Methoden zur raschen Transfer und die Lokalisierung von Lyme-Borreliose Erreger innerhalb der Tick Gut

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Mikroinjektion und Lokalisierung von Borrelia berg de Ferry-Zellen im Zeckendarm. Dies wird erreicht, indem zunächst die Glaskapillarnadeln präpariert und mit Beberg de Ferry-Zellen gefüllt werden. Anschließend werden die Beberg-Zellen per Mikroinjektion in den Zeckendarm übertragen.

Anschließend wird die Zecke präpariert und das Darmgewebe entfernt. Schließlich wird die Immunfluoreszenzmarkierung von Beberg-Aufschub im Zeckendarm durchgeführt. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Lokalisierung von Beberg zur Fähre im Zeckendarm mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie belegen.

Hallo, ich bin Dr. Ruth Paul Paul, Assistenzprofessorin an der University of Maryland in der Abteilung für Veterinärmedizin. Heute werden zwei meiner Labormitarbeiter, Toro Cairo, ein Postdoktorand, und Adam Coleman, ein Doktorand, Ihnen das Verfahren zur künstlichen Infektion von Zecken durch Mikroinjektion zeigen, das wir routinemäßig im Labor durchführen. Nach der Mikroinjektion werden wir die Zecke sezieren und die Bakterien im Zeckendarm mit einem konfokalen CE-Mikroskop abbilden.

Der Hauptvorteil der Zecken-Mikroinjektion einer Generation von natürlich infizierten Zecken ist die Dauer des Eingriffs. Mikroinjektionen verkürzen das gesamte Verfahren von Wochen Stunden, da etwa fünf Wochen benötigt werden, um infizierte Zecken durch natürlichen Fütterungsprozess zu erzeugen. Diese Technik kann auch angepasst werden, um andere nützliche Reagenzien zu injizieren, wie z. B. doppelsträngige RNA für RNAi oder Antiseren für spezifische Antikörperinterferenzen in der Zecke.

Beginnen Sie mit der Herstellung mehrerer Mikroinjektionsnadeln durch Erhitzen und Ziehen von einem Millimeter Glaskapillarröhrchen in einer Glasmikropipettenzugvorrichtung. Entfernen Sie vorsichtig die zerbrechlichen Kapillarrohre. Bewahren Sie die gebündelten Nadeln mit der Spitze nach oben auf Klebeband in einer Petrischale auf.

Als nächstes züchten Sie b berg de ferry in BSK-Kultur. Medium bis zu einer Konzentration von etwa 10 bis zu sieben Zellen pro Milliliter Pellet b berg de ferry durch Zentrifugation bei 3000 mal G für 10 Minuten erhitzen. Entfernen Sie bei Raumtemperatur die Schlinge und resuspendieren Sie das Pellet vollständig in BSK-Medium, indem Sie vorsichtig durch eine sterile Mikrospitze von 200 Mikrolitern bis zu einer Endkonzentration von 10 bis neun Zellen pro Milliliter führen.

Da die Zellen bei hoher Zelldichte resuspendiert werden und verklumpen könnten, sollte die Zellsuspension sofort für die Mikroinjektion verwendet werden, um Zecken vorzubereiten. Legen Sie durchsichtiges doppelseitiges Klebeband auf einen Objektträger, bearbeiten Sie eine klebrige Matte, entfernen Sie vorsichtig Zecken aus dem Behälter. Legen Sie mit einer kleinen Bürste die erforderliche Anzahl von zu injizierenden Zecken mit der Bauchseite nach oben in die gleiche Richtung auf das Klebeband. Laden Sie fünf Mikroliter der beberg de ferry-Kultur in die gepoolte Kapillarnadel. Untersuchen Sie die Nadel mit einer 20-Mikroliter-Mikroladung der Pipettenspitze auf eingeschlossene Luftblasen und füllen Sie die Nadel erneut mit Bakterienkultur.

Betrachten Sie die Zecke bei Bedarf unter dem Präpariermikroskop und fokussieren Sie sich auf den analen Öffnungsbereich der Zecke. Berühren Sie vorsichtig die Spitze der Kapillarnadel, um den Schlauch zu brechen, wobei der Durchmesser etwas kleiner ist als der der Analöffnung der Zecke, die die Mikroinjektionsnadel bildet. Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung, da jeder Versuch, Zecken mit ungeeigneten Nadelspitzen zu injizieren, zu Verletzungen und möglicherweise zum Tod führt.

Zur injizierten Zecke. Legen Sie die immobilisierten Zecken unter das Präparier-Binokularmikroskop und fokussieren Sie auf die Analöffnung, die von zwei beweglichen Analplatten abgedeckt wird. Berühren Sie mit einer feinen Pinzette sanft jeden Bereich in der Nähe der Analöffnung und üben Sie einen sehr leichten Druck darauf aus.

Dies ermöglicht die Trennung der Analplatten und die Öffnung der Analpore, die mit dem Darm verbunden ist. Führen Sie die Spitze der Nadel vorsichtig leicht in die Analöffnung durch die gewaltsame Öffnung der Analplatten ein. Das Einführen der Nadel sollte auf ein Minimum beschränkt werden, da die Glasspitze den halbtransparenten Hinterdarm beschädigen könnte, der mit dem Rektum verbunden ist.

Unter Verwendung eines Mikroinjektors, der mit einer automatischen Fußsteuerung ausgestattet ist, injizieren Sie die Lösung unter Verwendung der folgenden Parameter: 1000 Hector Pascal Einspritzdruck, 0,2 Sekunden Injektionszeit und acht Hector Pascal Kompensationsdruck. Jede Zecke erhält nach der Mikroinjektion eine einzelne Injektion.

Die Zecke sollte als Reaktion auf ähnliche Reize wie vor der Injektion Anzeichen von Bewegung zeigen oder kriechen. Um Zecken für die Immunfluoreszenzmikroskopie zu präparieren, legen Sie zuerst ein Tröpfchen phosphatgepufferte Kochsalzlösung zur Dissektion auf einen sauberen Glasobjektträger und ein weiteres auf einen mit Poly-L-Lysin beschichteten Objektträger. Bereiten Sie für die Mikroskopie einen weiteren Objektträger mit doppelseitigem Klebeband vor. Nehmen Sie anschließend die Zecke aus dem Behälter und legen Sie sie auf doppelseitiges Klebeband.

Platzieren Sie mit einem kleinen Pinsel unter dem Präpariermikroskop eine scharfe Rasierklinge auf der Zecke zwischen dem ersten und zweiten Beinpaar. Drücken Sie die Zecke fest nach unten, schneiden Sie sie in zwei Teile, legen Sie den Bauch frei und tauchen Sie den Bauch sofort mit einer feinen Pinzette in ein Tröpfchen PBS. Fassen Sie das dorsale und ventrale Exoskelett um die Stelle des Schnitts.

Ziehe den Rückenschild vorsichtig nach oben und von der Zecke weg, so dass das bräunlich gefärbte Darmdivertikular freigelegt wird. Achten Sie darauf, die Präparierzecken immer unter dem PBS zu halten. Die halbdurchscheinenden Sali-Drüsenbündel befinden sich auf beiden Seiten des vorderen Darmbereichs und können an dieser Stelle auf Wunsch entfernt werden.

Halten Sie das verbleibende Exoskelett mit einer Pinzette fest und ziehen Sie den Darm vorsichtig aus dem Bauch heraus. Reinige den Darm vorsichtig, indem du eingeschlossenes Gewebe wie die Luftröhre entfernst. Übertragen Sie den Zeckendarm mit der Spitze einer feinen Pinzette schnell in ein Tröpfchen PBS auf einem Poly-L-Lysin-Glasobjektträger.

Trennen Sie den Darm mit feinen Klingen oder durch leichtes Drücken mit der Spitze einer feinen Pinzette in kleinere Stücke. Aspirieren Sie überschüssiges PBS vorsichtig um das Darmgewebe herum. Lassen Sie das Darmgewebe bei Raumtemperatur an der Luft trocknen.

Fixieren Sie den Zeckendarm, indem Sie ihn 10 Minuten lang in Aceton tauchen. Lassen Sie es an der Luft trocknen: Objektträger mit Raumtemperatur können bei diesem Schritt monatelang bei minus 20 Grad Celsius in einem luftdichten Behälter gelagert werden. Für die Immunfluoreszenzmarkierung des Darms zeichnest du mit einem Pap-Pen oder einem anderen hydrophoben Barrieregerät einen Kreis um den festen Zeckendarm.

Dies wird dazu beitragen, die Färbelösungen während der nachfolgenden Inkubationsschritte zu erhalten. Bedecken Sie den Zeckendarm 30 Minuten lang mit einem oder einigen Tropfen Blockierungspuffer. Bei Raumtemperatur.

Welches Serum für die Blockierung verwendet wird, hängt von der Herkunft des Wirtstieres für den Antikörper ab. Lassen Sie die Rutsche von diesem Punkt an nicht trocknen. Saugen Sie den Blockierungspuffer langsam an.

Inkubieren Sie den Darm mit geeigneten primären und/oder sekundären Antikörperlösungen. Wir verwenden Fluorescein, Isothiocyanat oder FXI-markiertes Anti-B-Berg. Verschieben Sie den Antikörper bei einer Verdünnung von eins bis 100 in Blockpuffer für eine Stunde.

Decken Sie den Behälter bei Raumtemperatur mit Alufolie ab, um die Lichteinwirkung zu begrenzen. Entfernen Sie die Antikörperlösung durch sanfte Aspiration. Inkubieren Sie den Darm mit einem Fluoreszenzfarbstoff, um Zeckengewebe wie DPI oder Propidiumiodid zu markieren.

Normalerweise verwenden wir 20 Mikrogramm pro Milliliter Peridiumiodid in PBS für fünf Minuten bei Raumtemperatur, waschen dreimal mit 0,05% zwischen 20 in PBS für fünf Minuten. Montieren Sie schließlich den Objektträger in gepuffertes Glycerin, das ein Antifa-Reagenz enthält, und decken Sie ihn vorsichtig mit einer Glasabdeckung ab. Slip Slides können in diesem Schritt einige Monate bei vier Grad Celsius in einem luftdichten Behälterbild gelagert und unter einem konfokalen Mikroskop lokalisiert werden.

Hier ist eine Zecken-Mikroinjektion mit einer Nadel zu sehen, die zur besseren Sichtbarkeit mit Kumasi Brilliant Blue gefüllt ist. Mit einer feinen Pinzette wird ein sanfter Druck auf den Körper ausgeübt, der die Trennung der Analplatten und die Öffnung der Analpore für die Mikroinjektion ermöglicht. Hier ist der vordere Bereich eines Darmdivertikels mit Beberg-Fähre innerhalb des Darms dargestellt.

Die Darmkerne und Spirochäten sind mit Propidiumiodid bzw. fitzy-konjugierter Anti-Beberg-Fähre markiert. Einmal gemeistert, haben wir herausgefunden, dass 10 Zecken mit Mikroinjizenz versorgt werden können, wobei natürlich hunderttausend überleben und mit fer infiziert werden können. Während Zecken sofort für andere Experimente verwendet werden können, warten wir in der Regel ein oder zwei Tage, um sicherzustellen, dass die Zecken den Eingriff überleben, bevor wir fortfahren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man künstlich infizierte Zecken durch Mikro- und lokalisierte Barrierewanzen im Zeckendarm mit konfokalen Immunflüssen erzeugt. Mikro Die Arbeit mit Zecken und feinen Glasnadeln, die mit einem menschlichen Krankheitserreger gefüllt sind, wie z. B. Brelia Brior Fry, kann während der Arbeit gefährlich sein. Achten Sie auf die Standorte von Zecken und Nadeln und befolgen Sie jederzeit Vorsichtsmaßnahmen der Biosicherheitsstufe zwei.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.