Proteinreinigung auf Basis der Nickel-Affinitätschromatographie: Eine Technik zur Aufreinigung von Polyhistidin-markierten rekombinanten Proteinen aus bakteriellem Zelllysat

Um rekombinantes Protein, das mit Poly-Histidin-Tag - einer Kette von Histidinresten an einem Endpunkt - aus einem bakteriellen Zelllysat fusioniert ist, verdünnen Sie zunächst das Zelllysat, um ein Verstopfen der Säule während des chromatographischen Laufs zu verhindern.

Montieren Sie eine Affinitätssäule mit zweiwertigen Nickelkationen, die mit Nitrilotriacetinsäure, einem Chelatbildner, auf einer Agaroseperlenmatrix immobilisiert sind. Nitrilotriaessigsäure bindet Nickelkationen über vier kovalente Koordinatenstellen, während zwei Stellen am Metallion für Wechselwirkungen mit Poly-Histidin-Tags im interessierenden Protein verfügbar bleiben.

Äquilibrieren Sie die Säule mit geeignetem Puffer, um die Bedingungen für effektive Metall-Protein-Wechselwirkungen zu optimieren. Laden Sie das Zelllysat auf die Säule.

Rekombinante Proteine, die zugängliche terminale Histidinreste tragen, bilden aufgrund der hohen Affinität des Metallions zu Imidazol, der Seitenkette von Histidin, Koordinationsbindungen mit Nickelkationen und binden an die Matrix. Die hohe Anzahl aufeinanderfolgender Histidine im rekombinanten Protein stärkt dessen Bindung an die Matrix.

Im Vergleich dazu haften Proteine ohne Histidinreste nicht an der Säule und eluieren im Durchfluss. Waschen Sie die Säule mit niedrig konzentriertem Imidazolpuffer.

Imidazol konkurriert mit schwach gebundenen Proteinkontaminanten, die möglicherweise unspezifisch über Histidinreste in ihrer Polypeptidkette an der Matrix haften, diese verdrängen und die Elution erleichtern. Waschen Sie die Säule mit hochkonzentriertem Imidazolpuffer, um die stark gebundenen Histidin-markierten rekombinanten Proteine vom Nickelionenchelat zu dissoziieren und sie im Durchfluss zu eluieren.

Sammeln Sie die gereinigte rekombinante Proteinfraktion für die weitere Analyse.

Beginnen Sie dieses Protokoll mit einer induzierbaren Überexpression eines Histidin-markierten Proteins, wie im Textprotokoll beschrieben. Bereiten Sie 1 Milliliter Nickel-Nitriloessigsäure-Harz in einer Schwerkraftsäule vor, um das Protein zu reinigen. Am Tag vor der Anwendung die Säule über Nacht bei 4 Grad Celsius mit 2 Millilitern Äquilibrierungspuffer äquilibrieren.

Bringen Sie die Säule am nächsten Tag von 4 Grad Celsius auf Raumtemperatur, bevor Sie das geklärte Lysat laden, und lassen Sie sie etwa zwei bis drei Stunden stehen. Suspendieren Sie dann das Pellet wieder im Lysepuffer

Beschallen Sie die Zellen auf Eis in 10-mal-10-Sekunden-Intervallen und pausieren Sie zwischen den Impulsen 30 Sekunden. Das Lysat wird durch Zentrifugation bei 3080 x g für 30 Minuten bei 4 Grad Celsius mit einer Mikrozentrifuge geklärt.

Bereiten Sie das geklärte Lysat mit gleichen Volumina Lysepuffer vor, tragen Sie dann das vorbereitete geklärte Lysat auf die Säule auf und sammeln Sie den Durchfluss. Tragen Sie den geklärten Lysatdurchfluss erneut auf die Säule auf und sammeln Sie den sekundären Durchfluss.

Waschen Sie dann die Säule mit 5 Millilitern Waschpuffer #1 und fangen Sie den Durchfluss auf. Waschen Sie die Säule erneut mit 5 Millilitern Waschpuffer #2 und fangen Sie den Durchfluss auf. Tragen Sie nun 2 Milliliter Elutionspuffer auf. Den Durchfluss in zwei Fraktionen zu je 1 Milliliter auffangen.