Eine Affinitätschromatographietechnik zur Reinigung eines rekombinanten bakteriellen Proteins

Nehmen wir eine Suspension von Bakterienzellen, die ein polyhistidin-markiertes Zielprotein exprimieren.

Sonikate auf Eis, um den Proteinabbau zu minimieren. Hochfrequente Schallwellen lysieren die Zellen und setzen intrazelluläre Inhalte, einschließlich des Zielproteins, frei.

Zentrifugieren Sie, um Ablagerungen zu trennen und die überlagerstoffhaltigen Proteine in eine Spritze zu übertragen.

Filtern Sie das Überlagerungsmittel, um Aggregate zu entfernen und eine Verstopfung der Chromatographiesäule zu verhindern.

Nehmen Sie eine nickelbasierte Affinitätschromatographiesäule und gleichen sie aus, um eine optimale Proteinreinigung zu gewährleisten.

Laden Sie das Filtrat auf die Säule. Das Polyhistidin-Tag bindet an Nickelionen im Säulenharz und immobilisiert die Zielproteine.

Waschen Sie die Säule mit einem Puffer, um ungebundene Proteine zu entfernen, und überwachen Sie die UV-Absorption des Eluats, um die Entfernung von Nicht-Zielproteinen zu bestätigen.

Fügen Sie einen Elutionspuffer hinzu, der Imidazol enthält, das mit dem Polyhistidin-Tag um die Nickelbindung konkurriert und die Proteine freisetzt.

Ein zweiter Anstieg der UV-Absorption bestätigt die Eluation des Zielproteins, das für