Eine Affinitätschromatographietechnik zur Reinigung eines rekombinanten bakteriellen Proteins

Nehmen wir eine Suspension von Bakterienzellen, die ein polyhistidin-markiertes Zielprotein exprimieren.

Sonikate auf Eis, um den Proteinabbau zu minimieren. Hochfrequente Schallwellen lysieren die Zellen und setzen intrazelluläre Inhalte, einschließlich des Zielproteins, frei.

Zentrifugieren Sie, um Ablagerungen zu trennen und die überlagerstoffhaltigen Proteine in eine Spritze zu übertragen.

Filtern Sie das Überlagerungsmittel, um Aggregate zu entfernen und eine Verstopfung der Chromatographiesäule zu verhindern.

Nehmen Sie eine nickelbasierte Affinitätschromatographiesäule und gleichen sie aus, um eine optimale Proteinreinigung zu gewährleisten.

Laden Sie das Filtrat auf die Säule. Das Polyhistidin-Tag bindet an Nickelionen im Säulenharz und immobilisiert die Zielproteine.

Waschen Sie die Säule mit einem Puffer, um ungebundene Proteine zu entfernen, und überwachen Sie die UV-Absorption des Eluats, um die Entfernung von Nicht-Zielproteinen zu bestätigen.

Fügen Sie einen Elutionspuffer hinzu, der Imidazol enthält, das mit dem Polyhistidin-Tag um die Nickelbindung konkurriert und die Proteine freisetzt.

Ein zweiter Anstieg der UV-Absorption bestätigt die Eluation des Zielproteins, das für den späteren Einsatz bereit ist.

Sonikieren Sie die Zellen auf Eis mit fünf Zyklen eines 15-sekündigen Pulses und einer 30-sekündigen Pause.

Nach der Zentrifugierung des Zelllysats bei 21.000 g und vier Grad Celsius für 15 Minuten filtern Sie das Überlagerungsmittel mit einem sterilen Spritzenfiltersystem. Verwenden Sie ein automatisiertes Reinigungssystem, das mit einer fünf-milliliter-nickelbasierten Affinitätssäule ausgestattet ist, um den HIS-markierten RTA-Anteil aus dem sterilen gefilterten E.coli-Supernatant zu reinigen. Im Allgemeinen verwenden Sie eine Elutionsgeschwindigkeit von einem Milliliter pro Minute und kühlen Sie das gesamte Reinigungssystem, um eine ineffiziente Toxinbindung und den Verlust der Toxinaktivität zu verhindern.

Gleiche die Affinitätsspalte kurz mit 20 Millilitern Bindungspuffer aus, um den Speicherpuffer zu entfernen. Anschließend wird das sterile, gefilterte Supernatant mit einer Spritze auf die Affinitätssäule aufgetragen. Waschen Sie die Säule mit 25 bis 35 Millilitern Bindungspuffer, um die ungebundenen Proteine aus der Säule zu entfernen.

Führen Sie den Waschschritt durch, bis die UV-Absorption bei 280 Nanometern nahe dem ursprünglichen UV-Wert liegt. Anschließend elutieren Sie den gebundenen RTA-Anteil mit 20 bis 35 Millilitern Elutionspuffer und lassen Sie die Probe auf Eis. Es ist wichtig, die RTA-Fraktionsprobennahme kurz nach Steigung des UV-280-Werts zu beginnen und die RTA-Fraktionsprobennahme zu beenden, wenn sie wieder den ursprünglichen Ausgangswert erreicht.