Mikrofluidik-Vorrichtung für die Neuerstellung eines Tumor-Mikroumgebung In Vitro

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Herstellung und den Betrieb eines mikrofluidischen Geräts zu demonstrieren, das Tumormikroumgebungen in vitro nachbildet und zur Prüfung chemotherapeutischer Wirkstoffe verwendet werden kann. Dies ist das mikrofluidische Gerät. Dieses Gerät kann in folgenden Bereichen nützlich sein: einfache Prüfung chemotherapeutischer Wirkstoffe in vitro.

Es liefert konsistente und genaue Ergebnisse für die Untersuchung dreidimensionaler Tumorgewebe, und dieses Gerät bietet eine sehr genaue Darstellung eines in-vivo-Tumors. Tumormikroumgebungen existieren in 3D-Mikroumgebungen, und die Möglichkeit, darin Tests durchzuführen, ist von großer Bedeutung. Der erste Schritt des Verfahrens besteht darin, das Gerät zusammenzubauen, was die Herstellung eines mikrofluidischen Chips mittels weicher Lithografie, das Stanzen von Löchern an den Einlässen und Auslässen, das Verbinden mit einem Objektträger sowie das Anschließen von Schläuchen für den Durchfluss-Einlass und -Auslass umfasst.

Anschließend werden mithilfe der Hängetropfen-Methode einheitliche multizelluläre Tumorsphäroide zur Verwendung im Gerät erzeugt. Die Sphäroide werden dann in das Gerät eingebracht, gefolgt von Apoptose detektierenden Substanzen und chemotherapeutischen Wirkstoffen. Schließlich erfolgt eine Zeitraffer-Mikroskopie, anschließend eine mathematische Schätzung der Diffusionskoeffizienten des Wirkstoffs, um die Penetrationsfähigkeit des chemotherapeutischen Agents zu quantifizieren.

Schließlich können Ergebnisse erzielt werden, die das Gewebewachstum im Gerät, die Bildung heterogener Mikroumgebungen innerhalb des Gewebes sowie die Diffusion von Wirkstoffen in das Gewebe mittels zeitraffender Fluoreszenzmikroskopie zeigen. Eine begrenzte Penetration von Krebsmedikamenten in solide Tumore ist eine wichtige Ursache für deren Versagen. Die meisten derzeitigen Modelle zur Prüfung von Krebsmedikamenten bilden die dreidimensionale Natur solider Tumore nicht nach.

Wir haben ein mikrofluidisches Gerät entwickelt, das aus kontinuierlich perfundierten dreidimensionalen Tumorgeweben besteht. Dieses Modell stellt die Abgabe von Wirkstoffen an solide Tumore und deren systemische Clearance genauer dar. Multizelluläre Tumorsphäroide sind ein etabliertes Modell für dreidimensionales Tumorgewebe.

Bei diesem Verfahren wird die Hänge-Tropfen-Methode verwendet, um Steroide für die Anwendung in der mikrofluidischen Vorrichtung herzustellen. Diese Methode ermöglicht die Bildung einheitlicher Steroide in kurzer Zeit. Die Untersuchung chemotherapeutischer Wirkstoffe in vitro in dreidimensionalem Gewebe kann helfen, Wirkstoffe effizienter zu screenen als mit Zell-Monolagen.

Mischen Sie PDMS und Härter aus dem Silikonelastomer im Gewichtsverhältnis neun zu eins. Gießen Sie dann diese Mischung über den Master, um eine vier Millimeter dicke Gießform herzustellen. Um Luftblasen zu entfernen, 5 Stunden bei 60 Grad Celsius aushärten.

Lösen Sie das ausgehärtete PDMS von der Form, um einen Stempel mit Strömungsstrukturen auf dem Elastomer zu erhalten. Verwenden Sie dann eine 1,5 mm große Biopsiepunchvorrichtung, die an einem Bohrer befestigt ist, um Löcher für Zulauf- und Ablauföffnungen zu stanzen. Entfernen Sie alle Rückstände.

Unterziehen Sie die strukturierte Seite des Stempels und eine saubere Glasobjektträgerplatte acht Minuten lang einer Sauerstoff-Plasmabehandlung. Bringen Sie die behandelten Oberflächen in einem Sauerstoff-Plasmaätzer unmittelbar in Kontakt, um eine Bindung zwischen ihnen zu erzeugen. Halten Sie die Zusammenstellung mindestens fünf Stunden lang bei 60 Grad Celsius auf einem Objektträgerwärmer.

Um die Verbindung zu verstärken, schließen Sie PTFE-Schläuche mit einem Innendurchmesser von 0,032 Zoll an die Ein- und Ausgänge des mikrofluidischen Geräts an. Mithilfe einer Schnittstelle aus männlichen Luer-Lock-Steckern, die an konische weibliche Luer-Lock-Verbinder angeschlossen sind, können diese spezifischen Verbinder leicht durchgeführt werden, ohne zu brechen. Richten Sie abschließend die Durchflussanordnung mit Absperrventilen und einem Y-Verbinder ein und montieren Sie das Gerät am Mikroskop. Nach der Montage des Geräts verbinden Sie die Schläuche mit den entsprechenden Ein- und Ausgängen, um die Durchflussanordnung abzuschließen.

Wie in dieser Abbildung gezeigt, ermöglicht diese Konfiguration eine einfache und vielseitige Befüllung eines Sphäroides in das Gerät oder Erzeugung eines Mediumstroms durch das Gerät zum Befüllen. Öffnen Sie das Zulaufventil VPN und das Ablaufventil VP, um den Tumor abzulassen. Anschließend kann OID durch den Zulauf eintreten und in die Kulturkammer strömen, wo die Säule in dieser Kammer den Tumor fixiert und den Mediumfluss ermöglicht.

Schließen Sie die Packventile und öffnen Sie das Einlassventil VF in und das Auslassventil VF out, um die Bildung eines homogenen PHE einzuleiten. Verwenden Sie die Hängentropfen-Methode, um Trypsin-Eiskulturen unter einem Zellkulturhauben abzutrennen. Entnehmen Sie die resultierenden Trypsin-behandelten Zellen aus der Zentrifuge.

Verdünnen Sie die Stammlösung entsprechend Tabelle eins auf die gewünschte Konzentration. Entfernen Sie danach den Deckel einer 48-Loch-Platte und stellen Sie ihn verkehrt herum ab. Füllen Sie im sterilen Gehäuse jedes Loch der Platte mit einem Milliliter sterilisiertem Wasser.

Um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten, geben Sie einen 20-Mikroliter-Tropfen verdünnte Zelllösung in jeden kreisförmigen Bereich auf der Deckplatte. Drehen Sie die Deckplatte vorsichtig mit einer Mikropipette um und platzieren Sie sie über die Platte, wobei sichergestellt werden muss, dass die Tropfen die Ränder der Vertiefungen nicht berühren. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius.

Beziehen Sie sich auf Tabelle eins hinsichtlich der Inkubationsdauer, die je nach verwendeter Zellart variiert; in jedem Hängetropfen bildet sich ein Steroid. Beginnen Sie damit, das Gerät zu sterilisieren, indem Sie es über den Durchflusszulauf mit 70 %igem Ethanol spülen. Anschließend spülen Sie nacheinander mit PBS und anschließend mit H-E-P-E-S-puffermedium für die Zellkultur.

Lassen Sie die mittlere Spritze an das Schlauchsystem angeschlossen. Ziehen Sie anschließend zwei bis drei Steroide in den Anschluss der Spritze. Um Luftblasen zu entfernen, verbinden Sie die Spritze mit dem Packeinlass des Geräts.

Öffnen Sie das Einlassventil VPN und schließen Sie VFN. Öffnen Sie das Auslassventil VP out und schließen Sie VF out. Halten Sie die Packungspritze senkrecht mit der Nadel nach unten gerichtet. Beobachten Sie, wie sich das Steroid am Boden der Spritze im Luer-Lock-Anschluss der Nadel absetzt.

Drücken Sie den Kolben der Packungsspritze und beobachten Sie, wie PHE in die Tubing gelangt und in das Gerät fließt, da nur das Auslassventil für die Packung geöffnet ist. Ein Steroid tritt in die Kammer des Geräts ein und wird durch Stifte an der Rückseite zurückgehalten. Sobald sich der S-Sphäroid innerhalb der Kammer befindet, passt er sich der Form der Kammer an und nimmt eine rechteckige Geometrie an.

Schließen Sie das Einlassventil VPN und das Auslassventil VP, und montieren Sie die Fluss-Spritze SF auf der Spritzenpumpe. Diese Pumpe wird von einem Computer gesteuert, der die Spritzenpumpe betreibt. Öffnen Sie das Einlassventil VFN und das Auslassventil VF, und beginnen Sie den Fluss des Mediums in das Gerät mit drei Mikrolitern pro Minute.

Die Inkubation des Sphäroids für 24 Stunden wird gefolgt von der Zugabe von Apoptose-Detektionsmitteln. Bevor Apoptose-, Detektions- oder therapeutische Mittel zugegeben werden, sollte das Sphäroid bis zu 24 Stunden zur Herstellung von Nährstoffgradienten und Mikroumgebungen im Gleichgewicht einstellen. Danach Ventil VFN schließen.

Stoppen Sie die Spritzenpumpe. Entfernen Sie die Spritze von der Pumpe und ersetzen Sie sie durch die Spritze mit Medium, das 0,25 Mikroliter pro Milliliter CASP Glow Red aktives Caspase-3-Marker enthält. Spülen Sie das Gerät manuell mit 0,7 Milliliter dieser Lösung durch.

Danach die Spritze an der Pumpe befestigen. Den Fluss neu starten und das Ventil VFN öffnen. Über einen Zeitraum von fünf bis acht Stunden diffundiert die aktive CPH-Phase drei schrittweise in das Gewebe und fluoresziert stärker in apoptotischen Bereichen. Das Apoptose-Detektionsmittel wird in dieser Konzentration in allen nachfolgenden Flüssigkeitsdurchflüssen beibehalten.

Doxorubicin wird fünf bis acht Stunden nach der Gabe von Apoptose-Detektionsmitteln zugegeben. Diese Behandlung wird durch Spülen aus dem System entfernt. Um chemotherapeutische Wirkstoffe hinzuzufügen, folgen Sie dem Verfahren zur Apoptose-Detektion, um 10 Mikromolar Doxorubicinhydrochlorid zuzugeben.

Danach ersetzen Sie die Behandlungsspritze durch eine Spritze mit 0,7 Milliliter Medium. Setzen Sie den Fluss des therapeutischen Wirkstoffs über einen festgelegten Zeitraum fort. Schließen Sie danach das Ventil VFN und schalten Sie die Spritzenpumpe aus.

Entfernen Sie die Behandlungsspritze aus der Spritzenpumpe und ersetzen Sie sie durch eine Spritze mit 0,7 Millilitern Medium. Lassen Sie frisches Medium 24 bis 36 Stunden lang fließen, während Sie das Gewebe kontinuierlich unter einem Mikroskop überwachen. Der gesamte Erfassungsprozess für die Zeitraffermikroskopie wurde mithilfe eines angepassten Skripts in IP Lab automatisiert, wobei alle 30 Minuten transmitted-light- und Fluoreszenzbilder des PAX Foid mit 10-facher Vergrößerung aufgenommen wurden. Für die mathematische Abschätzung der Diffusionskoeffizienten von Wirkstoffen besteht der erste Schritt darin, mittlere lineare Intensitätsprofile der Docs-Fluoreszenz mithilfe von ImageJ zu erzeugen. Wählen Sie einen rechteckigen Bereich von Interesse (ROI), der das Gewebe in der Kammer umfasst.

Verwenden Sie den Befehl „Profil plotten“, um ein Profil der durchschnittlichen Intensitäten in Abhängigkeit vom Abstand zum Strömungskanal zu erstellen. Wiederholen Sie dies für bis zu drei verschiedene Zeitpunkte. Subtrahieren Sie anschließend die durchschnittliche Hintergrundfluoreszenzintensität von den erhaltenen Intensitätsprofilen und normalisieren Sie jedes Profil mithilfe der entsprechenden Maximalintensität, um C als Funktion von X und T zu erhalten. Dabei ist C die normierte Konzentration von Doxorubicin, deren Wert zwischen null und eins variiert.

Der nächste Schritt besteht darin, den effektiven Diffusionskoeffizienten von docs im Tumorgewebe docs zu bewerten. Die Diffusion kann durch die folgende Gleichung dargestellt werden, wobei ERFC die komplementäre Fehlerfunktion ist. X ist der Abstand in das Gewebe hinein, ausgehend vom Kanal, und T ist die Zeit nach der Zugabe von Doxorubicin.

Verwenden Sie das folgende iterative Schema zu jedem betrachteten Zeitpunkt. Schätzen Sie einen Wert für D. Berechnen Sie die rechte Seite der Gleichung an jeder Position. X. Berechnen Sie die Summe der quadrierten Abweichungen zwischen den beiden Seiten und verändern Sie D, um den durchschnittlichen Restfehler zu minimieren.

Die optimalen Werte von D, die zu jedem Zeitpunkt ermittelt wurden, dienen der Abschätzung des durchschnittlichen effektiven Diffusionskoeffizienten von Doxorubicin im Gewebe. Die mikrofluidischen Vorrichtungen verfügten über optisch zugängliche Kulturgefäße mit Abmessungen von einem Millimeter mal 0,3 Millimeter mal 0,15 Millimeter zur Züchtung dreidimensionaler Tumorgewebe. Die Hängetropfen-Methode ermöglichte eine schnelle Bildung von Tumor-PHEs mit konsistenter Größe und Form aus mehreren Zelllinien.

PHE wurden erfolgreich bis zu drei Tage lang auf dem Gerät kultiviert. Das Wachstum in den Kammern war mit einer reproduzierbaren Modifikation der Mikroumgebungen verbunden. Innerhalb der PHE trat Apoptose seltener in Zellen auf, die in unmittelbarer Nähe zum Strömungskanal lagen, und war höher und tiefer im Gewebe ausgeprägt.

Mit dem Gerät wurde der Diffusionskoeffizient von Doxorubicin und Tumorgewebe geschätzt. Der experimentell erhaltene Wert stimmte mit dem zuvor bei menschlichem Brustkrebs berichteten Wert überein. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist besondere Vorsicht erforderlich, um die Sterilität während des Einleitens von PHE in das Gerät aufrechtzuerhalten, da dieser Schritt außerhalb der Zellkultur durchgeführt werden muss.

Besprühen Sie die Spritzenaufsätze und Tubingenden großzügig mit Ethanol, um Sterilität zu gewährleisten. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein Verständnis für die begrenzte Penetration von Wirkstoffen in Tumore haben. Wir haben eine Technik demonstriert, um die Zufuhr und systemische Clearance von Wirkstoffen an dreidimensionalen Tumorgeweben nachzuahmen und deren Penetration zu quantifizieren.

Die Eliminierung schlecht durchdringender Arzneistoffe wird den Prozess der Krebsmedikamentenentwicklung erheblich beschleunigen.