Name: Mikrofluidik-Vorrichtung für die Neuerstellung eines Tumor-Mikroumgebung In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 18 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung einer mikrofluidischen Vorrichtung zur Rekonstruktion von Tumor-Mikroumgebungen in vitro. Diese Methode ermöglicht präzise Tests von Chemotherapeutika in dreidimensionalen Geweben.

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Diese Arbeit wurde durch die National Institutes of Health Grant # 1R01CA120825-01A1, die Collaborative Biomedical Research (CBR) Program an der University of Massachusetts Amherst und der Isenberg Stipendium für Bhushan J. Toley unterstützt. Wir danken den wertvollen Beitrag von James Schafer, der Videofilmer, Erzähler und Herausgeber dieses Videos.

Ein. Vorrichtung Fabrication Replikation von mikrofluidischen Merkmale in Elastomermaterialien wurde für das Verfahren von Duffy et al beschrieben ist. 1 <ol><li> Mix Elastomer (Polydimethylsiloxan; PDMS) und Härter aus der Silikon-Elastomer Kit (Dow Corning, Midland, MI) in einem 9:1 Gewichtsverhältnis und übergießen Sie den Master mit einem 4 mm dicken Schicht bilden. Entgasen zur Entfernung von Luftblasen und aushärten der Mischung bei 60 ° C für 5 Stunden. Peel gehärteten PDMS aus der Form, um einen Stempel Strömungsrichtung Merkmale auf dem Elastomer zu erhalten. </li><li> Stanzlöcher für Ein-und Auslässe mit einem 1,5 mm Biopsiestanze (Miltex, York, PA), die an einer Bohrmaschine. Ziehen Sie alle Fremdkörper. </li><li> Thema Die Funktionen Seite des Stempels und einer sauberen Glasobjektträger einem Sauerstoffplasma für 8 Minuten in einem Sauerstoffplasma Radierer. Bringen der behandelten Flächen in Kontakt sofort, um eine Bindung zwischen ihnen auszubilden. Pflegen Sie die Montage bei 60 ° C auf einer Folie wärmer für mindestens 5 Stundens zur Stärkung der Bindung. </li><li> Verbinden 0,032 "ID PTFE-Schlauch (Cole Parmer, Vernon Hills, IL) zu den Einlässen und Auslässen über eine Schnittstelle des männlichen Luer-Lock-Anschlüsse angebracht Widerhaken weiblichen Luer-Lock Verbinder (Qosina, Edgewood, NY). </li><li> Richten Sie die Fließmontage mit Absperrventilen und eine Y-Stecker (Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA; Abbildung 1). Montieren Sie das Gerät mit dem Mikroskop. Bringen Spritzen Schlauch mit 20G 1,5 "Nadeln (BD Bioscience, Rockville, MD). </li></ol> 2. Bildung Uniform Spheroids Sphäroide wurden von der hängenden Tropfen-Methode 2,3 gebildet. <ol><li> Trypsinieren Zellen unter einer sterilen Zellkultur Kapuze. </li><li> Zentrifuge trypsinierten Zellen bei 2000 rpm für 5 Minuten und resuspendieren in 6 ml frisches Medium. Verdünnen der Stammlösung zu einer gewünschten Endkonzentration (Tabelle 1). </li><li> Entfernen Sie den Deckel einer 48-Well-Platte und legen Sie sie kopfüber in die sterilized Kapuze. Circular entsprechenden Bereiche in jede Vertiefung sind auf dem Cover ersichtlich. Füllen Sie jede Vertiefung der Platte mit 1 ml sterilem Wasser Feuchtigkeit halten. Setzen Sie einen 20 ul Tropfen der verdünnten Zell-Lösung in jedem kreisförmigen Bereich mit einer Mikropipette. Sorgfältig invertieren Sie die Abdeckung und legen Sie es über den Well-Platte, so dass die Tropfen nicht berühren die Kanten der Brunnen. </li><li> Inkubieren der Mikrotiterplatte bei 37 ° C für eine bestimmte Anzahl von Tagen (Tabelle 1). Ein Sphäroid wird in jedem hängenden Tropfen bilden. </li></ol> 3. Einführung der Sphäroide in Device Siehe Abbildung 1 und Tabelle 2 für diesen Abschnitt Abbildung. <ol><li> Sterilisieren der Vorrichtung durch Spülen mit 70% Ethanol durch die Strömungseinlaß eingeführt. Anschließend bündig mit PBS gefolgt von HEPES gepufferte Zellkulturmedium. Lassen Sie das Medium Spritze S F an den Schläuchen. </li><li> Zeichnen 2-3 Sphäroide in die Spritze S P, tippen Spritze, um Luftblasen zu entfernen, undBefestigen der Verpackung Einlaß der Vorrichtung. </li><li> Offene Einlaßventil V Pin und enge V Fin. Geöffnete Auslassventil V Pout und enge V Fout. Halten Sie die Verpackung Spritze senkrecht mit der Nadel nach unten; zusehen, wie Sphäroide auf den Boden der Spritze niederlassen in den Luer-Lock-Anschluss der Nadel. Drücken Sie den Kolben auf der Verpackung Spritze und Uhr Sphäroide geben Sie den Schlauch und fließen in das Gerät. Weil nur die Packung Auslaßventil offen ist, wird ein Sphäroid die Kammer eintreten der Vorrichtung und durch Stützen auf der Rückseite (Fig. 2) erhalten. </li><li> Einlass schließen V Pin und Auslassventil V Pout. Montieren der Spritze S F auf einer Spritzenpumpe. Öffnen Sie das Ventil V Fin und Ventil V Fout. Fördermedium in das Gerät 3 ul / min. </li></ol> 4. Einleitung der Apoptose Erkennen Agent (CaspGLOW) Nach dem Packen Kammern mit Sphäroide erlauben Äquilibrierung für up bis 24 Stunden, um Nährstoff Gradienten und Mikroumgebungen herzustellen, vor dem Einführen Apoptose Nachweisen oder Therapeutika. Da die Gewebe in den Kammern in Kontakt mit undurchdringlichen Mauern von oben und unten sind, gibt es keine Nährstoff Gradienten entlang der Dicke (0,15 mm) des Gewebes. Nach 24 Stunden Inkubation werden alle Zellschichten entlang der Dicke des Gewebes entspricht mithin und die einzige Heterogenität ist in einer Richtung weg von dem Strömungskanal. <ol><li> Abgeschaltet V Fin, stoppen Sie die Spritzenpumpe Spritze abnehmen S F von der Pumpe und ersetzen sie durch eine Spritze mit Medium mit 0,25 ul / ml CaspGLOW Red Aktive Caspase-3 Marker (Red-DEVD-FMK; Biovision, Mountain View, CA). </li><li> Manuell bündig 0,7 ml dieser Lösung durch die Vorrichtung, um eine Verschiebung der älteren Medium zu gewährleisten. Montieren Sie die Spritze an der Pumpe, starten Flow und offenen V Fin. Über einen Zeitraum von 5-8 Stunden, Erfassen der Apoptose Agenten diffundiert in tEr Gewebe und fluoresziert heller apoptotischen Regionen. Apoptosis Sprühmittel bei dieser Konzentration wird in allen weiteren Workflow-Lösungen in das Gerät erhalten. </li></ol> Hinweis: <ol class="lroman"><li> Tissue Heterogenität kann durch den Erwerb lineare Intensitätsprofile der Fluoreszenz, wie in Abschnitt 6 beschrieben bestätigt werden. Die Profile sollten räumlichen Gradienten in der Apoptose zeigen, bestätigt, dass das Gewebe heterogen in Bezug auf die Lebensfähigkeit der Zellen ist. </li><li> CaspGLOW Grün Aktiv Caspase-3 Marker (Fluorescein-DEVD-FMK, Biovision) kann auch verwendet werden, um die Apoptose zu detektieren. Dieser Marker enthält das grüne Fluorophor Fluorescein anstelle des roten Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin. </li></ol> 5. Einführung des therapeutischen Wirkstoffs <ol><li> Befolgen Sie die Anweisungen in den Schritten 4,1-4,2 bis 10 uM Doxorubicinhydrochlorid (Dox, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) einzuführen, die Apoptose Sprühmittel. </li><li> Weiterhin Strömung des therapeUTIC Wirkstofflösung für eine feste Zeitspanne. Absperrventil V Fin und schalten Sie die Spritzenpumpe. Ersetzen der Behandlung Spritze mit einer Spritze, die frisches Medium Apoptose Nachweismittel. Erlauben Strömung von frischem Medium für 24 Stunden unter -36 kontinuierliches Überwachen des Gewebes unter dem Mikroskop. </li></ol> 6. Zeitraffer-Mikroskopie und Estimation of Drug Diffusivität Koeffizienten Zum Erhalten saubersten Fluoreszenzdaten, alle Bilder zu erwerben durch Fokussieren des Mikroskops auf die unteren Schichten von Geweben. Da es keine Nährstoff-Gradienten in vertikaler Richtung (siehe Abschnitt 4), sind die unteren Schichten von Zellen gute Vertreter aller anderen Schichten über. <ol><li> Die gesamte Übernahme-Prozess automatisiert wurde mithilfe einer angepassten Skript in IPLab (BD Bioscience, Rockville, MD). Erwerben Durchlicht und Fluoreszenz-Aufnahmen des verpackten Sphäroid bei 10facher Vergrößerung alle 30 Minuten (Abb. 3A). AcquirE ein Bild der Hintergrundfluoreszenz vor der Einführung Dox. Um nach der Größe der Kammer (x 1000 um 300 um) unterzubringen, zu erwerben zwei angrenzenden Bildern und überlappend, gemeinsam 4. </li><li> Für mathematische Schätzung Medikament Diffusivität Koeffizienten, ist der erste Schritt, um gemittelte linearen Intensitätsprofile Dox Fluoreszenz unter Verwendung ImageJ erzeugen. Wähle einen rechteckigen Bereich von Interesse (ROI), das die Gewebe in der Kammer. Verwenden der Plot Befehl Profil, ein Profil der mittleren Intensitäten als eine Funktion des Abstandes von dem Strömungskanal zu erzeugen. Wiederholen Sie dies für bis zu 3 verschiedenen Zeitpunkten. </li><li> Besorgen Sie sich eine Hintergrundfluoreszenz Bild vor Einführung Dox zur Autofluoreszenz aus dem Gewebe zu messen. Subtrahieren Sie die durchschnittliche Hintergrund Fluoreszenzintensität aus den erhaltenen Intensitätsprofile und normalisieren jedes Profil durch die entsprechende maximale Intensität zu erhalten <img src="/files/ftp_upload/2425/2425eq0.jpg" alt="c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="c"> (X, t) (Abb. 3B). </li><li> Der nächste Schritt ist, den effektiven Diffusionskoeffizienten D der Dox innerhalb Tumorgewebe auszuwerten. Dox Diffusion kann durch die folgende Gleichung 5 dargestellt werden <img src="/files/ftp_upload/2425/2425eq1.jpg" alt="Gleichung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Gleichung 1"> wobei die komplementäre erfc Fehlerfunktion ist, x Abstand in das Gewebe aus dem Kanal, und t die Zeit nach dem Einbringen Dox (s. Abbildung. 3). Verwenden Sie die folgenden iterativen Schema zu jedem Zeitpunkt in Betracht gezogen: <ul><li> Ratet mal, einen Wert für D </li><li> Berechnen rechten Seite der Gleichung an jedem Ort x </li><li> Berechnen der Summe der quadrierten Fehler (Rest-) zwischen den zwei Seiten </li><li> Ändern D den Rest-Minimierung </li></ul></li><li> Durchschnittlichen die optimalen Werte von D zu jedem Zeitpunkt erhalten, um die durchschnittliche effektive Diffusionskoeffizient Dox im Gewebe abzuschätzen. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: &lt;p class = "jove_content"&gt; Die Mikrofluidikeinheiten 1mm x 0.3mm x 0.15mm optisch zugänglichen Kultur Kammern für das Wachstum von dreidimensionalen Tumorgewebe. Vielzelligen Tumorsphäroide wurden in diesen Kammern geflogen und wurden durch zwei Filter Beiträge auf der Rückseite erhalten. Der hängende Tropfen Verfahren erlaubt schnelle Bildung von Sphäroiden konsistenter Größe und Form aus mehreren Zelllinien. Sphäroide wurden erfolgreich auf dem Gerät gewachsen für bis zu 3 Tage. Das Wachstum in den Kammern wurde mit einer reproduzierbaren Änderung Mikroumgebungen in Sphäroide verbunden. Apoptose in Zellen aufgetreten weniger in der Nähe des Strömungskanals und höheren tiefer in das Gewebe. Die Vorrichtung wurde verwendet, um den Diffusionskoeffizienten von Doxorubicin in Tumorgewebe zu schätzen. Der erhaltene Wert von 8,75 x 10 -7 cm 2 s -1 stimmt der Wert von 9,1 x 10 -7 cm 2 s -1 zuvor berichtet 6 in menschlichen Brustkrebszellen. <table border="1"><tbody><tr><td> Cell Line </td><td> Erforderliche Zellkonzentration </td><td> Inkubationszeit </td></tr><tr><td> LS174T </td><td> 300 Zellen / ul </td><td> 2-3 Tage </td></tr><tr><td> T47D </td><td> 750 Zellen / ul </td><td> 3-4 Tage </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 </td><td> 150 Zellen / ul </td><td> 5-6 Tage </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Parameter für hängenden Tropfen Spheroids <table border="1"><tbody><tr><td> Teil </td><td> Beschreibung </td></tr><tr><td> S F </td><td> Flow Spritze </td></tr><tr><td> S P </td><td> Verpackung Spritze </td></tr><tr><td> V Fin </td><td> Flow Einlassventil </td></tr><tr><td> V Pin </td><td> Verpackung Einlassventil </td></tr><tr><td> V Fout </td><td> Flow Auslassventil </td></tr><tr><td> V Pout </td><td> Verpackung Auslassventil </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Spritzen und Ventile in Flow-Setup <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1 Schematische Darstellung des Flow Setup V Fin und V Fout:. Flow-Einlass-und Auslassventile, V Pin und V Pout: Verpackung Einlass-und Auslassventile, S F und S P: Flow und Verpackung Spritzen. Die Verpackung Spritze und Verpacken und Auslaßventile werden verwendet, wenn ein Sphäroid in die Kammer geflogen wird. Die Strömung Spritze und Strömungseinlaß und Auslaßventile werden verwendet, um Medium anschließend fließen. <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Schema eines Sphäroids in einer Kammer auf der Vorrichtung gefangen. Ein Sphäroid in die Kammer auf der Vorrichtung durchströmt und durch zwei Filter blockiert posts an der Rückseite der Kammer. <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Doxorubicin Diffusion in Tumorgewebe auf dem Gerät. A. Zusammengeführt Durchlicht und rot fluoreszierenden Bild des Gewebes, des Standorts und der Konzentration von Doxorubicin (in rot). Maßstab stellt 250 um. B. Normalized lineare Intensität Profil von Doxorubicin Fluoreszenz.

<ol><li>Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Prototyping+of+Microfluidic+Systems+in+Poly%28dimethylsiloxane%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane).</a> Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).</li>
<li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnol. Bioeng. 83, 173-180 (2003).</li>
<li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Methods. Mol. Med. 140, 141-151 (2007).</li>
<li>Kasinskas, R. W., Forbes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+specifically+chemotax+and+proliferate+in+heterogeneous+tumor+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium specifically chemotax and proliferate in heterogeneous tumor tissue in vitro.</a> Biotechnol. Bioeng. 94, 710-721 (2006).</li>
<li>Walsh, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multipurpose+microfluidic+device+designed+to+mimic+microenvironment+gradients+and+develop+targeted+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">A multipurpose microfluidic device designed to mimic microenvironment gradients and develop targeted cancer therapeutics.</a> Lab. Chip. 9, 545-554 (2009).</li>
<li>Lankelma, J., Fernandez Luque, R., Dekker, H., Schinkel, W., Pinedo, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mathematical+model+of+drug+transport+in+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">A mathematical model of drug transport in human breast cancer.</a> Microvasc. Res. 59, 149-161 (2000).</li>
<li>Less, J. R., Skalak, T. C., Sevick, E. M., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+architecture+in+a+mammary+carcinoma%3A+branching+patterns+and+vessel+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Microvascular architecture in a mammary carcinoma: branching patterns and vessel dimensions.</a> Cancer. Res. 51, 265-273 (1991).</li>
<li>Brown, J. M., Giaccia, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unique+physiology+of+solid+tumors%3A+opportunities+%28and+problems%29+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">The unique physiology of solid tumors: opportunities (and problems) for cancer therapy.</a> Cancer. Res. 58, 1408-1416 (1998).</li>
<li>Thomlinson, R. H., Gray, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histological+structure+of+some+human+lung+cancers+and+the+possible+implications+for+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy.</a> Br. J. Cancer. 9, 539-549 (1955).</li>
<li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+penetration+in+solid+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drug penetration in solid tumours.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Das Gefäßsystem in Tumoren ist spärlich und schlecht entwickelten 7,8. Es gibt Regionen weit (&gt; 100 um) aus den Blutgefäßen, die unzugänglich Nährstoffe und Medikamente obwohl das Gefäßsystem 9 zugeführt werden entfernt. Die resultierende heterogene Mikroumgebung trägt zur begrenzten Wirksamkeit vieler Chemotherapeutika 10. Die Mikrofluidvorrichtung hier entwickelten erschafft ein heterogenes Tumormikroumgebung durch proliferierende, ruhende und apoptotischen oder nekrotischen Zellen ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Namen Reagenz </th><th> Firma </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Silikon-Elastomer-Kit </td><td> Ellsworth Adhesives </td><td> 184 Sil Elast Kit </td><td></td></tr><tr><td> Miltex Biopsiestanze </td><td> MedexSupply </td><td> MTX-33-31aa </td><td> 1,5 mm </td></tr><tr><td> PTFE-Schlauch </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06.417-31 </td><td> 0,032 &quot;ID </td></tr><tr><td> Luer-Lock-Anschluss </td><td> Qosina </td><td> 65111 </td><td></td></tr><tr><td> Barbed weiblichen Luer-Lock-Anschluss </td><td> Qosina </td><td> 11556 </td><td></td></tr><tr><td> Absperrventil </td><td> IDEX Health and Science </td><td> P-721 </td><td></td></tr><tr><td> Y-Verbinder </td><td> IDEX Health and Science </td><td> P-513 </td><td></td></tr><tr><td> 20G 1,5 &quot;Nadeln </td><td> BD Bioscience </td><td> 305176 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H-4034 </td><td></td></tr><tr><td> CaspGLOW Fluorescein </td><td> Biovision </td><td> K183-25 </td><td></td></tr><tr><td> CaspGLOW Red </td><td> Biovision </td><td> K193-25 </td><td></td></tr><tr><td> Doxorubicinhydrochlorid </td><td> Sigma </td><td> 44583 </td><td></td></tr><tr><td> LS174T </td><td> ATCC </td><td> CCL-188 </td><td> Menschliche Koloncarcinomzelllinie </td></tr><tr><td> T47D </td><td> ATCC </td><td> HTB-133 </td><td> Menschliche duktales Karzinom-Zelllinie </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 </td><td> ATCC </td><td> HTB-26 </td><td> Menschlichen Mamma-Adenokarzinom-Zelllinie </td></tr></tbody></table>

mikrofluidik-vorrichtung für die neuerstellung eines tumor-mikroumgebung<em&gt; in vitro</em

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Wir haben eine Mikrofluidik-Vorrichtung, die die Lieferung und die systemische Clearance von Medikamenten zur heterogenen dreidimensionalen Tumorgewebe in vitro imitiert entwickelt. Nährstoffen durch Vaskulatur geliefert fehlschlagen, alle Teile von Tumoren zu erreichen, was zu heterogenen Mikroumgebungen bestehend aus lebensfähigen, Ruhestrom und nekrotischen Zelltypen. Viele Krebsmedikamente nicht effektiv durchdringen und behandeln alle Arten von Zellen, weil dieser Heterogenität. Monoschichten von Krebszellen nicht nachzuahmen diese Heterogenität, was es schwierig macht Krebsmedikamente mit einem geeigneten in vitro-Modell zu testen. Unsere mikrofluidischen Bauteilen wurden aus PDMS hergestellt mit weichen Lithographie. Vielzelligen Tumorsphäroide, durch den hängenden Tropfen-Verfahren gebildet wurden eingesetzt und in rechteckige Kammern auf der Vorrichtung eingespannt und gehalten mit Endlosmediums Perfusion auf einer Seite. Die rechteckige Form der Kammern auf dem Gerät erstellt lineare Gradienten im Gewebe. Fluoreszenzfarbstoffe wurden verwendet, um th zu quantifizierene Variabilität Apoptose innerhalb Gewebe. Tumore auf der Vorrichtung wurden mit dem fluoreszierenden Chemotherapeutikum Doxorubicin, Zeitraffer-Mikroskopie wurde verwendet, um ihre Diffusion in Gewebe zu überwachen, und der effektive Diffusionskoeffizient wurde geschätzt behandelt. Die hängenden Tropfen Methode erlaubt schnelle Bildung einer einheitlichen Sphäroide aus mehreren Krebszelllinien. Das Gerät aktiviert Wachstum von Sphäroiden für bis zu 3 Tage. Cells in der Nähe des strömenden Mediums waren minimal apoptotischen und die weit aus dem Kanal waren apoptotische und damit exakt imitiert Regionen in Tumoren neben Blutgefäße. Der geschätzte Wert des Doxorubicin Diffusionskoeffizient vereinbarten mit einem zuvor gemeldeten Wert in menschlichen Brustkrebszellen. Da die Penetration und Retention von Drogen in soliden Tumoren wirkt sich auf ihre Wirksamkeit, glauben wir, dass dieses Gerät ein wichtiges Instrument zum Verständnis des Verhaltens von Drogen, und die Entwicklung neuer Krebstherapeutika ist.

Wir präsentieren, das Verfahren für die Herstellung und den Betrieb einer mikrofluidischen Vorrichtung, die heterogene Tumor Mikroumgebungen nachbildet<em&gt; In vitro</em&gt;. Die Variabilität in der Apoptose in Tumorgewebe wurde quantifiziert mit Fluoreszenzfarbstoffen und die effektive Diffusionskoeffizient des Chemotherapeutikum Doxorubicin in Tumorgewebe wurde ausgewertet.

Mikrofluidik-Vorrichtung für die Neuerstellung eines Tumor-Mikroumgebung<em&gt; In Vitro</em

Wir haben ein mikrofluidisches System entwickelt, welches die Verabreichung und die systemische Clearance von Arzneimitteln in heterogenen dreidimensionalen Tumorgeweben in ... nachahmt.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Herstellung und den Betrieb eines mikrofluidischen Geräts zu demonstrieren, das Tumormikroumgebungen in vitro nachbildet und zur Testung chemotherapeutischer Wirkstoffe verwendet werden kann. Dies ist das mikrofluidische Gerät. Dieses Gerät kann in folgenden Bereichen nützlich sein: einfache Testung chemotherapeutischer Wirkstoffe in vitro.Es liefert konsistente und genaue Ergebnisse für die Untersuchung von dreidimensionalem Tumorgewebe, und dieses Gerät ermöglicht eine sehr genaue Darstellung des Tumors in vivo. Tumore existieren in 3D-Mikroumgebungen, und die Möglichkeit, in solchen zu testen, ist von großer Bedeutung. Der erste Schritt des Verfahrens besteht darin, das Gerät zusammenzubauen, was die Herstellung eines mikrofluidischen Chips mittels weicher Lithographie, das Stanzen von Löchern an den Einlässen und Auslässen, das Verbinden mit einem Objektträger und das Anschließen von Schläuchen für den Durchfluss an Ein- und Auslass beinhaltet.Anschließend werden mithilfe der Hängetropfen-Methode uniforme multizelluläre Tumorsphäroide zur Verwendung im Gerät erzeugt. Die Sphäroide werden dann in das Gerät eingebracht,

microfluidic-device-for-recreating-a-tumor-microenvironment-in-vitro

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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Erzeugung von Mikrotumoren: Eine In-vitro-Kulturtechnik zur Kultivierung von 3D-Mikrotumoren zur Analyse des Ansprechens auf eine medikamentöse Behandlung

Methoden, um menschliche 3D-Tumorgewebe als Testsysteme zu erstellen beschrieben. Diese Techniken basieren auf einer dezellularisierten Biologische Vaskularisierte Gerüst (BioVaSc), primäre menschliche Zellen und einer Tumor-Zellinie, die unter statischen als auch unter dynamischen Bedingungen in einer Strömungs Bioreaktor kultiviert werden können, basieren.

Tissue Engineering eines Menschen 3D<em&gt; In-vitro-</em&gt; Tumor-Testsystem

Wir haben einen durchlässigen mikroporösen Membraneinsatz angepasst, um die Tumormikroumgebung (TME) nachzuahmen. Das Modell besteht aus einer gemischten Zellkultur, ermöglicht die vereinfachte Generierung hochangereicherter individueller Zellpopulationen ohne Verwendung von Fluoreszenzmarkierung oder Zellsortierung und ermöglicht die Untersuchung der interzellulären Kommunikation innerhalb der TME unter Normal- oder Stressbedingungen.

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Erzeugung dynamischer Umgebungsbedingungen mit einem hochdurchsatzstarken mikrofluidischen Gerät

Im Zeitalter der Immuntherapie und des genomischen Profilings von Einzelzellen erfordert die Krebsbiologie neuartige In-vitro- und Computerwerkzeuge, um die Tumor-Immun-Schnittstelle in einem geeigneten raumzeitlichen Kontext zu untersuchen. Wir beschreiben Protokolle zur Nutzung von mikrofluidischen Kokulturen des Tumor-Immunsystems in 2D- und 3D-Umgebungen, die mit einer dynamischen, multiparametrischen Überwachung zellulärer Funktionen kompatibel sind.

Mikrofluidische Co-Kulturmodelle zur Analyse der Immunantwort in in vitro Tumormikroumgebungen

Hier bieten wir einen mikrofluidischen Chip und ein automatisch gesteuertes, hocheffizientes Kreislauf-Mikrofluidsystem, das die anfängliche Mikroumgebung der Neovaskularisation rekapituliert und es ermöglicht, Endothelzellen (ECs) durch hohe Luminalscherspannung, physiologischen Transendothelfluss und verschiedene vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) gleichzeitig zu stimulieren.

Mikrofluidisches Modell zur Nachahmung des ersten Ereignisses der Neovaskularisation

Dieses Protokoll stellt ein physiologisch relevantes Tumor-on-a-Chip-Modell vor, um Hochdurchsatz-Grundlagen- und translationale Krebsforschung am Menschen durchzuführen und das Arzneimittel-Screening, die Krankheitsmodellierung und Ansätze der personalisierten Medizin mit einer Beschreibung von Lade-, Wartungs- und Bewertungsverfahren voranzutreiben.

Etablierung eines physiologischen humanen vaskularisierten Mikrotumormodells für die Krebsforschung

Hier stellen wir Protokolle vor, die Anweisungen für die Implementierung von 3D-Zellkulturen unter Verwendung von Kollagen- und Kollagen-Agarose-Matrizen in einem mikrophysiologischen System enthalten. Diese Protokolle unterstützen die Co-Kultur von Sphäroiden mit Nierentubuli und Nierenzellkarzinom, simulieren In-vivo-Bedingungen und ermöglichen eine fortschrittliche Untersuchung von Wechselwirkungen mit Nierenkrebszellen.

Mikrofluidische Co-Kultur von gesunder Niere und Tumorepithel zur Modellierung des Fortschreitens von Nierenkrebs

Erfahren Sie die Herstellung einer mikrofluidischen Vorrichtung zur Rekonstruktion von Tumor-Mikroumgebungen in vitro. Diese Methode ermöglicht präzise Tests von Chemotherapeutika in dreidimensionalen Geweben.

Mikrofluidik-Vorrichtung für die Neuerstellung eines Tumor-Mikroumgebung

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