Methoden zur raschen Transfer und die Lokalisierung von Lyme-Borreliose Erreger innerhalb der Tick Gut
14. Februar 2011
Lyme-Borreliose Studien erfordern oft Generation von Zecken mit dem Erreger Borrelia burgdorferi, ein Prozess, der dauert in der Regel mehrere Wochen infiziert. Hier zeigen wir eine Mikroinjektion-basierte Zecken Infektion Verfahren, das innerhalb weniger Stunden erreicht werden kann. Wir zeigen auch einer Immunfluoreszenz-Methode zur in situ-Lokalisation von B. burgdorferi in Zecken.
Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Borrelia burgdorferi-Zellen in den Zeckendarm mikroinjizieren und lokalisieren zu können. Dies wird erreicht, indem zunächst die Glaskapillarnadeln vorbereitet und mit Borrelia burgdorferi-Zellen gefüllt werden. Anschließend werden die Borrelia burgdorferi-Zellen mittels Mikroinjektion in den Zeckendarm übertragen.
Anschließend wird die Zecke disseziert und das Darmgewebe entfernt. Schließlich erfolgt die Immunfluoreszenzmarkierung von beberg defer im Zeckendarm. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die mittels konfokaler Mikroskopie die Lokalisation von beberg in ferry im Zeckendarm nachweisen.
Hallo, ich bin Dr. Ruth Paul Paul, wissenschaftliche Mitarbeiterin an der University of Maryland im Fachbereich Veterinärmedizin. Heute werden zwei Mitglieder meines Labors, Toro Cairo, ein Postdoktorand, und Adam Coleman, ein Doktorand, Ihnen das Verfahren zur künstlichen Infektion von Zecken mittels Mikroinjektion zeigen, das wir routinemäßig im Labor durchführen. Nach der Mikroinjektion werden wir die Zecke sezieren und die Bakterien im Zeckendarm mit einem konfokalen CE-Mikroskop abbilden.
Der Hauptvorteil der Zecken-Mikroinjektion zur Erzeugung natürlich infizierter Zecken liegt in der Dauer des Verfahrens. Die Mikroinjektion verkürzt den gesamten Prozess von Wochen auf Stunden, da etwa fünf Wochen benötigt werden, um infizierte Zecken durch natürliche Fütterung zu erzeugen. Diese Technik kann außerdem angepasst werden, um andere nützliche Reagenzien wie doppelsträngige RNA für RNAi oder Antiseren zur gezielten Antikörperinterferenz in die Zecke einzubringen.
Um zu beginnen, stellen Sie mehrere Mikroinjektionsnadeln her, indem Sie einkanalige Glas-Kapillarrohre mit einem Millimeter Durchmesser in einer Glas-Mikropipetten-Ziehanlage erhitzen und ziehen. Entfernen Sie die empfindlichen Kapillarrohre vorsichtig. Lagern Sie die gesammelten Nadeln mit der Spitze nach oben auf Klebeband in einer Petrischale.
Als Nächstes B. burgdorferi in BSK-Kulturmedium auf eine Konzentration von etwa 107 Zellen pro Milliliter anwachsen lassen. B. burgdorferi durch Zentrifugation bei 3000 × g für 10 Minuten pelletieren. Bei Raumtemperatur den Überstand entfernen und das Pellet vollständig in BSK-Medium durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren mit einer sterilen 200-μl-Mikrospitze auf eine Endkonzentration von 109 Zellen pro Milliliter resuspendieren.
Da die Zellen in hoher Dichte resuspendiert werden und zu Klumpen neigen können, sollte die Zellsuspension sofort für die Mikroinjektion verwendet werden, um Zecken vorzubereiten. Bringen Sie auf einem Objektträger ein durchsichtiges doppelseitiges Klebeband auf einer Anti-Rutsch-Matte an. Entfernen Sie die Zecken vorsichtig aus dem Behälter und platzieren Sie mithilfe eines kleinen Pinsels die erforderliche Anzahl an Zecken, die injiziert werden sollen, mit der Bauchseite nach oben und in dieselbe Richtung ausgerichtet, auf dem Klebeband. Füllen Sie fünf Mikroliter der Beberg-de-Ferry-Kultur in die gezogene Kapillarnadel. Prüfen Sie mithilfe einer 20-Mikroliter-Mikroladepipettenspitze die Nadel auf eingeschlossene Luftblasen und füllen Sie die Nadel bei Bedarf erneut mit der Bakterienkultur auf.
Falls erforderlich, betrachten Sie die Zecke unter dem Stereomikroskop und fokussieren Sie auf den Bereich der Afteröffnung der Zecke. Berühren Sie vorsichtig die Spitze der Kapillarnadel, um die Röhre dort zu durchbrechen, wo der Durchmesser geringfügig kleiner ist als der der Afteröffnung der Zecke, wodurch die Mikroinjektionsnadel entsteht. Dieser Schritt ist entscheidend, da jeder Versuch, Zecken mit ungeeigneten Nadelspitzen zu injizieren, Verletzungen und möglicherweise den Tod verursachen kann.
Zum injizierten Zecken. Legen Sie die fixierten Zecken unter das Stereomikroskop und fokussieren Sie auf die Anusöffnung, die von zwei beweglichen Analplatten bedeckt ist. Berühren Sie mit feiner Pinzette vorsichtig und mit sehr geringem Druck einen Bereich in der Nähe der Anusöffnung.
Dies ermöglicht die Trennung der Analschilder und die Öffnung der Analmündung, die mit dem Darm verbunden ist. Führen Sie die Spitze der Nadel vorsichtig leicht in die Analmündung durch die erzwungene Öffnung der Analschilder ein. Der Nadeleinsatz sollte auf ein Minimum beschränkt werden, da die Glasspitze den halbtransparenten Enddarm, der mit dem Mastdarm verbunden ist, beschädigen könnte.
Unter Verwendung eines Mikroinjektors mit automatischer Fußsteuerung wird die Beberg-de-Ferry-Lösung mit folgenden Parametern injiziert: 1000 Hektopascal Injektionsdruck, 0,2 Sekunden Injektionszeit und acht Hektopascal Kompensationsdruck. Jede Probe erhält nach der Mikroinjektion eine einzelne Injektion.
Die Zecke sollte Anzeichen von Bewegung zeigen oder als Reaktion auf Reize kriechen, ähnlich wie vor der Injektion. Um Zecken für die Immunfluoreszenzmikroskopie zu präparieren, geben Sie zunächst einen Tropfen phosphatgepufferter Kochsalzlösung auf einen sauberen Objektträger zur Dissektion und einen weiteren auf einen mit Poly-L-Lysin beschichteten Objektträger. Für die Mikroskopie bereiten Sie einen weiteren Objektträger mit doppelseitigem Klebeband vor. Entfernen Sie anschließend die Zecke aus dem Behälter und platzieren Sie sie auf dem doppelseitigen Klebeband.
Unter Verwendung eines kleinen Pinsels unter dem Präparationsmikroskop das Zeckenexemplar scharfgestellt betrachten, anschließend ein scharfes Rasiermesser zwischen der ersten und zweiten Beinpaarstellung auf die Zecke setzen. Fest nach unten drücken, um die Zecke in zwei Teile zu schneiden, wobei das Abdomen freigelegt wird. Das Abdomen unmittelbar mit feinen Pinzetten in einen Tropfen PBS eintauchen. Die dorsale und ventrale Exoskelettregion um die Schnittstelle herum greifen.
Heben Sie vorsichtig das dorsale Schild an und ziehen Sie es vom Zeckenkörper weg, um das bräunlich gefärbte Darmdivertikulum freizulegen. Achten Sie darauf, die zu dissezierenden Zecken stets unterhalb der PBS-Lösung zu halten. Die halbtransparenten Speicheldrüsenbündel befinden sich beidseitig im vorderen Bereich des Darms und können gegebenenfalls an dieser Stelle entfernt werden.
Halten Sie das verbleibende Exoskelett mit einer Pinzette fest und ziehen Sie vorsichtig den Darm aus dem Abdomen. Reinigen Sie den Darm sorgfältig, indem Sie eingeklemmte Gewebe wie die Tracheen entfernen. Übertragen Sie mithilfe der Spitze einer feinen Pinzette den Zeckendarm schnell in einen Tropfen PBS auf einem Poly-L-Lysin-Glaskörper.
Trennen Sie den Darm mit feinen Klingen in kleinere Stücke oder durch vorsichtiges Andrücken mit der Spitze feiner Pinzetten. Aspirieren Sie vorsichtig überschüssiges PBS um die Darmgewebe herum. Lassen Sie die Darmgewebe bei Raumtemperatur an der Luft trocknen.
Fixieren Sie den Zecken-Darm, indem Sie ihn 10 Minuten lang in Aceton eintauchen. Lassen Sie ihn bei Raumtemperatur trocknen. Die Objektträger können ab diesem Schritt monatelang bei minus 20 Grad Celsius in einem luftdichten Behälter aufbewahrt werden. Für die immunfluoreszenzmarkierte Färbung des Darms zeichnen Sie mit einem Pap-Pen oder einem anderen hydrophoben Begrenzungsgerät einen Kreis um den fixierten Zecken-Darm.
Dies trägt dazu bei, die Färbelösungen während der anschließenden Inkubationsschritte zu halten. Bedecken Sie den Zecken-Darm für 30 Minuten mit einem oder mehreren Tropfen Blockierpuffer. Bei Raumtemperatur.
Das für die Blockierung verwendete Serum hängt von der Herkunft des Wirtsorganismus für den Antikörper ab. Erlauben Sie ab diesem Punkt nicht, dass das Objektträgerpräparat austrocknet. Aspirieren Sie langsam den Blockierpuffer.
Die Darmprobe mit geeigneten Primär- und/oder Sekundärantikörperlösungen inkubieren. Wir verwenden Fluorescein-, Isothiocyanat- oder FXI-markierte Anti-B-berg-Antikörper. Das Antikörper mit einem Verdünnungsverhältnis von 1 zu 100 im Blockierpuffer eine Stunde lang inkubieren.
Bei Raumtemperatur den Behälter mit Aluminiumfolie abdecken, um eine Lichteinwirkung zu begrenzen. Die Antikörperlösung durch vorsichtiges Absaugen entfernen. Das Darmgewebe mit einem fluoreszierenden Farbstoff inkubieren, um Zeckengewebe wie DPI oder Propidiumiodid zu markieren.
Üblicherweise verwenden wir 20 Mikrogramm pro Milliliter Peridinin-Iodid in PBS für fünf Minuten bei Raumtemperatur, waschen dreimal mit 0,05 % Tween 20 in PBS für jeweils fünf Minuten. Schließlich wird die Probe in gepuffertem Glycerin mit einem Antifa-Reagenz auf einem Objektträger montiert und vorsichtig mit einem Deckglas abgedeckt. Die präparierten Objektträger können in diesem Schritt mehrere Monate bei vier Grad Celsius in einem luftdichten Behälter aufbewahrt werden und unter einem konfokalen Mikroskop bildlich dargestellt und lokalisiert b berg de ferry.
Hier ist eine Zecken-Mikroinjektion dargestellt, bei der eine Nadel zur besseren Sichtbarkeit mit Kumasi Brilliantblau gefüllt ist. Feine Pinzetten werden verwendet, um sanften Druck auf den Körper auszuüben, wodurch die Afterschilder getrennt und die Afteröffnung zur Mikroinjektion geöffnet werden kann. Hier ist der vordere Bereich eines Darmdivertikels mit Beberg Ferry im Darminneren zu sehen.
Die Darmkerne und Spirochäten werden mit Propidiumiodid bzw. mit Fitzy-konjugiertem Anti-Beberg-Ferry markiert. Nachdem die Technik beherrscht ist, haben wir festgestellt, dass 10 Zecken mikroinjiziert werden können, wobei typischerweise hunderttausend überleben und mit Fer infiziert sind. Obwohl die Zecken unmittelbar für andere Experimente verwendet werden können, warten wir in der Regel ein oder zwei Tage, um sicherzustellen, dass die Zecken den Eingriff überlebt haben, bevor wir fortfahren.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man künstlich infizierte Zecken erzeugt, indem man mittels konfokaler Immundeflektion Mikro- und lokalisierte Barrieren im Zeckendarm überwindet. Das Arbeiten mit Zecken und feinen Glasnadeln, die mit einem humanen Pathogen wie Borrelia burgdorferi gefüllt sind, kann gefährlich sein. Achten Sie stets auf den Aufenthaltsort der Zecken und Nadeln und befolgen Sie durchgehend die Sicherheitsvorkehrungen der Biosicherheitsstufe 2.
Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.
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Übersicht
Diese Studie stellt eine auf Mikroinjektion basierende Methode zur Infektion von Zecken mit Borrelia burgdorferi vor, die die für die Zeckeninfektion erforderliche Zeit erheblich verkürzt. Zusätzlich wird eine Immunfluoreszenztechnik zur Lokalisierung des Erregers in Zeckengeweben demonstriert.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Mikrobiologie
- Vektorbiologie
- Pathogenlokalisation
Hintergrund
- Die Lyme-Borreliose wird durch das Bakterium Borrelia burgdorferi verursacht.
- Zecken sind die primären Vektoren für die Übertragung dieses Krankheitserregers.
- Herkömmliche Methoden zur Infektion von Zecken sind zeitaufwendig.
- Schnelle Infektionsmethoden können die Forschungseffizienz verbessern.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer schnelleren Methode zur Infektion von Zecken mit B. burgdorferi.
- Ermöglichung der in-situ-Lokalisation des Erregers in Zeckengewebe.
- Verbesserung des Verständnisses der Interaktionen zwischen Zecken und Erregern.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Glas-Kapillarnadeln für die Mikroinjektion.
- Mikroinjektion von B. burgdorferi-Zellen in den Zeckendarm.
- Präparation von Zecken zur Isolierung von Darmgeweben.
- Immunfluoreszenzmarkierung von B. burgdorferi in Darmgeweben.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Mikroinjektion von B. burgdorferi in Zeckenmägen.
- Effektive Lokalisierung des Erregers mittels Immunfluoreszenz nachgewiesen.
- Ergebnisse mittels konfokaler Mikroskopie visualisiert.
- Die Methode verkürzt signifikant die Zeit für die Zeckeninfektion.
Schlussfolgerungen
- Die Mikroinjektionstechnik stellt eine gangbare Alternative für die Zeckeninfektion dar.
- Mittels Immunfluoreszenz lässt sich eine präzise Lokalisation von Krankheitserregern erreichen.
- Dieser Ansatz kann die weitere Forschung zur Übertragung der Lyme-Borreliose erleichtern.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Schnelle und gezielte Infektion von Zeckenvektoren mit Borrelia burgdorferi ermöglicht die effiziente Untersuchung von Pathogen-Vektor-Interaktionen, die für die Lyme-Borreliose-Forschung entscheidend sind. Dieser Mikroinjektionsansatz verkürzt die Infektionsdauer von Wochen auf Stunden und unterstützt Hochdurchsatz-Screenings sowie die mechanistische Risikominderung in der frühen Entdeckungsphase. Die Methode gewährleistet reproduzierbare Pathogenapplikation und erhöht so die Vorhersagegenauigkeit bei der Zielvalidierung und der Entwicklung von Assays.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Borrelia burgdorferi und dem Zeckenmagen, um therapeutische Zielstrukturen zu validieren, die an der Persistenz und Übertragung des Erregers beteiligt sind.
- Operativer Wert: Stellt standardisierte Erregerlasten über verschiedene Zeckenkollektive hinweg bereit, reduziert die Variabilität in Infektionsmodellen und verbessert die Reproduzierbarkeit von Assays.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die funktionelle Entschärfung von Zielstrukturen, indem kontrollierte Exposition gegenüber Erregerspitämen ermöglicht wird, einschließlich solcher, die in murinen Modellen abgeschwächt sind.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt infizierte Zeckengewebe, die für nachgeschaltete Immunfluoreszenz- und konfokale Abbildungsassays geeignet sind, um die Lokalisation und Belastung mit Krankheitserregern zu quantifizieren.
- Operativer Wert: Erzeugt quantifizierbare, mikroskopiebereite Ausgaben, die eine Standardisierung der Nachweisergebnisse von Krankheitserregern über verschiedene Screening-Kampagnen hinweg ermöglichen.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Vorbereitung großer Mengen gleichmäßig infizierter Zecken und unterstützt dadurch die Reproduzierbarkeit von Assays sowie die Wiederverwendung der Plattform in vektorbasierten Screening-Plattformen.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Bietet ein krankheitsrelevantes System zur Untersuchung der Lokalisation von Borrelia burgdorferi im Zeckenmagen und verbindet dabei in-vitro-Ergebnisse mit der pathophysiologischen Betrachtung im Vektor.
- Mechanistische Ent风险评估: Ermöglicht die Visualisierung der Pathogenverteilung in Zeckengeweben und unterstützt damit Hypothesen über gewebespezifische Virulenzfaktoren und Übertragungsmechanismen.
- Verbesserung präklinischer Modelle: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen zur Weiterentwicklung, indem es eine konsistente Pathogenexposition zur Bewertung der Wirksamkeit von Interventionen in Modellen zeckenübertragener Krankheiten bereitstellt.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur präklinischen Evaluierung, indem sie die schnelle Erzeugung infizierter Zeckenvektoren und standardisierte Nachweise zur Lokalisation von Pathogenen ermöglicht.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung von Pathogen-Vektor-Interaktionen, indem kontrollierte Mengen von Borrelia burgdorferi in den Zeckendarm appliziert werden, um mechanistische Untersuchungen durchzuführen.
- Screening: Erzeugt standardisierte, infizierte Zeckengewebe, die für quantitative Immunfluoreszenzassays geeignet sind und die Reproduzierbarkeit in Workflows zur Pathogendetektion verbessern.
- Analytik: Erstellt konfokale Mikroskopie-basierte Messgrößen zur Lokalisation und Belastung mit Pathogenen, wodurch ein vergleichender Ansatz über experimentelle Bedingungen und Interventionen hinweg ermöglicht wird.
- Translationale Forschung: Verbindet die in-vitro-Kultur von Pathogenen mit der Lokalisation im Zeckengewebe und unterstützt so die Abstimmung von Biomarkern sowie die pathophysiologische Relevanz in Modellen von vektorübertragenen Krankheiten.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Infektion von Zecken mit verschiedenen biologischen Wirkstoffen, einschließlich Antikörpern und RNAi-Reagenzien, und erweitert dadurch die Anwendbarkeit über Studien zu Borrelia burgdorferi hinaus.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem mechanistische Unklarheiten in Pathogen-Vektor-Interaktionen durch lokalisierte Pathogendetektion verringert werden.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von Zeckeninfektionsmodellen und reduziert den Zeitaufwand sowie den Ressourcenverbrauch im Vergleich zu natürlichen Fütterungsmethoden.
- Strategischer Wert: Steigert die Effizienz von Go/No-Go-Entscheidungen in der frühen Entdeckungsphase, indem schnelle, standardisierte Modelle zur Pathogenexposition für die Entschärfung von Target-Risiken bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Forschungsinitiativen zur Lyme-Borreliose durch zuverlässige, hochpräzise Infektionsmodelle, die die biologische Variabilität verringern.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Mikroinjektionstechniken, Zeckenmanipulation und konfokaler Immunfluoreszenzmikroskopie.
- Hängt von der Herstellung von Glas-Kapillarspritzen, Mikroinjektionsgeräten und der Infrastruktur für Fluoreszenzmikroskopie ab.
- Erfordert die Standardisierung von Injektionsparametern und Darmdissektionsprotokollen zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen, um eine konsistente Pathogenapplikation und Lokalisierungsergebnisse sicherzustellen.
- Die Anpassung an verschiedene Zeckenarten oder Pathogenstämme kann eine Optimierung der Nadelgröße, des Injektionsdrucks und der Bakterienkonzentration erfordern.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören der technische Aufwand für erfolgreiche Mikroinjektionen und Darmdissektionen sowie die Notwendigkeit einer Sicherheitsstufe 2 bei der Handhabung humanpathogener Erreger.
