Eine Affinitätschromatographietechnik zur Reinigung eines rekombinanten bakteriellen Proteins
JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologie
0 Ansichten • 2:54 Min. • November 28th, 2025
Nehmen wir eine Suspension von Bakterienzellen, die ein polyhistidin-markiertes Zielprotein exprimieren.
Sonikate auf Eis, um den Proteinabbau zu minimieren. Hochfrequente Schallwellen lysieren die Zellen und setzen intrazelluläre Inhalte, einschließlich des Zielproteins, frei.
Zentrifugieren Sie, um Ablagerungen zu trennen und die überlagerstoffhaltigen Proteine in eine Spritze zu übertragen.
Filtern Sie das Überlagerungsmittel, um Aggregate zu entfernen und eine Verstopfung der Chromatographiesäule zu verhindern.
Nehmen Sie eine nickelbasierte Affinitätschromatographiesäule und gleichen sie aus, um eine optimale Proteinreinigung zu gewährleisten.
Laden Sie das Filtrat auf die Säule. Das Polyhistidin-Tag bindet an Nickelionen im Säulenharz und immobilisiert die Zielproteine.
Waschen Sie die Säule mit einem Puffer, um ungebundene Proteine zu entfernen, und überwachen Sie die UV-Absorption des Eluats, um die Entfernung von Nicht-Zielproteinen zu bestätigen.
Fügen Sie einen Elutionspuffer hinzu, der Imidazol enthält, das mit dem Polyhistidin-Tag um die Nickelbindung konkurriert und die Proteine freisetzt.
Ein zweiter Anstieg der UV-Absorption bestätigt die Eluation des Zielproteins, das für den späteren Einsatz bereit ist.
Sonikieren Sie die Zellen auf Eis mit fünf Zyklen eines 15-sekündigen Pulses und einer 30-sekündigen Pause.
Nach der Zentrifugierung des Zelllysats bei 21.000 g und vier Grad Celsius für 15 Minuten filtern Sie das Überlagerungsmittel mit einem sterilen Spritzenfiltersystem. Verwenden Sie ein automatisiertes Reinigungssystem, das mit einer fünf-milliliter-nickelbasierten Affinitätssäule ausgestattet ist, um den HIS-markierten RTA-Anteil aus dem sterilen gefilterten E.coli-Supernatant zu reinigen. Im Allgemeinen verwenden Sie eine Elutionsgeschwindigkeit von einem Milliliter pro Minute und kühlen Sie das gesamte Reinigungssystem, um eine ineffiziente Toxinbindung und den Verlust der Toxinaktivität zu verhindern.
Gleiche die Affinitätsspalte kurz mit 20 Millilitern Bindungspuffer aus, um den Speicherpuffer zu entfernen. Anschließend wird das sterile, gefilterte Supernatant mit einer Spritze auf die Affinitätssäule aufgetragen. Waschen Sie die Säule mit 25 bis 35 Millilitern Bindungspuffer, um die ungebundenen Proteine aus der Säule zu entfernen.
Führen Sie den Waschschritt durch, bis die UV-Absorption bei 280 Nanometern nahe dem ursprünglichen UV-Wert liegt. Anschließend elutieren Sie den gebundenen RTA-Anteil mit 20 bis 35 Millilitern Elutionspuffer und lassen Sie die Probe auf Eis. Es ist wichtig, die RTA-Fraktionsprobennahme kurz nach Steigung des UV-280-Werts zu beginnen und die RTA-Fraktionsprobennahme zu beenden, wenn sie wieder den ursprünglichen Ausgangswert erreicht.
Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode zur Reinigung von Polyhistidin-markierten Proteinen aus bakteriellen Zellen beschrieben. Das Verfahren umfasst Ultraschallbehandlung, Zentrifugation und Nickelaffinitätschromatographie, um das Zielprotein effizient zu isolieren.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Proteinaufreinigung
- Biochemie
- Zellbiologie
Hintergrund
- Polyhistidin-Tags werden häufig für die Proteinreinigung verwendet.
- Mittels Affinitätschromatographie lässt sich eine selektive Isolierung von Proteinen durchführen.
- Sonorisation ist eine Technik, die zur Lyse von Zellen und Freisetzung von Proteinen eingesetzt wird.
- Die Überwachung der UV-Absorption hilft, den Reinigungsprozess zu bestätigen.
Zweck der Studie
- Eine effiziente Methode zur Reinigung von HIS-markierten Proteinen demonstrieren.
- Eine detaillierte Anleitung für Forscher in der Proteinbiochemie bereitstellen.
- Die Bedeutung der Aufrechterhaltung der Proteintätigkeit während der Reinigung hervorheben.
Verwendete Methoden
- Sonorisation von Bakterienzellen, um diese zu lysieren und Proteine freizusetzen.
- Zentrifugation zur Trennung zellulärer Bestandteile vom Überstand.
- Filtration des Überstands, um Aggregate zu entfernen.
- Affinitätschromatographie an Nickel zur Proteinreinigung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung von Polyhistidin-markierten Proteinen.
- Bestätigung der Proteinelution durch Überwachung der UV-Absorption.
- Effiziente Entfernung ungebundener Proteine während des Waschschritts.
- Erhaltung der Proteinaktivität während des gesamten Reinigungsprozesses.
Schlussfolgerungen
- Die beschriebene Methode eignet sich zur Reinigung von HIS-markierten Proteinen.
- Die Aufrechterhaltung niedriger Temperaturen während der Reinigung ist entscheidend.
- Die UV-Absorption ist eine zuverlässige Methode zur Überwachung der Proteinreinigung.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Affinitätschromatographie unter Verwendung von Nickel-basierten Harzen ermöglicht die schnelle, selektive Reinigung rekombinanter Proteine und unterstützt die Validierung von Zielstrukturen in frühen Entwicklungsstadien sowie die Assay-Entwicklung in der biopharmazeutischen Forschung und Entwicklung&D. Die zuverlässige Isolierung von Polyhistidin-markierten Proteinen gewährleistet eine konsistente Reagenzqualität für nachgeschaltete Screening- und mechanistische Untersuchungen. Dieser Arbeitsablauf bildet die Grundlage für Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit in Forschungs- und präklinischen Entwicklungsprozessen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung&D
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Herstellung hochreiner rekombinanter Proteine für die funktionelle Charakterisierung und Zielvalidierung.
- Unterstützt die mechanistische Ent风险bewertung, indem konsistente Proteinreagenzien für die Untersuchung von Signalwegen bereitgestellt werden.
- Erhöht die Vorhersagegenauigkeit in biologischen Assays der frühen Entwicklungsphase, indem störende Einflüsse durch Kontaminationen minimiert werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert standardisierte Proteinpräparationen für die Kalibrierung von Assays und Screening-Workflows mit Wirkstoffen.
- Gewährleistet Reproduzierbarkeit und quantitative Konsistenz durch UV-überwachte Reinigung und kontrollierte Elution.
- Stellt validierte Protein-Eingaben für skalierbare, plattformbasierte Screening-Kampagnen bereit.
Translationale und präklinische Forschung
- Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung bis zu präklinischen Studien, indem funktional intakte Proteine für in-vitro- und in-vivo-Modelle bereitgestellt werden.
- Verringert das Risiko biologischer Variabilität in translationalen Biomarker- oder Wirkmechanismus-Studien.
- Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem Qualität und Aktivität der Proteine sichergestellt bleiben.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Affinitätsreinigungsmethode befindet sich an der Schnittstelle zwischen früher Entdeckung und Assay-Entwicklung und ermöglicht einen nahtlosen Übergang zur präklinischen Forschung, wenn rekombinante Proteinreagenzien benötigt werden.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt Hypothesentests und Pfadanalysen durch die Bereitstellung gereinigter, aktiver Proteine.
- Screening: Stellt reproduzierbare, quantitative Proteinmengen für die Assay-Entwicklung und die Evaluierung von Verbindungen bereit.
- Analytik: Nutzt die UV-Absorptionsmessung zur Echtzeiteinschätzung von Proteinreinheit und -ausbeute.
- Translationale Forschung: Erhält die Integrität der Proteine für nachgeschaltete, krankheitsrelevante Modelluntersuchungen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert einen standardisierten, skalierbaren Workflow zur Reinigung rekombinanter Proteine über verschiedene Programme hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten in frühen R&D.
- Operativer Wert: Verbessert die Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Durchsatzleistung der Proteinreinigung.
- Strategischer Wert: Verbessert die Qualität von Go/No-Go-Entscheidungen und die Kapitaleffizienz, indem die Konsistenz der Reagenzien sichergestellt wird.
- Portfolio-Impact: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Entdeckungs- und präklinischen Assets.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Proteinausprägung, Zelllyse und chromatographischen Reinigung.
- Benötigt Zugang zu automatisierten Reinigungssystemen und Infrastruktur zur Überwachung der UV-Absorption.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams hinsichtlich Pufferbedingungen und Elutionsprotokollen.
- Anpassbar an verschiedene rekombinante Proteine mit Polyhistidin-Tags.
- Die Temperaturkontrolle ist entscheidend, um die Proteinaktivität zu erhalten und Verluste während der Reinigung zu vermeiden.
Biopharma-Häufige Fragen
Labormaßstab Herstellung und Reinigung eines therapeutischen Antikörpers
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Quantifizierung der Metallauslaugung in der immobilisierten Metallaffinitätschromatographie
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Affinitätsreinigung eines 6X-His-markierten Proteins mit einem schnellen Protein-Flüssigchromatographie-System
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Orthogonal Protein Purification von einer kleinen Bispezifische Affinity Tag Facilitated
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
High-throughput Reinigung von Affinity-markierter rekombinanter Proteine
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Proteinreinigung auf Basis der Anionenaustauschchromatographie: Eine Trenntechnik zur Isolierung eines Proteins von Interesse aus dialysiertem bakteriellem Lysat auf der Grundlage der Nettoladung
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Proteinreinigung auf Basis der Nickel-Affinitätschromatographie: Eine Technik zur Aufreinigung von Polyhistidin-markierten rekombinanten Proteinen aus bakteriellem Zelllysat
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
DFE-basierte Affinitätschromatographie: Eine Technik zur Aufreinigung von monoklonalen 2F5-Antikörpern aus einer Rohprobe unter Verwendung von Elutionsbedingungen mit hoher Ionenstärke
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Eine Affinitätschromatographie-Technik zur Aufreinigung von monoklonalen Antikörpern
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Isolation und Charakterisierung von chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026