Name: Mikrofluidik-Vorrichtung für die Neuerstellung eines Tumor-Mikroumgebung In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 18 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung einer mikrofluidischen Vorrichtung zur Rekonstruktion von Tumor-Mikroumgebungen in vitro. Diese Methode ermöglicht präzise Tests von Chemotherapeutika in dreidimensionalen Geweben.

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Diese Arbeit wurde durch die National Institutes of Health Grant # 1R01CA120825-01A1, die Collaborative Biomedical Research (CBR) Program an der University of Massachusetts Amherst und der Isenberg Stipendium für Bhushan J. Toley unterstützt. Wir danken den wertvollen Beitrag von James Schafer, der Videofilmer, Erzähler und Herausgeber dieses Videos.

Ein. Vorrichtung Fabrication Replikation von mikrofluidischen Merkmale in Elastomermaterialien wurde für das Verfahren von Duffy et al beschrieben ist. 1 <ol><li> Mix Elastomer (Polydimethylsiloxan; PDMS) und Härter aus der Silikon-Elastomer Kit (Dow Corning, Midland, MI) in einem 9:1 Gewichtsverhältnis und übergießen Sie den Master mit einem 4 mm dicken Schicht bilden. Entgasen zur Entfernung von Luftblasen und aushärten der Mischung bei 60 ° C für 5 Stunden. Peel gehärteten PDMS aus der Form, um einen Stempel Strömungsrichtung Merkmale auf dem Elastomer zu erhalten. </li><li> Stanzlöcher für Ein-und Auslässe mit einem 1,5 mm Biopsiestanze (Miltex, York, PA), die an einer Bohrmaschine. Ziehen Sie alle Fremdkörper. </li><li> Thema Die Funktionen Seite des Stempels und einer sauberen Glasobjektträger einem Sauerstoffplasma für 8 Minuten in einem Sauerstoffplasma Radierer. Bringen der behandelten Flächen in Kontakt sofort, um eine Bindung zwischen ihnen auszubilden. Pflegen Sie die Montage bei 60 ° C auf einer Folie wärmer für mindestens 5 Stundens zur Stärkung der Bindung. </li><li> Verbinden 0,032 "ID PTFE-Schlauch (Cole Parmer, Vernon Hills, IL) zu den Einlässen und Auslässen über eine Schnittstelle des männlichen Luer-Lock-Anschlüsse angebracht Widerhaken weiblichen Luer-Lock Verbinder (Qosina, Edgewood, NY). </li><li> Richten Sie die Fließmontage mit Absperrventilen und eine Y-Stecker (Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA; Abbildung 1). Montieren Sie das Gerät mit dem Mikroskop. Bringen Spritzen Schlauch mit 20G 1,5 "Nadeln (BD Bioscience, Rockville, MD). </li></ol> 2. Bildung Uniform Spheroids Sphäroide wurden von der hängenden Tropfen-Methode 2,3 gebildet. <ol><li> Trypsinieren Zellen unter einer sterilen Zellkultur Kapuze. </li><li> Zentrifuge trypsinierten Zellen bei 2000 rpm für 5 Minuten und resuspendieren in 6 ml frisches Medium. Verdünnen der Stammlösung zu einer gewünschten Endkonzentration (Tabelle 1). </li><li> Entfernen Sie den Deckel einer 48-Well-Platte und legen Sie sie kopfüber in die sterilized Kapuze. Circular entsprechenden Bereiche in jede Vertiefung sind auf dem Cover ersichtlich. Füllen Sie jede Vertiefung der Platte mit 1 ml sterilem Wasser Feuchtigkeit halten. Setzen Sie einen 20 ul Tropfen der verdünnten Zell-Lösung in jedem kreisförmigen Bereich mit einer Mikropipette. Sorgfältig invertieren Sie die Abdeckung und legen Sie es über den Well-Platte, so dass die Tropfen nicht berühren die Kanten der Brunnen. </li><li> Inkubieren der Mikrotiterplatte bei 37 ° C für eine bestimmte Anzahl von Tagen (Tabelle 1). Ein Sphäroid wird in jedem hängenden Tropfen bilden. </li></ol> 3. Einführung der Sphäroide in Device Siehe Abbildung 1 und Tabelle 2 für diesen Abschnitt Abbildung. <ol><li> Sterilisieren der Vorrichtung durch Spülen mit 70% Ethanol durch die Strömungseinlaß eingeführt. Anschließend bündig mit PBS gefolgt von HEPES gepufferte Zellkulturmedium. Lassen Sie das Medium Spritze S F an den Schläuchen. </li><li> Zeichnen 2-3 Sphäroide in die Spritze S P, tippen Spritze, um Luftblasen zu entfernen, undBefestigen der Verpackung Einlaß der Vorrichtung. </li><li> Offene Einlaßventil V Pin und enge V Fin. Geöffnete Auslassventil V Pout und enge V Fout. Halten Sie die Verpackung Spritze senkrecht mit der Nadel nach unten; zusehen, wie Sphäroide auf den Boden der Spritze niederlassen in den Luer-Lock-Anschluss der Nadel. Drücken Sie den Kolben auf der Verpackung Spritze und Uhr Sphäroide geben Sie den Schlauch und fließen in das Gerät. Weil nur die Packung Auslaßventil offen ist, wird ein Sphäroid die Kammer eintreten der Vorrichtung und durch Stützen auf der Rückseite (Fig. 2) erhalten. </li><li> Einlass schließen V Pin und Auslassventil V Pout. Montieren der Spritze S F auf einer Spritzenpumpe. Öffnen Sie das Ventil V Fin und Ventil V Fout. Fördermedium in das Gerät 3 ul / min. </li></ol> 4. Einleitung der Apoptose Erkennen Agent (CaspGLOW) Nach dem Packen Kammern mit Sphäroide erlauben Äquilibrierung für up bis 24 Stunden, um Nährstoff Gradienten und Mikroumgebungen herzustellen, vor dem Einführen Apoptose Nachweisen oder Therapeutika. Da die Gewebe in den Kammern in Kontakt mit undurchdringlichen Mauern von oben und unten sind, gibt es keine Nährstoff Gradienten entlang der Dicke (0,15 mm) des Gewebes. Nach 24 Stunden Inkubation werden alle Zellschichten entlang der Dicke des Gewebes entspricht mithin und die einzige Heterogenität ist in einer Richtung weg von dem Strömungskanal. <ol><li> Abgeschaltet V Fin, stoppen Sie die Spritzenpumpe Spritze abnehmen S F von der Pumpe und ersetzen sie durch eine Spritze mit Medium mit 0,25 ul / ml CaspGLOW Red Aktive Caspase-3 Marker (Red-DEVD-FMK; Biovision, Mountain View, CA). </li><li> Manuell bündig 0,7 ml dieser Lösung durch die Vorrichtung, um eine Verschiebung der älteren Medium zu gewährleisten. Montieren Sie die Spritze an der Pumpe, starten Flow und offenen V Fin. Über einen Zeitraum von 5-8 Stunden, Erfassen der Apoptose Agenten diffundiert in tEr Gewebe und fluoresziert heller apoptotischen Regionen. Apoptosis Sprühmittel bei dieser Konzentration wird in allen weiteren Workflow-Lösungen in das Gerät erhalten. </li></ol> Hinweis: <ol class="lroman"><li> Tissue Heterogenität kann durch den Erwerb lineare Intensitätsprofile der Fluoreszenz, wie in Abschnitt 6 beschrieben bestätigt werden. Die Profile sollten räumlichen Gradienten in der Apoptose zeigen, bestätigt, dass das Gewebe heterogen in Bezug auf die Lebensfähigkeit der Zellen ist. </li><li> CaspGLOW Grün Aktiv Caspase-3 Marker (Fluorescein-DEVD-FMK, Biovision) kann auch verwendet werden, um die Apoptose zu detektieren. Dieser Marker enthält das grüne Fluorophor Fluorescein anstelle des roten Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin. </li></ol> 5. Einführung des therapeutischen Wirkstoffs <ol><li> Befolgen Sie die Anweisungen in den Schritten 4,1-4,2 bis 10 uM Doxorubicinhydrochlorid (Dox, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) einzuführen, die Apoptose Sprühmittel. </li><li> Weiterhin Strömung des therapeUTIC Wirkstofflösung für eine feste Zeitspanne. Absperrventil V Fin und schalten Sie die Spritzenpumpe. Ersetzen der Behandlung Spritze mit einer Spritze, die frisches Medium Apoptose Nachweismittel. Erlauben Strömung von frischem Medium für 24 Stunden unter -36 kontinuierliches Überwachen des Gewebes unter dem Mikroskop. </li></ol> 6. Zeitraffer-Mikroskopie und Estimation of Drug Diffusivität Koeffizienten Zum Erhalten saubersten Fluoreszenzdaten, alle Bilder zu erwerben durch Fokussieren des Mikroskops auf die unteren Schichten von Geweben. Da es keine Nährstoff-Gradienten in vertikaler Richtung (siehe Abschnitt 4), sind die unteren Schichten von Zellen gute Vertreter aller anderen Schichten über. <ol><li> Die gesamte Übernahme-Prozess automatisiert wurde mithilfe einer angepassten Skript in IPLab (BD Bioscience, Rockville, MD). Erwerben Durchlicht und Fluoreszenz-Aufnahmen des verpackten Sphäroid bei 10facher Vergrößerung alle 30 Minuten (Abb. 3A). AcquirE ein Bild der Hintergrundfluoreszenz vor der Einführung Dox. Um nach der Größe der Kammer (x 1000 um 300 um) unterzubringen, zu erwerben zwei angrenzenden Bildern und überlappend, gemeinsam 4. </li><li> Für mathematische Schätzung Medikament Diffusivität Koeffizienten, ist der erste Schritt, um gemittelte linearen Intensitätsprofile Dox Fluoreszenz unter Verwendung ImageJ erzeugen. Wähle einen rechteckigen Bereich von Interesse (ROI), das die Gewebe in der Kammer. Verwenden der Plot Befehl Profil, ein Profil der mittleren Intensitäten als eine Funktion des Abstandes von dem Strömungskanal zu erzeugen. Wiederholen Sie dies für bis zu 3 verschiedenen Zeitpunkten. </li><li> Besorgen Sie sich eine Hintergrundfluoreszenz Bild vor Einführung Dox zur Autofluoreszenz aus dem Gewebe zu messen. Subtrahieren Sie die durchschnittliche Hintergrund Fluoreszenzintensität aus den erhaltenen Intensitätsprofile und normalisieren jedes Profil durch die entsprechende maximale Intensität zu erhalten <img src="/files/ftp_upload/2425/2425eq0.jpg" alt="c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="c"> (X, t) (Abb. 3B). </li><li> Der nächste Schritt ist, den effektiven Diffusionskoeffizienten D der Dox innerhalb Tumorgewebe auszuwerten. Dox Diffusion kann durch die folgende Gleichung 5 dargestellt werden <img src="/files/ftp_upload/2425/2425eq1.jpg" alt="Gleichung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Gleichung 1"> wobei die komplementäre erfc Fehlerfunktion ist, x Abstand in das Gewebe aus dem Kanal, und t die Zeit nach dem Einbringen Dox (s. Abbildung. 3). Verwenden Sie die folgenden iterativen Schema zu jedem Zeitpunkt in Betracht gezogen: <ul><li> Ratet mal, einen Wert für D </li><li> Berechnen rechten Seite der Gleichung an jedem Ort x </li><li> Berechnen der Summe der quadrierten Fehler (Rest-) zwischen den zwei Seiten </li><li> Ändern D den Rest-Minimierung </li></ul></li><li> Durchschnittlichen die optimalen Werte von D zu jedem Zeitpunkt erhalten, um die durchschnittliche effektive Diffusionskoeffizient Dox im Gewebe abzuschätzen. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: &lt;p class = "jove_content"&gt; Die Mikrofluidikeinheiten 1mm x 0.3mm x 0.15mm optisch zugänglichen Kultur Kammern für das Wachstum von dreidimensionalen Tumorgewebe. Vielzelligen Tumorsphäroide wurden in diesen Kammern geflogen und wurden durch zwei Filter Beiträge auf der Rückseite erhalten. Der hängende Tropfen Verfahren erlaubt schnelle Bildung von Sphäroiden konsistenter Größe und Form aus mehreren Zelllinien. Sphäroide wurden erfolgreich auf dem Gerät gewachsen für bis zu 3 Tage. Das Wachstum in den Kammern wurde mit einer reproduzierbaren Änderung Mikroumgebungen in Sphäroide verbunden. Apoptose in Zellen aufgetreten weniger in der Nähe des Strömungskanals und höheren tiefer in das Gewebe. Die Vorrichtung wurde verwendet, um den Diffusionskoeffizienten von Doxorubicin in Tumorgewebe zu schätzen. Der erhaltene Wert von 8,75 x 10 -7 cm 2 s -1 stimmt der Wert von 9,1 x 10 -7 cm 2 s -1 zuvor berichtet 6 in menschlichen Brustkrebszellen. <table border="1"><tbody><tr><td> Cell Line </td><td> Erforderliche Zellkonzentration </td><td> Inkubationszeit </td></tr><tr><td> LS174T </td><td> 300 Zellen / ul </td><td> 2-3 Tage </td></tr><tr><td> T47D </td><td> 750 Zellen / ul </td><td> 3-4 Tage </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 </td><td> 150 Zellen / ul </td><td> 5-6 Tage </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Parameter für hängenden Tropfen Spheroids <table border="1"><tbody><tr><td> Teil </td><td> Beschreibung </td></tr><tr><td> S F </td><td> Flow Spritze </td></tr><tr><td> S P </td><td> Verpackung Spritze </td></tr><tr><td> V Fin </td><td> Flow Einlassventil </td></tr><tr><td> V Pin </td><td> Verpackung Einlassventil </td></tr><tr><td> V Fout </td><td> Flow Auslassventil </td></tr><tr><td> V Pout </td><td> Verpackung Auslassventil </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Spritzen und Ventile in Flow-Setup <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1 Schematische Darstellung des Flow Setup V Fin und V Fout:. Flow-Einlass-und Auslassventile, V Pin und V Pout: Verpackung Einlass-und Auslassventile, S F und S P: Flow und Verpackung Spritzen. Die Verpackung Spritze und Verpacken und Auslaßventile werden verwendet, wenn ein Sphäroid in die Kammer geflogen wird. Die Strömung Spritze und Strömungseinlaß und Auslaßventile werden verwendet, um Medium anschließend fließen. <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Schema eines Sphäroids in einer Kammer auf der Vorrichtung gefangen. Ein Sphäroid in die Kammer auf der Vorrichtung durchströmt und durch zwei Filter blockiert posts an der Rückseite der Kammer. <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Doxorubicin Diffusion in Tumorgewebe auf dem Gerät. A. Zusammengeführt Durchlicht und rot fluoreszierenden Bild des Gewebes, des Standorts und der Konzentration von Doxorubicin (in rot). Maßstab stellt 250 um. B. Normalized lineare Intensität Profil von Doxorubicin Fluoreszenz.

<ol><li>Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Prototyping+of+Microfluidic+Systems+in+Poly%28dimethylsiloxane%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane).</a> Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).</li>
<li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnol. Bioeng. 83, 173-180 (2003).</li>
<li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Methods. Mol. Med. 140, 141-151 (2007).</li>
<li>Kasinskas, R. W., Forbes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+specifically+chemotax+and+proliferate+in+heterogeneous+tumor+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium specifically chemotax and proliferate in heterogeneous tumor tissue in vitro.</a> Biotechnol. Bioeng. 94, 710-721 (2006).</li>
<li>Walsh, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multipurpose+microfluidic+device+designed+to+mimic+microenvironment+gradients+and+develop+targeted+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">A multipurpose microfluidic device designed to mimic microenvironment gradients and develop targeted cancer therapeutics.</a> Lab. Chip. 9, 545-554 (2009).</li>
<li>Lankelma, J., Fernandez Luque, R., Dekker, H., Schinkel, W., Pinedo, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mathematical+model+of+drug+transport+in+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">A mathematical model of drug transport in human breast cancer.</a> Microvasc. Res. 59, 149-161 (2000).</li>
<li>Less, J. R., Skalak, T. C., Sevick, E. M., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+architecture+in+a+mammary+carcinoma%3A+branching+patterns+and+vessel+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Microvascular architecture in a mammary carcinoma: branching patterns and vessel dimensions.</a> Cancer. Res. 51, 265-273 (1991).</li>
<li>Brown, J. M., Giaccia, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unique+physiology+of+solid+tumors%3A+opportunities+%28and+problems%29+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">The unique physiology of solid tumors: opportunities (and problems) for cancer therapy.</a> Cancer. Res. 58, 1408-1416 (1998).</li>
<li>Thomlinson, R. H., Gray, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histological+structure+of+some+human+lung+cancers+and+the+possible+implications+for+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy.</a> Br. J. Cancer. 9, 539-549 (1955).</li>
<li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+penetration+in+solid+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drug penetration in solid tumours.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Das Gefäßsystem in Tumoren ist spärlich und schlecht entwickelten 7,8. Es gibt Regionen weit (&gt; 100 um) aus den Blutgefäßen, die unzugänglich Nährstoffe und Medikamente obwohl das Gefäßsystem 9 zugeführt werden entfernt. Die resultierende heterogene Mikroumgebung trägt zur begrenzten Wirksamkeit vieler Chemotherapeutika 10. Die Mikrofluidvorrichtung hier entwickelten erschafft ein heterogenes Tumormikroumgebung durch proliferierende, ruhende und apoptotischen oder nekrotischen Zellen ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Namen Reagenz </th><th> Firma </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Silikon-Elastomer-Kit </td><td> Ellsworth Adhesives </td><td> 184 Sil Elast Kit </td><td></td></tr><tr><td> Miltex Biopsiestanze </td><td> MedexSupply </td><td> MTX-33-31aa </td><td> 1,5 mm </td></tr><tr><td> PTFE-Schlauch </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06.417-31 </td><td> 0,032 &quot;ID </td></tr><tr><td> Luer-Lock-Anschluss </td><td> Qosina </td><td> 65111 </td><td></td></tr><tr><td> Barbed weiblichen Luer-Lock-Anschluss </td><td> Qosina </td><td> 11556 </td><td></td></tr><tr><td> Absperrventil </td><td> IDEX Health and Science </td><td> P-721 </td><td></td></tr><tr><td> Y-Verbinder </td><td> IDEX Health and Science </td><td> P-513 </td><td></td></tr><tr><td> 20G 1,5 &quot;Nadeln </td><td> BD Bioscience </td><td> 305176 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H-4034 </td><td></td></tr><tr><td> CaspGLOW Fluorescein </td><td> Biovision </td><td> K183-25 </td><td></td></tr><tr><td> CaspGLOW Red </td><td> Biovision </td><td> K193-25 </td><td></td></tr><tr><td> Doxorubicinhydrochlorid </td><td> Sigma </td><td> 44583 </td><td></td></tr><tr><td> LS174T </td><td> ATCC </td><td> CCL-188 </td><td> Menschliche Koloncarcinomzelllinie </td></tr><tr><td> T47D </td><td> ATCC </td><td> HTB-133 </td><td> Menschliche duktales Karzinom-Zelllinie </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 </td><td> ATCC </td><td> HTB-26 </td><td> Menschlichen Mamma-Adenokarzinom-Zelllinie </td></tr></tbody></table>

mikrofluidik-vorrichtung für die neuerstellung eines tumor-mikroumgebung<em&gt; in vitro</em

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Wir haben eine Mikrofluidik-Vorrichtung, die die Lieferung und die systemische Clearance von Medikamenten zur heterogenen dreidimensionalen Tumorgewebe in vitro imitiert entwickelt. Nährstoffen durch Vaskulatur geliefert fehlschlagen, alle Teile von Tumoren zu erreichen, was zu heterogenen Mikroumgebungen bestehend aus lebensfähigen, Ruhestrom und nekrotischen Zelltypen. Viele Krebsmedikamente nicht effektiv durchdringen und behandeln alle Arten von Zellen, weil dieser Heterogenität. Monoschichten von Krebszellen nicht nachzuahmen diese Heterogenität, was es schwierig macht Krebsmedikamente mit einem geeigneten in vitro-Modell zu testen. Unsere mikrofluidischen Bauteilen wurden aus PDMS hergestellt mit weichen Lithographie. Vielzelligen Tumorsphäroide, durch den hängenden Tropfen-Verfahren gebildet wurden eingesetzt und in rechteckige Kammern auf der Vorrichtung eingespannt und gehalten mit Endlosmediums Perfusion auf einer Seite. Die rechteckige Form der Kammern auf dem Gerät erstellt lineare Gradienten im Gewebe. Fluoreszenzfarbstoffe wurden verwendet, um th zu quantifizierene Variabilität Apoptose innerhalb Gewebe. Tumore auf der Vorrichtung wurden mit dem fluoreszierenden Chemotherapeutikum Doxorubicin, Zeitraffer-Mikroskopie wurde verwendet, um ihre Diffusion in Gewebe zu überwachen, und der effektive Diffusionskoeffizient wurde geschätzt behandelt. Die hängenden Tropfen Methode erlaubt schnelle Bildung einer einheitlichen Sphäroide aus mehreren Krebszelllinien. Das Gerät aktiviert Wachstum von Sphäroiden für bis zu 3 Tage. Cells in der Nähe des strömenden Mediums waren minimal apoptotischen und die weit aus dem Kanal waren apoptotische und damit exakt imitiert Regionen in Tumoren neben Blutgefäße. Der geschätzte Wert des Doxorubicin Diffusionskoeffizient vereinbarten mit einem zuvor gemeldeten Wert in menschlichen Brustkrebszellen. Da die Penetration und Retention von Drogen in soliden Tumoren wirkt sich auf ihre Wirksamkeit, glauben wir, dass dieses Gerät ein wichtiges Instrument zum Verständnis des Verhaltens von Drogen, und die Entwicklung neuer Krebstherapeutika ist.

Wir präsentieren, das Verfahren für die Herstellung und den Betrieb einer mikrofluidischen Vorrichtung, die heterogene Tumor Mikroumgebungen nachbildet<em&gt; In vitro</em&gt;. Die Variabilität in der Apoptose in Tumorgewebe wurde quantifiziert mit Fluoreszenzfarbstoffen und die effektive Diffusionskoeffizient des Chemotherapeutikum Doxorubicin in Tumorgewebe wurde ausgewertet.

Mikrofluidik-Vorrichtung für die Neuerstellung eines Tumor-Mikroumgebung<em&gt; In Vitro</em

Wir haben ein mikrofluidisches System entwickelt, welches die Verabreichung und die systemische Clearance von Arzneimitteln in heterogenen dreidimensionalen Tumorgeweben in ... nachahmt.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Herstellung und den Betrieb eines mikrofluidischen Geräts zu demonstrieren, das Tumormikroumgebungen in vitro nachbildet und zur Testung chemotherapeutischer Wirkstoffe verwendet werden kann. Dies ist das mikrofluidische Gerät. Dieses Gerät kann in folgenden Bereichen nützlich sein: einfache Testung chemotherapeutischer Wirkstoffe in vitro.Es liefert konsistente und genaue Ergebnisse für die Untersuchung von dreidimensionalem Tumorgewebe, und dieses Gerät ermöglicht eine sehr genaue Darstellung des Tumors in vivo. Tumore existieren in 3D-Mikroumgebungen, und die Möglichkeit, in solchen zu testen, ist von großer Bedeutung. Der erste Schritt des Verfahrens besteht darin, das Gerät zusammenzubauen, was die Herstellung eines mikrofluidischen Chips mittels weicher Lithographie, das Stanzen von Löchern an den Einlässen und Auslässen, das Verbinden mit einem Objektträger und das Anschließen von Schläuchen für den Durchfluss an Ein- und Auslass beinhaltet.Anschließend werden mithilfe der Hängetropfen-Methode uniforme multizelluläre Tumorsphäroide zur Verwendung im Gerät erzeugt. Die Sphäroide werden dann in das Gerät eingebracht, gefolgt von Apoptose detektierenden Substanzen und chemotherapeutischen Wirkstoffen. Schließlich erfolgt eine Zeitraffer-Mikroskopie, gefolgt von der mathematischen Schätzung der Diffusionskoeffizienten des Wirkstoffs, um die Penetrationsfähigkeit des chemotherapeutischen Agents zu quantifizieren.Schließlich können Ergebnisse erzielt werden, die das Gewebewachstum im Gerät, die Bildung heterogener Mikroumgebungen innerhalb des Gewebes sowie die Diffusion von Wirkstoffen in das Gewebe mittels zeitraffenden Fluoreszenzmikroskopie zeigen. Eine eingeschränkte Penetration von Krebsmedikamenten in solide Tumore ist eine wichtige Ursache für deren Versagen. Die meisten derzeitigen Modelle zur Prüfung von Krebsmedikamenten bilden die dreidimensionale Natur solider Tumore nicht nach.Wir haben ein mikrofluidisches Gerät entwickelt, das aus kontinuierlich perfundierten dreidimensionalen Tumorgeweben besteht. Dieses Modell stellt die Abgabe von Wirkstoffen an solide Tumore und deren systemische Clearance genauer dar. Multizelluläre Tumorsphäroide sind ein etabliertes Modell für dreidimensionales Tumorgewebe.Bei diesem Verfahren wird die Hängetropfen-Methode verwendet, um Steroide für die Anwendung in der mikrofluidischen Vorrichtung herzustellen. Diese Methode ermöglicht die Bildung einheitlicher Steroide in kurzer Zeit. Die Untersuchung chemotherapeutischer Wirkstoffe in vitro in dreidimensionalem Gewebe kann helfen, Wirkstoffe effizienter zu screenen als mit Zell-Monolagen.Mischen Sie PDMS und Härter aus dem Silikonelastomer im Gewichtsverhältnis neun zu eins. Gießen Sie dann diese Mischung über den Master, um eine vier Millimeter dicke Gießform herzustellen. Um Luftblasen zu entfernen, 5 Stunden bei 60 Grad Celsius aushärten.Lösen Sie das ausgehärtete PDMS von der Form, um einen Stempel mit den Strömungsstrukturen auf dem Elastomer zu erhalten. Verwenden Sie dann eine 1,5 mm große Biopsiepunchvorrichtung, die an einer Bohrmaschine befestigt ist, um Löcher für Zulauf- und Ablauföffnungen zu stanzen. Entfernen Sie alle Rückstände.Unterziehen Sie die strukturierte Seite des Stempels und eine saubere Glasobjektträgerplatte acht Minuten lang einer Sauerstoff-Plasmabehandlung. Bringen Sie die behandelten Oberflächen in einem Sauerstoff-Plasmaätzer unmittelbar in Kontakt, um eine Bindung zwischen ihnen zu erzeugen. Halten Sie die Zusammenstellung mindestens fünf Stunden lang bei 60 Grad Celsius auf einem Objektträgerwärmer.Um die Verbindung zu verstärken, schließen Sie PTFE-Schläuche mit einem Innendurchmesser von 0,032 Zoll an die Ein- und Ausgänge des mikrofluidischen Geräts an. Mithilfe einer Schnittstelle aus männlichen Luer-Lock-Steckern, die an konische weibliche Luer-Lock-Verbinder angeschlossen sind, können diese spezifischen Verbinder leicht durchgeführt werden, ohne zu brechen. Richten Sie abschließend die Durchflussanordnung mit Absperrventilen und einem Y-Verbinder ein und montieren Sie das Gerät am Mikroskop. Nach der Montage des Geräts verbinden Sie die Schläuche mit den entsprechenden Ein- und Ausgängen, um die Durchflussanlage zu vervollständigen.Wie in dieser Abbildung gezeigt, ermöglicht diese Konfiguration eine einfache und vielseitige Beladung eines Sphäroides in das Gerät oder erzeugt einen Mediumfluss durch das Gerät zum Befüllen. Öffnen Sie das Eingangsventil VPN und das Ausgangsventil VP, um einen Tumor abzuleiten. Anschließend kann OID durch den Eingang strömen und in die Kulturkammer gelangen, wo die Säule in dieser Kammer den Tumor fixiert und den Mediumfluss ermöglicht.Schließen Sie die Packventile und öffnen Sie das Einlassventil VF in und das Auslassventil VF out, um die Bildung eines homogenen PHE einzuleiten. Verwenden Sie die Hängentropfen-Methode, um die Zellen mit Trypsin auf Eis unter einem Zellkulturhauben abzutragen. Entnehmen Sie die resultierenden Trypsin-Zellen aus der Zentrifuge.Verdünnen Sie die Stammlösung anhand von Tabelle eins auf die gewünschte Konzentration. Entfernen Sie danach den Deckel einer 48-Loch-Platte und stellen Sie ihn verkehrt herum ab. Füllen Sie im sterilen Gehäuse jedes Loch der Platte mit einem Milliliter sterilisiertem Wasser.Um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten, geben Sie einen 20-Mikroliter-Tropfen verdünnte Zelllösung in jeden kreisförmigen Bereich auf der Deckplatte. Drehen Sie die Deckplatte vorsichtig mit einer Mikropipette um und platzieren Sie sie über die Platte, wobei sichergestellt werden muss, dass die Tropfen die Ränder der Vertiefungen nicht berühren. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius.Beziehen Sie sich auf Tabelle eins hinsichtlich der Inkubationsdauer, abhängig von der verwendeten speziellen Zelle; ein Steroid wird in jedem hängenden Tropfen gebildet. Beginnen Sie damit, das Gerät zu sterilisieren, indem Sie es über den Durchflusszulauf mit 70 %igem Ethanol spülen. Anschließend spülen Sie nacheinander mit PBS und dann mit H-E-P-E-S-puffermedium für die Zellkultur.Lassen Sie die mittlere Spritze am Schlauch angeschlossen. Ziehen Sie anschließend zwei bis drei Steroide in den Anschluss der Spritze. Um Luftblasen zu entfernen, schließen Sie die Spritze an den Packeinlass des Geräts an.Öffnen Sie das Einlassventil VPN und schließen Sie VFN. Öffnen Sie das Auslassventil VP out und schließen Sie VF out. Halten Sie die Packungspritze senkrecht mit der Nadel nach unten gerichtet. Beobachten Sie, wie das Steroid sich am Boden der Spritze im Luer-Lock-Anschluss der Nadel absetzt.Drücken Sie den Kolben der Packungsspritze und beobachten Sie, wie PHE in die Tubing eindringt und in das Gerät strömt, da nur das Auslassventil für die Packung geöffnet ist. Ein Steroid tritt in die Kammer des Geräts ein und wird durch die Säulen an der Rückseite zurückgehalten. Sobald sich der S-Sphäroid innerhalb der Kammer befindet, passt er sich der Form der Kammer an und nimmt eine rechteckige Geometrie an.Schließen Sie das Einlassventil VPN und das Auslassventil VP, und montieren Sie die Fluss-Spritze SF auf der Spritzenpumpe. Diese Pumpe wird von einem Computer gesteuert, der die Spritzenpumpe betreibt. Öffnen Sie das Einlassventil VFN und das Auslassventil VF, und beginnen Sie den Fluss des Mediums in das Gerät mit drei Mikrolitern pro Minute.Die Inkubation des Sphäroids für 24 Stunden wird gefolgt von der Zugabe von Apoptose-Detektionsmitteln. Vor der Zugabe von Apoptose-, Detektions- oder therapeutischen Mitteln sollte das Sphäroid bis zu 24 Stunden zur Herstellung von Nährstoffgradienten und Mikroumgebungen im Gleichgewicht einstellen. Danach Ventil VFN schließen.Stoppen Sie die Spritzenpumpe. Entfernen Sie die Spritze aus der Pumpe und ersetzen Sie sie durch die Spritze mit Medium, das 0,25 Mikroliter pro Milliliter CASP Glow Red aktives Caspase-3-Marker enthält. Spülen Sie das Gerät manuell mit 0,7 Milliliter dieser Lösung durch.Danach die Spritze an der Pumpe befestigen. Den Fluss erneut starten und das Ventil VFN öffnen. Über einen Zeitraum von fünf bis acht Stunden diffundiert das rote aktive CPH-Phasen-3-Reagenz in das Gewebe und fluoresziert in apoptotischen Bereichen heller. Das Apoptose-Nachweismittel wird in dieser Konzentration in allen nachfolgenden Flüssigkeiten beibehalten.Doxorubicin wird fünf bis acht Stunden nach der Gabe von Apoptose-Detektionsmitteln zugegeben. Diese Behandlung wird durch Spülen aus dem System entfernt. Um chemotherapeutische Wirkstoffe hinzuzufügen, folgen Sie dem Verfahren zur Apoptose-Detektion, um 10 Mikromolar Doxorubicinhydrochlorid zuzugeben.Danach ersetzen Sie die Behandlungsspritze durch eine Spritze mit 0,7 Milliliter Medium. Setzen Sie den Fluss des therapeutischen Wirkstoffs über einen festgelegten Zeitraum fort. Schalten Sie danach das Ventil VFN ab und schalten Sie die Spritzenpumpe aus.Entfernen Sie die Behandlungsspritze aus der Spritzenpumpe und ersetzen Sie sie durch die Spritze mit 0,7 Milliliter Medium. Lassen Sie frisches Medium für 24 bis 36 Stunden fließen, während Sie das Gewebe kontinuierlich unter einem Mikroskop überwachen. Der gesamte Erfassungsprozess für die Zeitraffermikroskopie wurde mithilfe eines angepassten Skripts in IP Lab automatisiert, wobei alle 30 Minuten transmitted-light- und Fluoreszenzbilder des PAX Foid mit 10-facher Vergrößerung aufgenommen wurden. Für die mathematische Abschätzung der Diffusionskoeffizienten von Wirkstoffen besteht der erste Schritt darin, mittlere lineare Intensitätsprofile der Docs-Fluoreszenz mithilfe von ImageJ zu erzeugen. Wählen Sie einen rechteckigen Bereich von Interesse (ROI), der das Gewebe in der Kammer umfasst.Verwenden Sie den Befehl „Profil plotten“, um ein Profil der durchschnittlichen Intensitäten in Abhängigkeit vom Abstand zum Flusskanal zu erstellen. Wiederholen Sie dies für bis zu drei verschiedene Zeitpunkte. Subtrahieren Sie anschließend die durchschnittliche Hintergrundfluoreszenzintensität von den erhaltenen Intensitätsprofilen und normalisieren Sie jedes Profil mithilfe der entsprechenden Maximalintensität, um C als Funktion von X und T zu erhalten. Dabei ist C die normierte Konzentration von Doxorubicin, deren Wert zwischen null und eins variiert.Der nächste Schritt besteht darin, den effektiven Diffusionskoeffizienten von docs im Tumorgewebe docs zu bewerten. Die Diffusion kann durch die folgende Gleichung dargestellt werden, wobei ERFC die komplementäre Fehlerfunktion ist. X ist der Abstand in das Gewebe hinein, ausgehend vom Kanal, und T ist die Zeit nach der Applikation von Doxorubicin.Verwenden Sie das folgende iterative Schema zu jedem betrachteten Zeitpunkt. Schätzen Sie einen Wert für D. Berechnen Sie die rechte Seite der Gleichung an jeder Stelle X. Berechnen Sie die Summe der quadrierten Abweichungen zwischen den beiden Seiten und verändern Sie D, um den durchschnittlichen Restfehler zu minimieren.Die optimalen Werte von D, die zu jedem Zeitpunkt ermittelt wurden, dienen der Abschätzung des durchschnittlichen effektiven Diffusionskoeffizienten von Doxorubicin im Gewebe. Die mikrofluidischen Vorrichtungen verfügten über optisch zugängliche Kulturgefäße mit einer Größe von einem Millimeter mal 0,3 Millimeter mal 0,15 Millimeter zur Züchtung dreidimensionaler Tumorgewebe. Die Hängetropfmethode ermöglichte eine schnelle Bildung von Tumor-PHEs mit konsistenter Größe und Form aus mehreren Zelllinien.PHE wurden erfolgreich bis zu drei Tage lang auf dem Gerät kultiviert. Das Wachstum in den Kammern war mit einer reproduzierbaren Modifikation der Mikroumgebungen verbunden. Innerhalb der PHE trat Apoptose seltener in Zellen auf, die in unmittelbarer Nähe zum Strömungskanal lagen, und war stärker ausgeprägt weiter entfernt und tiefer im Gewebe.Mit dem Gerät wurde der Diffusionskoeffizient von Doxorubicin und Tumorgewebe geschätzt. Der experimentell erhaltene Wert stimmte mit dem zuvor bei menschlichem Brustkrebs berichteten Wert überein. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist besondere Vorsicht erforderlich, um die Sterilität während des Einleitens von PHE in das Gerät aufrechtzuerhalten, da der Vorgang außerhalb der Zellkultur durchgeführt werden muss.Besprühen Sie die Spritzen und Tubingenden großzügig mit Ethanol, um Sterilität zu gewährleisten. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein Verständnis für die begrenzte Penetration von Wirkstoffen in Tumore haben. Wir haben eine Technik demonstriert, um die Zufuhr und systemische Clearance von Wirkstoffen an dreidimensionalen Tumorgeweben nachzuahmen und deren Penetration zu quantifizieren.Die Eliminierung schlecht penetrierender Arzneistoffe wird den Prozess der Krebsmedikamentenentwicklung erheblich beschleunigen.

microfluidic-device-for-recreating-a-tumor-microenvironment-in-vitro

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Verfahren zur Kultur von Endothelzellen eine Monoschicht der gesamten inneren Oberfläche des 3D einer Mikrofluidikvorrichtung mit mikrovaskulären großen Kanälen (&lt;30 um) beschrieben.

Endothelialisierten Mikrofluidik für ein Studium Mikrovaskuläre Wechselwirkungen in Hämatologische Krankheiten

In diesem Video erzeugen wir Mikrotumoren aus Tumorzellen von Patienten mit humanem 3D-Biogel. Diese Mikrotumoren ähneln stark der in vivo Tumor-Mikroumgebung und dienen als potenzielle Plattformen für Wirkstofftests.

Erzeugung von Mikrotumoren: Eine In-vitro-Kulturtechnik zur Kultivierung von 3D-Mikrotumoren zur Analyse des Ansprechens auf eine medikamentöse Behandlung

Methoden, um menschliche 3D-Tumorgewebe als Testsysteme zu erstellen beschrieben. Diese Techniken basieren auf einer dezellularisierten Biologische Vaskularisierte Gerüst (BioVaSc), primäre menschliche Zellen und einer Tumor-Zellinie, die unter statischen als auch unter dynamischen Bedingungen in einer Strömungs Bioreaktor kultiviert werden können, basieren.

Tissue Engineering eines Menschen 3D<em&gt; In-vitro-</em&gt; Tumor-Testsystem

Wir haben einen durchlässigen mikroporösen Membraneinsatz angepasst, um die Tumormikroumgebung (TME) nachzuahmen. Das Modell besteht aus einer gemischten Zellkultur, ermöglicht die vereinfachte Generierung hochangereicherter individueller Zellpopulationen ohne Verwendung von Fluoreszenzmarkierung oder Zellsortierung und ermöglicht die Untersuchung der interzellulären Kommunikation innerhalb der TME unter Normal- oder Stressbedingungen.

Ein Mimic des Tumor-Microenvironment: Eine einfache Methode für Enriched Zellpopulationen Generierung und Untersuchung der interzellulären Kommunikation

Wir präsentieren ein mikrofluidisches Krebs-on-Chip-Modell, die "Evolution Accelerator"-Technologie, die eine kontrollierbare Plattform für langfristige Echtzeit-quantitative Studien zur Krebsdynamik innerhalb klar definierter Umweltbedingungen an der Einzelzelle bietet. niveau. Es wird erwartet, dass diese Technologie als In-vitro-Modell für die Grundlagenforschung oder die präklinische Arzneimittelentwicklung funktioniert.

Generierung heterogener Arzneimittelgradienten über Krebspopulationen auf einem mikrofluidischen Evolutionsbeschleuniger zur Echtzeitbeobachtung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Vorbereitung und Kultivierung einer Bluthirnschranke metastasierenden Tumor Mikro-Umgebung und dann quantifizieren seinen Zustand mit konfokaler Bildgebung und künstliche Intelligenz (Machine Learning).

Quantifizierung der metastasierenden Tumor-Mikroumgebung des Gehirns mit einem Organ-On-A-Chip-3D-Modell, maschinellem Lernen und konfokaler Tomographie

Wir präsentieren ein mikrofluidisches System für Hochdurchsatzstudien an komplexen Lebensmaschinen, das aus 1500 Kultureinheiten, einer Reihe verbesserter Peristaltikpumpen und einem Mischmodul vor Ort besteht. Der mikrofluidische Chip ermöglicht die Analyse der hochkomplexen und dynamischen Mikro-Umgebungsbedingungen in vivo.

Erzeugung dynamischer Umgebungsbedingungen mit einem hochdurchsatzstarken mikrofluidischen Gerät

Im Zeitalter der Immuntherapie und des genomischen Profilings von Einzelzellen erfordert die Krebsbiologie neuartige In-vitro- und Computerwerkzeuge, um die Tumor-Immun-Schnittstelle in einem geeigneten raumzeitlichen Kontext zu untersuchen. Wir beschreiben Protokolle zur Nutzung von mikrofluidischen Kokulturen des Tumor-Immunsystems in 2D- und 3D-Umgebungen, die mit einer dynamischen, multiparametrischen Überwachung zellulärer Funktionen kompatibel sind.

Mikrofluidische Co-Kulturmodelle zur Analyse der Immunantwort in in vitro Tumormikroumgebungen

Hier bieten wir einen mikrofluidischen Chip und ein automatisch gesteuertes, hocheffizientes Kreislauf-Mikrofluidsystem, das die anfängliche Mikroumgebung der Neovaskularisation rekapituliert und es ermöglicht, Endothelzellen (ECs) durch hohe Luminalscherspannung, physiologischen Transendothelfluss und verschiedene vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) gleichzeitig zu stimulieren.

Mikrofluidisches Modell zur Nachahmung des ersten Ereignisses der Neovaskularisation

Dieses Protokoll stellt ein physiologisch relevantes Tumor-on-a-Chip-Modell vor, um Hochdurchsatz-Grundlagen- und translationale Krebsforschung am Menschen durchzuführen und das Arzneimittel-Screening, die Krankheitsmodellierung und Ansätze der personalisierten Medizin mit einer Beschreibung von Lade-, Wartungs- und Bewertungsverfahren voranzutreiben.

Etablierung eines physiologischen humanen vaskularisierten Mikrotumormodells für die Krebsforschung

Hier stellen wir Protokolle vor, die Anweisungen für die Implementierung von 3D-Zellkulturen unter Verwendung von Kollagen- und Kollagen-Agarose-Matrizen in einem mikrophysiologischen System enthalten. Diese Protokolle unterstützen die Co-Kultur von Sphäroiden mit Nierentubuli und Nierenzellkarzinom, simulieren In-vivo-Bedingungen und ermöglichen eine fortschrittliche Untersuchung von Wechselwirkungen mit Nierenkrebszellen.

Mikrofluidische Co-Kultur von gesunder Niere und Tumorepithel zur Modellierung des Fortschreitens von Nierenkrebs

Erfahren Sie die Herstellung einer mikrofluidischen Vorrichtung zur Rekonstruktion von Tumor-Mikroumgebungen in vitro. Diese Methode ermöglicht präzise Tests von Chemotherapeutika in dreidimensionalen Geweben.

Mikrofluidik-Vorrichtung für die Neuerstellung eines Tumor-Mikroumgebung

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