Mikrofluidik-Vorrichtung für die Neuerstellung eines Tumor-Mikroumgebung In Vitro

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Herstellung und den Betrieb eines mikrofluidischen Geräts zu demonstrieren, das Tumormikroumgebungen in vitro nachbildet und zum Testen von Chemotherapeutika verwendet werden kann. Dies ist das mikrofluidische Gerät. Dieses Gerät kann in den folgenden Bereichen nützlich sein, einfache Tests auf Chemotherapeutika in vitro.

Es liefert konsistente und genaue Ergebnisse für die Untersuchung von dreidimensionalem Tumorgewebe und bietet eine sehr genaue Darstellung von In-vivo-Tumoren. Mikroumgebungen Tumore existieren in 3D-Mikroumgebungen, und die Möglichkeit, in einer Mikroumgebung zu testen, ist von Bedeutung. Der erste Schritt des Verfahrens besteht darin, das Gerät zusammenzubauen, was die Herstellung eines mikrofluidischen Chips mittels weicher Lithographie, das Stanzen von Löchern an den Ein- und Ausgängen, das Verkleben mit einem Glasschieber und das Verbinden von Schläuchen für den Durchflusseinlass und -auslass umfasst.

Als nächstes werden die einheitlichen mehrzelligen Tumorsteroide für die Verwendung in dem Gerät unter Verwendung der Hanging Drop-Methode erzeugt. Die Sphäroide werden dann in das Gerät eingeführt, gefolgt von Apoptose, Nachweismitteln und Chemotherapeutika. Schließlich wird eine Zeitraffermikroskopie durchgeführt, gefolgt von einer mathematischen Schätzung der Diffusivitätskoeffizienten des Arzneimittels, um die Penetrationsfähigkeit des Chemotherapeutikums zu quantifizieren.

Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die das Gewebewachstum bei der Bildung heterogener Mikroumgebungen innerhalb des Gewebes und die Diffusion des Wirkstoffs in das Gewebe durch den Einsatz der Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie zeigen. Das begrenzte Eindringen von Krebsmedikamenten in solide Tumore ist eine wichtige Ursache für deren Versagen. Die meisten aktuellen Modelle zur Untersuchung von Krebsmedikamenten ahmen die dreidimensionale Natur solider Tumore nicht nach.

Wir haben ein mikrofluidisches Gerät entwickelt, das aus kontinuierlich durchblutetem dreidimensionalem Tumorgewebe besteht. Dieses Modell stellt die Verabreichung von Medikamenten an solide Tumore und deren systemische Beseitigung genauer dar. Multizelluläre Tumorsteroide sind ein gut etabliertes Modell für dreidimensionale Tumorgewebe

Bei diesem Verfahren wird die Hanging Drop-Methode verwendet, um Steroide für die Verwendung in dem mikrofluidischen Gerät herzustellen. Diese Methode ermöglicht die Bildung konsistenter Steroide in kurzer Zeit. Das Testen von Chemotherapeutika in vitro in dreidimensionalem Gewebe kann dazu beitragen, im Vergleich zu Monolayern von Zellen effizienter nach Medikamenten zu suchen.

Mischen Sie das PDMS und das Härter aus dem Silikonelastomer in einem Gewichtsverhältnis von neun zu eins. Gießen Sie diese Mischung dann über den Master, so dass ein vier Millimeter dicker Blend-Degas entsteht. Um Luftblasen zu entfernen, fünf Stunden bei 60 Grad Celsius aushärten.

Schälen Sie das ausgehärtete PDMS aus der Form, um einen Stempel der Fließmerkmale auf dem Elastomer zu erhalten. Drücken Sie dann mit einem eineinhalb Millimeter Biopsiestempel, der auf einem Bohrer montiert ist, Stanzlöcher für Ein- und Auslässe. Ziehe alle Ablagerungen heraus.

Setzen Sie die Merkmalsseite des Stempels und einen sauberen Objektträger acht Minuten lang Sauerstoffplasma aus. In einem Sauerstoff-Plasmaätzer bringen Sie die behandelten Oberflächen sofort in Kontakt, um eine Verbindung zwischen ihnen zu bilden. Halten Sie die Montage mindestens fünf Stunden lang bei 60 Grad Celsius auf einem Diawärmer.

Um die Verbindung zu verstärken, schließen Sie einen PTFE-Schlauch mit einem Innendurchmesser von 0,032 Zoll an die Ein- und Auslässe des mikrofluidischen Geräts an. Durch die Verwendung einer Schnittstelle von männlichen Köderschloss-Anschlüssen, die an weiblichen Köderschloss-Anschlüssen mit Widerhaken befestigt sind, werden diese speziellen Steckverbinder verwendet, um sie leicht passieren zu können, ohne zu brechen. Richten Sie abschließend die Durchflussarmatur mit Absperrventilen und einem Y-Anschluss ein und montieren Sie das Gerät auf das Mikroskop. Verbinden Sie nach der Montage des Geräts die Schläuche mit den entsprechenden Ein- und Auslässen, um die Durchflusseinrichtung abzuschließen.

Wie in dieser Abbildung gezeigt, ermöglicht diese Konfiguration die Leichtigkeit und Vielseitigkeit, ein Sphäroid in das Gerät zu packen oder einen Medienfluss durch das zu verpackende Gerät zu erzeugen. Öffnen Sie das Packungseinlassventil VPN und das Packungsauslassventil VP aus einem Tumor. OID kann dann durch den Einlass gelangen und in die Kulturkammer fließen, wo der Pfosten in dieser Kammer den Tumor an Ort und Stelle hält, um das Medium zu durchströmen.

Schließen Sie die Packungsventile und öffnen Sie das Durchflusseinlassventil VF nach innen und das Durchflussauslassventil VF heraus, um die Bildung eines gleichmäßigen PHE einzuleiten. Mit der Hanging Drop-Methode Trypsin-Eiszellen unter einer Kulturhaube. Entnehmen Sie die entstandenen Trypsinzellen aus der Zentrifuge.

Verdünnen Sie die Stammlösung auf eine gewünschte Konzentration, indem Sie sich auf die erste Tabelle beziehen. Entfernen Sie als Nächstes die Abdeckung einer 48-Well-Platte und stellen Sie sie auf den Kopf. Füllen Sie in einer sterilisierten Haube jede Vertiefung der Platte mit einem Milliliter sterilisiertem Wasser.

Um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten, geben Sie einen 20-Mikroliter-Tropfen verdünnte Zelllösung in jeden kreisförmigen Bereich der Abdeckung. Drehen Sie den Deckel mit einer Mikropipette vorsichtig um und legen Sie ihn über die Platte, wobei Sie darauf achten, dass Tropfen Berühren Sie nicht die Ränder der Vertiefungen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius.

In Tabelle eins finden Sie für die Dauer der Inkubation je nach verwendeter Zelle ein Steroid in jedem hängenden Tropfen. Beginnen Sie mit der Sterilisation des Geräts, indem Sie es mit 70% Ethanol durch den Strömungseinlass spülen. Anschließend spülen Sie jeweils PBS und dann H-E-P-E-S gepuffertes Zellkulturmedium.

Lassen Sie die Mediumspritze und befestigen Sie sie am Schlauch. Ziehen Sie als nächstes zwei bis drei Steroide in die Spritzenhahnspritze. Um Luftblasen zu entfernen, befestigen Sie die Spritze am Packungseinlass des Geräts.

Öffnen Sie das Einlassventil VPN und schließen Sie VFN, öffnen Sie das Auslassventil VP out und schließen Sie VF out. Halten Sie die Packungsspritze senkrecht und zeigen Sie mit der Nadel nach unten. Beobachten Sie, wie sich das Steroid am Boden der Spritze in den Lockstecker der Nadel setzt.

Drücken Sie den Kolben auf die Packungsspritze und beobachten Sie, wie PHE in den Schlauch eindringt und in das Gerät fließt, da nur das Auslassventil der Packung geöffnet ist. Ein Steroid dringt in die Kammer des Geräts ein und wird durch Pfosten auf der Rückseite zurückgehalten. Sobald sich das S-Sphäroid in der Kammer befindet, passt es sich der Form der Kammer an und erhält eine rechteckige Geometrie.

Schließen Sie das Einlassventil VPN und das Auslassventil VP aus, montieren Sie die Durchflussspritze SF an der Spritzenpumpe. Diese Pumpe wird von einem Computer mit Spritzenpumpe pro offenem Einlassventil VFN und Auslassventil VF heraus betrieben. Beginnen Sie den Durchfluss des Mediums in das Gerät bei drei Mikrolitern pro Minute.

Auf die Inkubation des Sphäroids für 24 Stunden folgt die Einführung von Apoptose-Nachweismitteln. Lassen Sie vor der Einführung von Apoptose-, Nachweis- oder Therapeutika bis zu 24 Stunden lang ein Gleichgewicht des Sphäroids bestehen, um Nährstoffgradienten und Mikroumgebungen zu etablieren. Dann das Ventil VFN absperren.

Stoppen Sie die Spritzenpumpe. Nehmen Sie die Spritze aus der Pumpe und ersetzen Sie sie durch die Spritze mit dem Medium mit 0,25 Mikrolitern pro mille CASP glow red active Caspase three Marker. Waschen Sie das Gerät mit der Lösung, indem Sie manuell 0,7 Milliliter davon durch das Gerät spülen.

Montieren Sie dann die Spritze auf der Pumpe. Starten Sie den Durchfluss neu und öffnen Sie das Ventil VFN. Über einen Zeitraum von fünf bis acht Stunden diffundiert der rote aktive cph des Fasshandschuhs in Phase drei in das Gewebe und fluoresziert in apoptotischen Bereichen heller. Das Apoptose-Nachweismittel in dieser Konzentration wird in allen nachfolgenden Flow-Lösungen beibehalten.

Doxorubicin wird fünf bis acht Stunden nach der Einführung von Apoptose-Nachweismitteln eingeführt. Diese Behandlung wird durch Spülen aus dem System entfernt. Um Chemotherapeutika hinzuzufügen, befolgen Sie das Verfahren zum Apoptose-Nachweis, um 10 mikromolare Doxorubicinhydrochlorid einzuführen.

Ersetzen Sie dann die Behandlungsspritze durch die Spritze mit 0,7 Millilitern Medium. Setzen Sie den Fluss des Therapeutikums für einen bestimmten Zeitraum fort. Schließen Sie dann das Ventil VFN und schalten Sie die Spritzenpumpe aus.

Nehmen Sie die Behandlungsspritze aus der Spritzenpumpe und ersetzen Sie sie durch die Spritze mit 0,7 Millilitern Medium. Lassen Sie das frische Medium 24 bis 36 Stunden lang fließen, während Sie das Gewebe kontinuierlich unter einem Mikroskop überwachen. Der gesamte Erfassungsprozess für die Zeitraffermikroskopie wurde mit einem angepassten Skript im IP-Labor automatisiert, erfassen Sie Durchlicht- und Fluoreszenzbilder des PAX Foid bei 10-facher Vergrößerung alle 30 Minuten. Für die mathematische Schätzung der Diffusivitätskoeffizienten von Arzneimitteln besteht der erste Schritt darin, durchschnittliche lineare Intensitätsprofile der Fluoreszenz von docs unter Verwendung des Bildes J. auszuwählen. oder ROI, der das Gewebe in der Kammer umfasst.

Verwenden Sie den Befehl Profil plotten, um ein Profil der durchschnittlichen Intensitäten in Abhängigkeit von der Entfernung vom Strömungskanal zu erstellen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für bis zu drei verschiedene Zeitpunkte. Subtrahieren Sie als nächstes die durchschnittliche Hintergrundfluoreszenzintensität von den erhaltenen Intensitätsprofilen und normalisieren Sie jedes Profil unter Verwendung der entsprechenden maximalen Intensität, um C als Funktion von X und T zu erhalten.Dabei C die normierte Konzentration von Doxorubicin ist, variiert der Wert von C zwischen null und eins.

Der nächste Schritt besteht darin, den effektiven Diffusionskoeffizienten von Dokumenten innerhalb von Tumorgewebedokumenten zu bewerten. Die Diffusion kann durch die folgende Gleichung dargestellt werden, wobei ERFC die komplementäre Fehlerfunktion ist. X ist der Abstand vom Kanal in das Gewebe und T ist die Zeit nach der Einführung von Doxorubicin.

Verwenden Sie das folgende iterative Schema zu jedem betrachteten Zeitpunkt. Erraten Sie einen Wert für D.Berechnen Sie die rechte Seite der Gleichung an jeder Position. X.Berechnen Sie die Summe der quadrierten Fehler zwischen den beiden Seiten, und ändern Sie D, um den Restdurchschnitt zu minimieren.

Die optimalen Werte von D, die zu jedem Zeitpunkt erhalten werden, dienen zur Schätzung des durchschnittlichen effektiven Diffusionskoeffizienten von Doxorubicin im Gewebe. Die mikrofluidischen Geräte boten eine ein Millimeter mal 0,3 Millimeter x 0,15 Millimeter große, optisch zugängliche Kulturkammer für das Wachstum von dreidimensionalem Tumorgewebe. Die Hanging Drop-Methode ermöglichte die schnelle Bildung von Tumor-PHE konsistenter Größe und Form aus mehreren Zelllinien.

PHE wurden bis zu drei Tage lang erfolgreich auf dem Gerät gezüchtet. Das Wachstum in den Kammern war mit der reproduzierbaren Modifikation der Mikroumgebungen verbunden. Innerhalb der Phe fand die Apoptose weniger in Zellen in unmittelbarer Nähe des Strömungskanals und höher und tiefer im Gewebe statt.

Das Gerät wurde zur Abschätzung des Diffusionskoeffizienten von Doxorubicin und Tumorgewebe verwendet. Der experimentell beibehaltene Wert stimmte mit dem Wert überein, der zuvor bei menschlichem Brustkrebs beim Versuch dieses Verfahrens berichtet wurde. Es ist wichtig, besonders vorsichtig zu sein, wenn PHE in das Gerät einfließt, da es außerhalb der Zellkultur durchgeführt werden muss.

Haubenspritzen und Schlauchenden großzügig mit Ethanol besprühen, um die Sterilität zu gewährleisten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein Verständnis für die Rolle des begrenzten Eindringens von Arzneimitteln in Tumore haben. Wir haben eine Technik demonstriert, mit der die Verabreichung und systemische Clearance von Medikamenten auf dreidimensionalem Tumorgewebe nachgeahmt und ihre Penetration quantifiziert werden kann.

Die Eliminierung schlecht durchdringender Medikamente wird den Prozess der Entwicklung von Krebsmedikamenten erheblich rationalisieren.