zum Ziel und geeigneten nicht-toxischen hinzuzufügen, membran impermeant, Nukleinsäure- bei 2,5x Endtestkonzentration bindenden Farbstoff. </li><li> In 20 ul Mischung zu jeder J774A.1 Kultur gut, Endassayvolumen50 &amp; mgr; l, letzte Bakterienkonzentration 1 × 10 6 KBE / ml (lux - Operon - Reporter) oder 4 x 10 10 6 KBE / ml (fluoreszierendes Protein Reporter). </li><li> Bei 37 ° C inkubieren , für 1-3 Tage in 5% CO 2 bei 100% relativer Luftfeuchtigkeit Verdunstungsrandeffekte zu vermeiden. </li></ol></li><li> Assay Ablesbarkeit <ol><li> Bakterienwachstum Lesen und eukaryotische Zelltoxizität auf einem Mikroplatten-Luminometer und Fluorimeter als geeignet für Reporter verwendet wird. <ol><li> Um die Temperatur-assoziierten Randeffekte, thermisch äquilibrieren Mikrotiterplatten vor der Lumineszenz Lesung durch Platzierung in einer einzigen Schicht auf einem Labortisch mit Deckel halb offen für ca. 20 min (oder in einem biologischen Sicherheitsschrank mit Deckel ab ca. 10 min) zu vermeiden. </li></ol></li><li> Zurück Mikrotiterplatten Inkubator, wenn Echtzeit-Anzeige zu späteren Zeitpunkten erwünscht ist. </li></ol></li></ol> 2. Datenanalyse <ol><li> Normalisieren Daten auf positive und negative controllen Prozent zu berechnen oder Fold-Hemmung für die intrazelluläre bakterielle Wachstum und die prozentuale Zytotoxizität für eukaryotische Zellen. </li><li> Assay Robustheit beurteilen, Berechnen statistische Trennung zwischen den positiven und negativen Kontrollen sowohl für bakterielle Wachstumshemmung und Zytotoxizität unter Verwendung Z-Faktor (Z &#39;) -Analyse , wobei Z&#39; = 1-3 (σ p + σ n) / | &amp; mgr; p + &amp; mgr; n |. In dieser Gleichung σ p und σ n sind die Standardabweichungen für die positiven und negativen Kontrollvertiefungen sind; μ p und &amp; mgr; n sind die Mittelwerte für die positiven und negativen Kontrollvertiefungen, respectively. <ol><li> Für Hochdurchsatz-Screening-Assays, berechnen Standard Z-Scores (oder eine andere Alternative, quantitative statistische Maßnahmen) Wirkungen der Testverbindungen von Interesse zu bewerten. Alternativ berechnen eine einfache Falte-Reduktion oder Log-fache Reduktion als potenziell physiologisch relevanter<html> Maß für die Wirkung Größe für geometrisch replizierende Bakterien. </li></ol></li></ol> 3. Single und Multi-dimensionale (dh Synergy) Dosis-Wirkungs-Prüfung und Interpretation der Daten <ol><li> Bereiten Makrophagen und Bakterien wie in Protokollabschnitt 1 beschrieben. </li><li> Unmittelbar vor der Infektion oder axenischen Inkubation, antimikrobielle Mittel von experimentellen Interesse in einer seriellen hinzuzufügen Verdünnungsreihe Verdoppelung mit dem Ziel , spanning am oberen Ende mit einer Konzentration , die vollständig das Wachstum beseitigt (dh die minimale Hemmkonzentration oder MHK) und auf der Nieder Ende eine Konzentration, die keine offensichtliche Aktivität zeigt. </li><li> Verwenden eines automatisierten Liquid-Handling-System einzelne Dosis-Wirkungs-und kombinatorische Synergie-Test-Setup durch direkte, automatisierte Zugabe von antimikrobiellen Verdünnungen zu erleichtern dem Protokoll des Herstellers nach. </li><li> Betrachten wir die Verwendung von Sub-Verdopplungsverdünnungen, beispielsweise841 / 54841eq1.jpg &quot;/&gt; - Verdünnungsreihe falten und Test repliziert Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Daten zu erhöhen. </li><li> Für Makrophagen - Infektion, verdünnten Leuchtbakterien von 2,5 x 10 6 CFU (koloniebildende Einheit) / ml in Gewebekulturmedium zu zielen. In 20 ul Mischung zu jeder J774A.1 Kultur gut, Endassayvolumen 50 &amp; mgr; l, endgültige Bakterienkonzentration 1 × 10 6 KBE / ml; und bei 37 ° C in 5% CO 2 bei 100% relativer Luftfeuchtigkeit inkubiert. <ol><li> Für axenic Wachstumstests, verdünnten Leuchtbakterien bis zu einer Endkonzentration von 1 x 10 &amp; sup6 ; CFU / ml in Medium AYE, werden 50 &amp; mgr; l in jede Vertiefung einer 384-Well - Platte und inkubiere bei 37 ° C in 5% CO 2 bei 100% relativer Luftfeuchtigkeit. </li></ol></li><li> Berechnen fraktionierte Inhibitor-Konzentration Index für antimikrobielle Kombinationen, die das Bakterienwachstum zu hemmen. Für jedes Medikament in der Kombination (a, b,.. N), die in vollständig oder&gt; 99% Hemmung des Bakterien g ergibtrowth, die Berechnung der einzelnen fraktionierten inhibitorischen Konzentration (FIC a, b, n...) wie folgt: FIC a = die Konzentration der Verbindung &quot;a&quot; durch die minimale Inhibitor - Konzentration von &quot;a&quot; von selbst geteilt. . Unter Verwendung der gleichen Formel, berechnen FIC b, usw. Dann die kombinatorische FIC - Index berechnen oder <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/54841/54841eq2.jpg" /> FIC = FIC a + b + FIC. . .FIC N für jede hemmende Kombination. <ol><li> Verwenden Sie die kombinatorischen Index, der am weitesten von 1,0 abweicht Synergien zu beurteilen. Betrachten wir ein Cutoff von ≤0.5 als konservative Angabe einer synergistischen Effekt und ≥4, eine antagonistische Wirkung. 12 </li><li> Plot Isobologramme, Isokontur Isobologramme und / oder Isofläche Isobologramme 6 als alternative grafische Darstellungen von kombinatorischen Wirkungen. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wir beschreiben Echtzeit-Assays zum gleichzeitigen Nachweis des intrazellulären Bakterienwachstums und der Zytotoxizität der Wirtszelle. Das Protokoll enthält mehrere kritische Schritte. Erstens muss für eine robuste Assay-Leistung eine ausreichende spektrale Trennung zwischen bakteriellen und zytotoxischen Messwerten vorhanden sein. Eine solche Trennung ist intrinsisch für Kombinationen von Luciferase-Operon-Reportern und fluoreszierenden DNA-bindenden Farbstoffen. Basierend auf unseren Erfahrungen (Tabelle 1-3<...

Pathogene, die wachsen oder sich dort aufhalten vorübergehend in intrazellulären Kompartimenten sind schwer zu therapeutisch auszurotten. Obligat oder relativ intrazelluläre Erreger obligat wie Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, spp Brucella. , Francisella tularensis und Mycobacterium spp. erfordern oft Kurse der antimikrobiellen Therapie zur Heilung verlängert, die von Monaten sogar Jahre reichen. Darüber hinaus können extrazelluläre Erreger transient intrazellulären Nischen besetzen und auf diese Weise der Freigabe durch normalen Kurse der antimikrobiellen Therapie entkommen und später entstehen neue Runden von virulenten Infektion zu starten. Staphylococcus aureus 1 und uropathogene Enterobacteriaceae 2,3 - Infektionen sind zwei Beispiele zunehmend erkannt. Daher ist eine grundlegende Drug Discovery Ziel Roman antimikrobielle Substanzen zu identifizieren, die in intrazelluläre Kompartimente eindringen. Optimale Therapie, um schnell zu beseitigenintrazelluläre Organismen und Entwicklung von Resistenzen durch subinhibitorischen antimikrobielle Exposition verhindern, ist besonders erwünscht. Zu diesem Zweck haben wir ein Hochdurchsatz - Screening - Technologie zu intrazellulärem-penetrierenden antimikrobielle Mittel die intrazelluläre Wachstum des Modells pathogen Targeting, Legionellen pneumophila identifizieren. 4 Bisherige klinische Beobachtungen zeigen , dass Standard antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung nicht genau in vivo therapeutische Wirksamkeit gegen diesen Organismus vorhersagen. Spezifisch 5 war dies wegen Hauptklassen von antimikrobiellen Mitteln wie β-Lactame und Aminoglykoside, obwohl hochwirksam gegen axenisch gewachsen Legionellen, nicht ausreichend nicht in die intrazellulären Kompartimente eindringen , wo Legionellen befindet. 5,6 Später Beweise vorgeschlagen , dass technisch komplexer intrazellulären Wachstumstests effektiv klinische Wirksamkeit vorhergesagt. 7 </sup&gt; Leider waren diese Assays extrem mühselige Endpunkte Assays infizierten Makrophagen erfordern, mit antimikrobiellen Mitteln behandelt, zu verschiedenen Zeiten Punkte für koloniebildende Einheit Enumeration lysiert werden. Solche Tests sind unpraktisch in großem Maßstab zu tun und für Hochdurchsatz-Wirkstoffforschung ungeeignet sind. Daher entwickelten wir Technologie für Echtzeit-Bestimmung der intrazellulären Bakterienwachstum. 6 Dies wurde durch die Verwendung eines Bakterienstammes erreicht modifiziert durch Integration von entweder einer bakteriellen Luciferase - Operon 8 (erste Generation Assay zuvor beschrieben) 4 oder fluoreszierendes Protein 9 Reporter (zweite Generation, orthogonal Assays hier beschrieben) in das Bakterienchromosom. Auf diese Weise Lumineszenz- oder Fluoreszenzsignal liefert ein Surrogat, Echtzeit-Auslesen von Bakterienzahl. Allerdings sind diese Attribute nicht einen großen Störfaktor bei der intrazellulären infectio Adressen-Assays, Off-Target-Effekte auf Wirtszellen. Insbesondere begrenzt der Tod der Wirtszelle von Natur aus intrazellulären Wachstum und führt zu falschen positiven Identifizierung der antimikrobiellen Wirkung. Wie viele Verbindungen in Screening-Bibliotheken sind eukaryotische Zelle toxisch, so Fehlalarme wahr antimikrobielle Substanzen überwältigen würde, eine große Anzahl von Follow-up, Endpunkt Cytotoxizitätsassays für die Auflösung erforderlich macht. So war es von großem Interesse eukaryotische Zelllebensfähigkeit zu bewerten zu können und das intrazelluläre Wachstum gleichzeitig. Bemerkenswert ist, ein Merkmal der nicht lebensfähigen eukaryontischen Zellen ist der Verlust der Zellmembranintegrität. Sonden, die die Durchlässigkeit der Zellmembran testen kann daher verwendet werden, die Lebensfähigkeit der Zellen zu untersuchen. Wir gekennzeichnet zuvor die Fähigkeit einer Reihe von putativ Zellmembran-impermeante, fluoreszierende DNA-bindende Farbstoffe zuzugreifen und Kern-DNA von abgestorbenen Zellen färben. 4 Bei der Bindung Kern - DNA, diese Farbstoffe eine starke Zunahme der Quantu anzeigenm Fluoreszenzausbeute was zu einer erhöhten Signal gegenüber dem Hintergrund Lösung Fluoreszenz. Als solche, sofern diese Farbstoffe eine quantitative Anzeige der eukaryotischen Zelltod. Bemerkenswerter 4, fanden wir , dass mehrere waren nicht toxisch selbst während längerer Koinkubation mit J774 Makrophagen. Wenn während der Erstinfektion hinzugefügt, sofern sie eine Echtzeit-Fluoreszenz-Anzeige von eukaryotischen Zelltod, die mikroskopisch durch eine Mikrotiterplatte oder Fluorimeter beobachtet gemessen werden kann. Daher ist es durch Verwendung eines bakteriellen Reporter kombiniert und ungiftig, Membran-impermeablen, DNA-bindende Farbstoffe, waren wir in der Lage, ein einfaches, zerstörungsfrei, Echtzeit-Assay sowohl bakterielle Belastung und eukaryotischen Zell-Cytotoxizität gleichzeitig zu messen zu entwickeln. Dieser Assay hat uns in 384-Well-Plattenformat ~ 10.000 bekannt bioactives einschließlich ~ 250 antimikrobiellen Mitteln und&gt; 240.000 kleine Moleküle mit funktionell nicht charakterisierten Aktivität auf die Fähigkeit zur Hemmung der intrazellulären Wachstum zu screenen erlaubtLegionella pneumophila, während zur gleichen Zeit für jede Verbindung eukaryotischen Zell - Cytotoxizität Daten. 6 Unsere Analyse bekannter antimikrobieller Mittel gegen intrazelluläre Wachstum von Legionellen war die umfassendste Untersuchung dieser Art bisher. 6 Basierend auf der Effizienz unseres Testformats, erforschten wir auch anschließend die potenziell synergistische Wirkungen bekannter antimikrobieller Mittel, wenn sie in Kombination verwendet werden. Eine der häufigsten Synergietests, die so genannte Schachbrett Assay wird üblicherweise durch die Beurteilung der kombinatorischen Wirkung von zweifachen Reihenverdünnungen von zwei oder mehreren antimikrobiellen Mitteln durchgeführt. 10 In diesen Assays wird Synergie durch die Beobachtung von grßeren Effekt definiert , wenn zwei oder mehr antimikrobielle Mittel zusammen als die Summe der Wirkungen von jeweils separat aufgetragen angewendet werden. Zu beachten ist , konzentrierte sich bisher nur und selektive Synergie Test wurde gegen intrazelluläre Legionella pneumophila durchgeführt </em&gt; wegen der großen Anstrengungen in der traditionellen Endpunkt-Assays durch die kombinatorische Permutationen erforderlich multipliziert beteiligt. Um Synergie Prüfung zu erleichtern, haben wir den Einsatz unserer Echtzeit - intrazellulären Wachstum / eukaryotischen Zytotoxizitätstest in Kombination mit automatisierten digitalen Dosiertechnik 6. Diese Automatisierung erlaubt uns serielle Verdünnungen der Verbindungen in DMSO oder wässriger Lösung allein oder in Kombination in 384-Well-Format gelöst zu verzichten. 11 Darüber hinaus solche robuste Liquid - Handling - Technologie erlaubt uns leicht höhere Auflösung führen zu, Quadratwurzel von zwei Kindern ( und nicht als der Standard, mit geringerer Auflösung, Verdoppelung) Verdünnung Kombinationen zu einer höheren Spezifität in unserem zweidimensionalen erreichen, schachbrett Synergie Analyse. Diese Resolution war besonders wertvoll Bedenken in der Synergie Bereich über Reproduzierbarkeit Adressierung bei der Verwendung von zweifache Verdünnungsreihe 12. Schließlich war unser Test quantitative und auch therefore Abstufungen der Hemmung gemessen. Als Ergebnis erfasst der Test für die Vollständigkeit der inhibitorischen Informationen exprimierbar in Isokontur Isobologramme in dem kombinatorischen Konzentrationen mit ähnlichen Mengen an Wachstumshemmung Isokonturen verbinden. 6 Diese Plotten Strategie erlaubt die Visualisierung von kombinatorischen Dosis-Wirkungs-Kurven. Um unsere Methodik zu illustrieren, beschreiben wir unser Protokoll dieser Assays für die Durchführung und repräsentative Ergebnisse.

<table><tbody><tr><td>J774A.1 Zellen</td><td>American Type Culture Collection</td><td>TIB-67</td><td>Wirtszelle</td></tr><tr><td>ACES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9758&nbsp;</td><td>Zur Herstellung von gepuffertem Aktivkohle-Hefeextrakt-Agar und gepuffertem Hefe-Extrakt-Medium</td></tr><tr><td>Hefeextrakt, ultrafiltriert</td><td>Becton-Dickinson/Difco</td><td>210929</td><td>Zur Herstellung von gepuffertem Aktivkohle-Hefeextrakt-Agar und gepuffertem Hefeextrakt-Medium; niedrigere Qualitäten können das Wachstum beeinträchtigen und/oder die Empfindlichkeit von Legionellen gegenüber Wachstumshemmern verändern</td></tr><tr><td>Alpha-Ketoglutarsäure, Monokaliumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K2000</td><td>Zur Herstellung von gepuffertem Aktivkohle-Hefeextrakt-Agar und gepuffertem Hefe-Extrakt-Medium</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td>Zur Herstellung von gepuffertem Aktivkohle-Hefeextrakt-Agar und gepuffertem Hefeextraktmedium</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat, zweibasig</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td>Zur Herstellung von gepuffertem Aktivkohle-Hefeextrakt-Agar und gepuffertem Hefeextraktmedium</td></tr><tr><td>L-Cystein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7755</td><td>Zur Herstellung von gepuffertem Aktivkohle-Hefeextrakt-Agar und gepuffertem Hefeextraktmedium</td></tr><tr><td>Ammoniumeisen(III)-citrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5879</td><td>Zur Herstellung von gepuffertem Aktivkohle-Hefeextrakt-Agar und gepuffertem Hefe-Extrakt-Medium; Eisenpyrophosphat kann stattdessen verwendet werden, ist aber schwieriger genau abzuwiegen</td></tr><tr><td>Kaliumhydroxidlösung, konzentriert</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SP236-500</td><td>Zur Herstellung von gepuffertem Aktivkohle-Hefe-Extrakt-Agar und gepuffertem Hefe-Extraktmedium</td></tr><tr><td>Deonisiertes Wasser</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Zur Herstellung von gepuffertem Aktivkohle-Hefeextrakt-Agar und gepuffertem Hefe-Extrakt-Medium</td></tr><tr><td>Thymidin (Gewebekulturqualität)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1895</td><td>Zur Ergänzung von RPMI 1640 und gepuffertem Hefeextrakt Agar/Medium &mdash; Thymidin niedrigerer Qualität kann für letzteres verwendet werden, kann jedoch zu einem beeinträchtigten Zellwachstum und/oder Zelltod führen RPMI 1640</td></tr><tr><td>RPMI 1640, Standardformulierung</td><td>Corning über Thermo Fisher Scientific</td><td>10-040-CV</td><td>Für die Züchtung von J774A.1-Zellen vor der Beschichtung; enthält 2 mM L-Glutamin</td></tr><tr><td>RPMI 1640 ohne phenolrotes</td><td>Corning über Thermo Fisher Scientific</td><td>17-105-CV</td><td>Zum Plattieren von J774A.1-Zellen in 384-Well-Schalen (nicht geeignet für das Wachstum vor dem Plattieren); fehlt auch L-Glutamin &mdash; Ergänzung zu 2 mM vor Gebrauch</td></tr><tr><td>L-Glutamin, 200 mM in 0,85 % NaCl (Gewebekulturqualität)</td><td>HyClone über Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30034.02</td><td>Zur Ergänzung von RPMI 1640 ohne L-Glutamin, bis 2 mM Endkonzentration</td></tr><tr><td>Eisenhaltiges Kälberserum</td><td>Gemini Bioproducts</td><td>100-510</td><td>Zur Ergänzung von RPMI 1640, bis 9,1 % Endkonzentration</td></tr><tr><td>Trypanblau-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>Zur Färbung zur Bestimmung des Zelltods von J774A.1 beim Zählen der Zelldichte</td></tr><tr><td>SYTOX Green, 5 mM Lösung in DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7020</td><td>Zur Färbung zur Bestimmung des Zelltods von J774A.1 mittels Fluoreszenzmessung oder Epifluoreszenzmikroskopie (in Verbindung mit orange-rot oder dunkelrot fluoreszierenden Bakterien). Bei einer Endkonzentration von 125 nM verwenden.</td></tr><tr><td>Zellkultur-Inkubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-255-26</td><td>Für die Inkubation von J774A.1-Zellen (sowohl vor als auch nach der Infektion); kann auch für die Inkubation von Bakterien verwendet werden, oder es kann ein Inkubator mit Standardatmosphäre verwendet werden)</td></tr><tr><td>Orbitalschüttler</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-01010</td><td>Zum Schütteln der Inkubation von J774A.1-Zellen vor der Infektion; passt in den Zellkultur-Inkubator; inklusive Schüttelbasis 7744-01000 und Tablett 7740-01010 (diese sind auch separat erhältlich)</td></tr><tr><td>Schüttelkolben (250 ml)</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-2038-04</td><td>Zum Schütteln der Inkubation von J774A.1-Zellen vor der Infektion</td></tr><tr><td>Schüttelklemmen für Kolben (250 ml)</td><td>BellCo Glas</td><td>7744-16250</td><td>Zum Schütteln der Inkubation von J774A.1-Zellen vor der Infektion</td></tr><tr><td>Schüttelkolben (1.000 ml)</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-2038-07</td><td>Zum Schütteln der Inkubation von J774A.1-Zellen vor der Infektion</td></tr><tr><td>Schüttelklemmen für Kolben (1.000 ml)</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-16100</td><td>Zum Schütteln der Inkubation von J774A.1-Zellen vor der</td></tr><tr><td>Infektion Schwammschaumkappen für Kolben (250 ml-1.000 ml)</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-1490-038</td><td>Zum Schütteln der Inkubation von J774A.1-Zellen vor der Infektion; reduziert das Kontaminationsrisiko im Vergleich zu Standard-Metallkappen</td></tr><tr><td>MultiDrop Combi programmierbare Mehrkanal-Peristaltikpumpe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5840300</td><td>Zum Dispensieren von J774A.1-Zellen, Medium und bakterieller Suspension, die Fluorophore enthalten, an eine große Anzahl von 384-Well-Schalen</td></tr><tr><td>Kombi-Verteiler mit Standardbohrung</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24072670</td><td>Standardmäßiges Predispense-Volumen von 20 &#956; l ist nicht ausreichend, um das Absetzen zu kompensieren &mdash; Erhöhung auf 80 &#956; l</td></tr><tr><td>Weiße 384 Well-Schalen, behandelt für Gewebekulturen</td><td>Corning</td><td>3570</td><td>Zum Lesen von Lumineszenz und Fluoreszenz; Greiner Katalog # 781080 ebenfalls erfolgreich getestet</td></tr><tr><td>DMSO (Gewebekulturqualität, in verschlossenen Ampullen)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Zum Auflösen von Positivkontroll- und Testverbindungen</td></tr><tr><td>Azithromycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1088</td><td>Antibiotika-Positivkontrolle</td></tr><tr><td>Saponin (aus Quillaja-Rinde)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-4521</td><td>Zytotoxizitäts-Positivkontrolle</td></tr><tr><td>Mehrkanalpipette</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Finnpipette</td><td>Für den Transfer von festen Mengen positiver Kontrollverbindungen; Pipettierer muss über eine digitale Dispensierung mit Arretierung verfügen, um eine wiederholte Dosierung mit festem Volumen zu ermöglichen</td></tr><tr><td>Epson Pin-Transferroboter</td><td>Epson/ICCB-L</td> <td>(kundenspezifische Ausrüstung)</td><td>Für den Transfer von festen Mengen von Testverbindungen aus Bibliotheksarrays</td></tr><tr><td>D300 digitales Dispensiersystem</td><td>Hewlett-Packard über Tecan</td><td>D300</td><td>Für den Transfer variabler Mengen von Testverbindungen von 11 Pikolitern bis 10 & Mikro; l</td></tr><tr><td>T8+ Kartuschen für das digitale Dosiersystem D300</td><td>Hewlett-Packard über Tecan</td><td>T8+</td> <td>Für die Abgabe von Testverbindungen</td></tr><tr><td>Epifluoreszenzmikroskop mit computergebundener Digitalkamera</td><td>Nikon</td><td>Ti</td><td>Für die Bildgebung lebender Zellen; jedes Standard-Fluoreszenzmikroskop kann mit Phasenkontrast- oder DIC-Optiken, die grüne (Fluorescein), orangerote bis rote (Texas Red) und dunkelrote (Cy5) Fluoreszenz mit 100-fachem Öl abbilden können, ersetzen Objektiv für höchste Auflösung</td></tr><tr><td>Gewebekulturschalen mit Glasboden</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>Für die Bildgebung lebender Zellen. Schüsseln wie die MatTek ermöglichen eine mikroskopische Visualisierung bei 600-facher oder 1.000-facher Vergrößerung durch den Einsatz eines inversen Epifluoreszenz- oder Konfokalmikroskops. Diese speziellen Schalen haben einen Nenndurchmesser von 3,5 cm, einen Innendurchmesser von 3,3 cm, mit Abdeckgläsern mit einem Durchmesser von 20 mm Durchmesser #1,5, die in die Böden eingesetzt sind.</td></tr><tr><td>Photoshop CS6</td>, <td>Adobe</td><td></td><td>, Adobe Photoshop oder ähnliche Programme können verwendet werden, um Lichtmikroskopische und fluoreszierende Bilder zu pseudofärben und zusammenzuführen.</td></tr><tr><td>Mathematica 10</td><td>Wolfam</td><td></td><td>Zur Erzeugung von zweidimensionalen isokonturalen Isobologrammen und dreidimensionalen Oberflächenisobologrammen.</td></tr></tbody></table>

hoher durchsatz, echtzeit, doppel-ausleseprüfung intrazellulärer antimikrobieller aktivität und eukaryotischen zelle zytotoxizität

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditionelle Maßnahmen der intrazellulären antimikrobielle Aktivität und eukaryotische Zelle Zytotoxizität vertrauen auf Endpunkt-Assays. Solche Endpunktassays erfordern mehrere zusätzliche experimentelle Schritte vor, wie Zelllyse auszulesen, koloniebildende Einheit Bestimmung oder Reagenzzugabe. Wenn Tausende von Assays, beispielsweise während des Hochdurchsatz-Screening durchgeführt wird, die stromabwärts Aufwand für diese Arten von Assays erforderlich ist, ist beträchtlich. Daher Hochdurchsatz antimikrobielle Entdeckung zu erleichtern, haben wir ein Echtzeit-Test, um gleichzeitig Inhibitoren der intrazellulären Bakterienwachstums identifizieren und eukaryotischen Zell-Cytotoxizität zu bewerten. Insbesondere wurde das Bakterienwachstum intrazellulärem Echtzeit - Detektion von Markierungs bakterielle Screening Stämme aktiviert entweder mit einem bakteriellen lux - Operon (1. Generation assay) oder fluoreszierendes Protein Reporter (2 nd Generation, orthogonal assay). Eine nicht-toxische, Zellmembran-impermeante, nukleinsäurebindende Farbstoffwurde auch während der anfänglichen Infektion von Makrophagen aufgenommen. Diese Farbstoffe werden aus lebenden Zellen ausgeschlossen. Allerdings nicht lebensfähigen Wirtszellen verlieren die Integrität der Membran erlauben Eintritt und Fluoreszenzmarkierung von Kern-DNA (Desoxyribonukleinsäure). Bemerkenswerterweise ist DNA-Bindung mit einer starken Zunahme der Fluoreszenzquantenausbeute verbunden, die eine lösungsbasierte Auslesen der Wirtszelle Tod liefert. Wir haben dieses kombinierten Assay verwendet ein Hochdurchsatz-Bildschirm in Mikroplattenformat durchzuführen, und die intrazelluläre Wachstum und die Zytotoxizität durch Mikroskopie zu bewerten. Bemerkenswerterweise zeigen können antimikrobielle Mittel Synergie in denen die kombinierte Wirkung von zwei oder mehreren antimikrobiellen Mitteln, wenn sie zusammen angewendet ist größer als bei getrennter Anwendung. Die Prüfung auf in vitro Synergie gegen intrazelluläre Erreger ist in der Regel eine ungeheure Aufgabe als kombinatorische Permutationen von Antibiotika in verschiedenen Konzentrationen zu beurteilen ist. Allerdings fanden wir, dass unsere Echtzeit-Test kombiniert mit automatisierten, digitalen Dosiertechnik pfacile Synergie Test ermitted. Mit diesen Ansätzen konnten wir systematisch Wirkung einer großen Anzahl von antimikrobiellen Mitteln vermessen allein und in Kombination gegen das intrazelluläre Pathogen Legionella pneumophila.

Intrazellulärer Wachstumsassay in Mikrotiterplatten
Abbildung 1 veranschaulicht die Assayschritte. Die dargestellten automatisierten Schritte können manuell durchgeführt werden. Der Durchsatz wird jedoch erheblich durch die Verwendung von Flüssigkeitsmanagementsystemen erleichtert.
Abbildung 2 zeigt repräsentative Ergebnisse aus einem ...

Es wurde ein Echtzeit-Assay mit hohem Durchsatz entwickelt, um gleichzeitig (1) eukaryotische zellpenetrierende antimikrobielle Wirkstoffe zu identifizieren, die auf einen intrazellulären bakteriellen Krankheitserreger abzielen, und (2) die Zytotoxizität eukaryotischer Zellen zu bewerten. Eine Variation der gleichen Technologie wurde anschließend mit digitaler Dosiertechnologie kombiniert, um einfache, hochauflösende Dosis-Wirkungs-Studien sowie zwei- und dreidimensionale Synergiestudien zu ermöglichen.

Hoher Durchsatz, Echtzeit, Doppel-Ausleseprüfung intrazellulärer antimikrobieller Aktivität und eukaryotischen Zelle Zytotoxizität

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, mithilfe eines einzigen kombinatorischen Echtzeit-Assays spezifische kleine Molekül-Inhibitoren des intrazellulären Bakterienwachstums zu identifizieren, die für Wirtszellen nicht toxisch sind. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der antimikrobiellen Wirkstoffentdeckung zu beantworten. Insbesondere welche Arten von Verbindungen in der Lage sind, in intrazelluläre Kompartimente einzudringen und Krankheitserreger abzutöten, ohne die Wirtszelle zu schädigen?Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass bakterielles Wachstum und toxische Wirkungen auf Säugerzellen gleichzeitig mithilfe nicht-destruktiver, echtzeitfähiger Tests nachgewiesen werden. In der Regel haben Personen, die mit dieser Methode neu beginnen, Schwierigkeiten mit der Skalierbarkeit, die sie bietet. Die Analyse von mehr als zehntausend Verbindungen in einer Sitzung erfordert eine völlig neue Reihe von Techniken und Geräten. Neben Lucius zeigen die Postdoktoranden KP Smith, Yoon-Suk Kang, Jennifer Tsang, Thea Brennan-Krohn sowie die Bachelor-Studentin Kat Truelson ein gemeinschaftliches Engagement für die akademische Entdeckung von Antimikrobiellen Wirkstoffen und die translationale diagnostische Mikrobiologie. Zum Vorbereiten der Wirtszellen kultivieren Sie J774A.1-Makrophagen in Suspension in RPMI 1640 mit neun Prozent eisensupplementiertem Kälberserum.Erstmalige Passage der Zellen in Zellkulturgefäßen. Nachdem die Zellen in einem 75 cm²-Zellkulturgefäß bei 15 mL Medium konfluent geworden sind, die Zellen durch Abkratzen aufspalten und mit dem gleichen Medium auf 65 mL verdünnen. Geben Sie 15 mL zurück in das Zellkulturgefäß und überführen Sie 50 mL in ein 250 mL-Bakterien-Schüttelgefäß.Begasen Sie, indem Sie die Rotationsgeschwindigkeit auf etwa 120 Umdrehungen pro Minute einstellen. Inkubieren Sie zur konsistenten Zellvermehrung exakt bei fünf Prozent Kohlendioxid und 37 Grad Celsius. Ernten Sie die Zellen, wenn sie eine Dichte im Bereich von zweieinhalb Millionen Zellen pro Milliliter bis fünf Millionen Zellen pro Milliliter erreicht haben.Stellen Sie sicher, dass der Anteil an toten Zellen 25 Prozent nicht übersteigt, da tote Zellen das Hintergrundrauschen in Zytotoxizitätsassays erhöhen. Es ist entscheidend, das Absinken von Zellen in den Reservoirs zu verhindern, wenn Sie große Volumina von Makrophagen und Bakterien mit Flüssigkeitsmanagern dosieren. Rühren Sie die Reservoirs alle paar Minuten vorsichtig durch, um Inhomogenitäten und Ungleichmäßigkeit in den Assay-Plattenmulden zu vermeiden.Pflanzen Sie die Zellen in weißen, für Zellkultur behandelten Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen mit jeweils 50.000 Zellen in 30 µL Zellkulturmedium pro Vertiefung aus. Inkubieren Sie die Mikrotiterplatten über Nacht, um am Tag des Experiments eine Konfluenz von neunzig Prozent zu erreichen. Bereiten Sie Bakterieninseln für die Experimente vor, indem Sie die Organismen dicht auf einer neuen BCYE-Platte ausstreichen und einen Tag lang inkubieren, um konfluentes Wachstum zu erhalten.Suspendieren Sie die Organismen erneut in dem gleichen Zellkulturmedium, das für die J774A.1-Zellen verwendet wird. Um die Makrophageninfektion durchzuführen, geben Sie die gewünschten Testverbindungen hinzu, einschließlich Screening-Substanzen sowie positiver und negativer Kontrollen zur Hemmung des bakteriellen Wachstums in der lysierten eukaryotischen Zelle.Die Stammlösungen sollten in DMSO oder einer wässrigen Lösung mit mindestens 500facher Konzentration gelöst werden, um eine ausreichende Verdünnung des Lösungsmittels zu ermöglichen. Verdünnen Sie lumineszierende Bakterien auf ein Ziel von zweieinhalb Millionen KBE pro Milliliter in Zellkulturmedium. Fügen Sie dann einen geeigneten, nicht toxischen, membranimpermeablen Nukleinsäure-Färbefarbstoff in einer endgültigen Assay-Konzentration von zweieinhalbmal hinzu.Fügen Sie 20 Mikroliter dieser Mischung zu jedem Kulturbrunnen hinzu. Das endgültige Testvolumen beträgt 50 Mikroliter und die endgültige Bakterienkonzentration sollte eine Million CFU pro Milliliter für den lux-epron-Reporter oder vier Millionen CFU pro Milliliter für den fluoreszierenden Protein-Reporter betragen. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für ein bis drei Tage in fünf Prozent Kohlendioxid bei 100 Prozent relativer Luftfeuchtigkeit, um verdunstungsbedingte Randeffekte zu vermeiden.Um temperaturbedingte Randeffekte beim Auslesen von Assayergebnissen zu vermeiden, sollten Mikroplatten vor dem Lumineszenzlesen durch Einlegen in einer einfachen Schicht auf dem Labortisch mit angelehnten Deckeln für etwa 20 Minuten thermisch äquilibratisiert werden. Lesen Sie das bakterielle Wachstum und die Toxizität eukaryotischer Zellen mit einem Mikroplatten-Luminometer und Fluorometer, je nach den verwendeten Reportern. Falls eine Echtzeitauslesung zu späteren Zeitpunkten gewünscht ist, bringen Sie die Mikroplatten zurück in den Inkubator.Analysieren Sie die Daten wie im Textprotokoll beschrieben. Für Dosis-Wirkungs- und Synergietestexperimente bereiten Sie Makrophagen in Bakterien wie zuvor vor. Unmittelbar vor der Makrophageninfektion oder der axenischen Inkubation verwenden Sie ein automatisiertes Flüssigkeitsmanagementsystem, um die Einzeldosis-Wirkung in der kombinatorischen Synergietestanordnung durch direkte automatisierte Zugabe von Antimikrobiellverdünnungen gemäß Herstellervorschrift zu ermöglichen.Fügen Sie Antimikrobielle mit experimentellem Interesse in einer seriellen Verdünnungsreihe mit Verdoppelungsschritten hinzu. Ziel ist es, eine Konzentrationsspanne zu erreichen, die an der oberen Grenze das Wachstum vollständig unterdrückt und an der unteren Grenze keine offensichtliche Wirkung zeigt. Dargestellt sind hier repräsentative Ergebnisse im Zeitverlauf für bakterielle Lumineszenz und mit Zytotoxizität assoziiierte Fluoreszenz.Beachten Sie die gegensätzlichen Wirkungen der antimikrobiellen Behandlung und des zytotoxischen Detergens für eukaryotische Zellen. Die gleichzeitige Bestimmung der Dosis-Wirkungs-Kurven für IC50 und CC50 in denselben Testansätzen wurde verwendet, um die Selektivität von Doxycyclin als Antibiotikum zu ermitteln. Die bakterielle Vermehrung wurde durch mittlere Konzentrationen des Antibiotikums gehemmt.Jedoch wurde bei hohen Konzentrationen eine Zytotoxizität beobachtet, was mit einer Selektivität von etwa 100 übereinstimmt. Derselbe Testaufbau wurde verwendet, um die zweidimensionale Dosis-Wirkungsbeziehung für Kombinationen von Minocyclin und Azithromycin zu untersuchen. Isocontouren verbinden Punkte gleicher intrazellulärer Wachstumshemmung.Hier deuteten konkave Isoflächen auf starke synergistische Effekte der beiden Wirkstoffe hin. Digitale Dosierrobotik für die Assay-Präparation, Echtzeit-Auslesung und das Hochdurchsatzformat ermöglichten die Testung kombinatorischer dreifacher Synergien. Hier legt die Beobachtung einer deutlich konkaven Oberfläche einen hohen Grad synergistischer Wirkung von Kombinationen aus Minocyclin, Azithromycin und Rifampicin gegen das intrazelluläre Wachstum von Legionella pneumophila nahe.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man entweder fluoreszierende oder lumineszierende Assayauslesungen mit Echtzeit-Testverfahren zur Zytotoxizität im Hochdurchsatzformat kombiniert. Nach diesem Verfahren können auch andere Methoden wie die konfokale Mikroskopie angewendet werden, um Fragen zu biologischen Vorgängen in der gesamten Zelle zu beantworten, die ebenfalls im Zusammenhang mit ihrer antimikrobiellen Wirkung oder Gesamtzellzytotoxizität stehen. Obwohl wir die Auswirkungen auf die Vermehrung von Legionellen untersucht haben, können dieselben Techniken auch auf andere intrazelluläre Pathogene wie Brucella und Mikrobakterien angewendet werden.Wir entwickelten dieses Protokoll ursprünglich, um einen einfachen und zuverlässigen Assay zu finden, der für ein Format mit sehr hohem Durchsatz geeignet ist. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit bakteriellen Krankheitserregern, Zelllinien und Roboterausrüstung gewisse inhärente Risiken birgt und entsprechende Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, beispielsweise die Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung während der Durchführung dieses Verfahrens.

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Research

Forschung

JoVE Journal

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Immunologie und Infektion

Wir beschreiben ein Single-Cell-Assay mit hohem Durchsatz, die Zytotoxizität von T-Zellen zu messen, wenn mit Tumor Zielzellen inkubiert. Dieses Verfahren verwendet eine dichte, elastomeren Anordnung von Sub-Nanoliter-Wells (~ 100.000 Wells / Array) räumlich zu begrenzen, die T-Zellen und Zielzellen in definierten Verhältnissen und mit Fluoreszenzmikroskopie gekoppelt Effektor-Target Konjugation und anschließender Apoptose überwachen.

Quantitative High-throughput Single-cell Zytotoxizitätstest für T-Zellen

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Hoher Durchsatz, Echtzeit, Doppel-Ausleseprüfung intrazellulärer antimikrobieller Aktivität und eukaryotischen Zelle Zytotoxizität (Video) | JoVE Journal

Hoher Durchsatz, Echtzeit, Doppel-Ausleseprüfung intrazellulärer antimikrobieller Aktivität und eukaryotischen Zelle Zytotoxizität

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