Name: Erkennung von Post-translationale Modifikationen auf Native Intact Nukleosomen mittels ELISA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Erfahren Sie die Nukleosom-ELISA-Methode zur Erkennung post-translationaler Modifikationen in Chromatin. Diese Technik liefert eine globale Übersicht über Epigenetik und Stammzellbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Die Entwicklung der NU-ELISA-Methode wurde von NIH RO1AG023687 unterstützt.

1. Mammalian Cell Culture NU-ELISA kann auf jedem Säugetier-Zelle Typ, der in Kultur gezüchtet werden können durchgeführt werden. Wir bevorzugen die Vorbereitung mäßige bis große Chargen von Zellen, so dass Nukleosomen in ausreichender Menge isoliert werden kann, um mehrere identisch geladen ELISA-Platten vorzubereiten, so dass Tests mit verschiedenen Antikörpern (ABS). Die folgenden Kultur Skalen bieten reichlich Material: Für Maus embyronic Stammzellen wachsen ein oder zwei 15 cm-Platten von Zellen ohne Feeder-Zellen. Für Fibroblasten wachsen 5 bis 10 15 cm-Platten bis zur Konfluenz. 2. Isolierung der Zellkerne Hinweis: Alle Schritte werden auf Eis mit vorgekühlten Puffer, außer wie angegeben. <ol><li> Trypsinize Zellen mit 3 ml Trypsin pro Platte, kombinieren und mit 20 ml eiskaltem PBS / Butyrat. Zentrifugation bei 1000 rpm für 5 min. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 10 ml PBS / Butyrat und Zentrifuge bei 1000 rpm für 5 min. </li><li> Resuspendieren in 4 ml Lysepuffer mit Protease-Inhibitoren (Sigma-Aldrich P-8340). Dounce homogenisieren 20 Hübe mit Typ-B Pistill auf Eis. </li><li> Zentrifugation bei 2000g für 10 min bei 4 ° C. (Der Überstand enthält Zytoplasma, die nicht für dieses Protokoll benötigt wird, aber es kann für andere Zwecke gespeichert werden, wenn gewünscht). </li><li> Das Pellet in 2 ml eiskaltem Waschpuffer C (mit Protease-Inhibitoren). </li><li> Schicht der resuspendierten Material über 5 ml 30% Saccharose-Kissen, dann auf 2400g zentrifugieren Sie für 5 min in einem Ausschwingrotor. Kerne werden durch Kissen zu migrieren, und Schutt bleibt an der Oberfläche. </li><li> Entfernen Sie alle Flüssigkeitsvolumen sorgfältig und resuspendieren die Kerne in 250 ul eiskaltem Waschpuffer C + Protease-Inhibitoren. </li></ol> 3. Isolierung von Nukleosomen durch in situ Mikrokokken-Nuclease (MNase) Verdauung Wir verwenden ein Verfahren, bei dem Chromatin in situ innerhalb Kerne ist durch Infusion von ihnen mit MNase, gefolgt von einer hypotonen Behandlung kostenlos erhalten Nukleosomen in den Überstand Laufwerk verdaut. <ol><li> Add 3 ul 0,1 M CaCl 2 auf die Probe. Legen Sie in 37 ° C Wärme zu blockieren. Lassen Sie die 37 ° C Temperatur annehmen. </li><li> Add 2 Einheiten MNase (Mikrokokken-Nuclease, Sigma-Aldrich, bei 2 units/10μl in MNase Puffer gelöst), dann bei 37 ° C für 12 min, mit häufigem Mischen mit einer Pipettenspitze. </li><li> Add 6 ul von 0,5 M Na-EDTA, pH 8,0, um die Reaktion zu stoppen. Auf Eis gelegt. </li><li> Zentrifugation bei 2000g für 4 min, Überstand verwerfen. Das Pellet in 300 ul 0,2 mM Na-EDTA. Auf Eis für 1 h mit gelegentlichen sanften Pipettieren. (Diese hypotonen Bedingungen befreien freien Nukleosomen aus Kernen). </li><li> Zentrifugation bei 3000 g für 4 min bei 4 ° C. Speichern der Überstand, der freien Nukleosomen enthält, auf dem Eis. </li><li> Das Pellet erneut mit 300 ul 0,2 mM Na-EDTA. Auf Eis für 1 h mit gelegentlichen sanften Pipettieren. </li><li> Zentrifugation bei 3000g für 4min bei 4 ° C. Behalten Sie den Überstand und verbinden sich mit dem ersten Überstand aus Schritt 5. Die daraus resultierende mononucleosome Präparate können aliquotiert und bei -80 ° C gelagert werden </li></ol> Hinweis: Die Höhe des Chromatins grob durch Messung der Absorption bei 260 nm einer 10 ul Probe quantifiziert werden hinzugefügt bis 990 l Wasser. A 260 = 10 (bereinigt um die 1 / 100 Verdünnung) entspricht etwa 1mg/ml von Chromatin. Auch während der oben genannten Verfahren können kleine Proben aufbewahrt und später analysiert für ihre DNA-Gehalt, um die Qualität und den Umfang der MNase Aufschlüsse, die überwiegend enthalten, sollten DNA von 146 bp in der Länge zu überwachen. Laddering ist bezeichnend für unvollständige MNase Verdauung. Hinweis: Abb.1 enthält eine Zusammenfassung der diagrammed nuklearen Isolation und MNase Aufschlüsse Schritte. 4. Nucleosome-ELISA (NU-ELISA) Wir erkennen PTMs auf Fraktionen, die nativen intakten nuclesosomes, die auf 96-Well-ELISA Mikrotiterplatten immobilisiert wurden. Für jede Probe, wir machen eine Reihe von 2-fach Verdünnungen, und diese sind auf Brunnen in dreifacher Ausfertigung beschichtet. <ol><li> Coat MaxiSorp Platten über Nacht bei 4 ° C mit 50 ul / well der Nukleosomen in Beschichtungs-Puffer verdünnt. Empfohlene serielle zweifache Verdünnungen der Nukleosomen sind aus oberen Reihe auf der unteren Reihe durch Zugabe von 0,1 pg, 0,05 pg, 0,025 ug, 0.0125 ug 0,00625 ug 0,00313 ug 0,00156 pg vorbereitet, mit Beschichtungs-Puffer nur (0 pg Chromatin) im unteren Reihe. (Hinweis: Platte Abdeckungen sind für diesen Schritt erforderlich.) </li><li> Am Morgen waschen Sie die Platten 4 mal mit 200 ul / well PBS/0.5% Tween-20 bei Raumtemperatur (RT) für eine Summe von 10 min mit einer Platte Scheibe. </li><li> Block 1 h bei RT mit 100 ul / well PBS/0.05% Tween-20 / 5% BSA. </li><li> Entfernen Sie die Blocking-Puffer durch Schütteln des invertierten Platte zügigüber ein Waschbecken. Cover und speichern Sie die Platten bei -20 ° C, oder gehen Sie direkt zum nächsten Schritt. </li><li> Add 1 ° Abs in einem Volumen von 50 ul / well verdünnt 1:1000 (oder je nach Bedarf) in PBS/0.05% Tween-20 / 5% BSA bei RT für 1 Stunde auf einem Rotator inkubiert. </li><li> Wash Platten 4 mal mit 200 ul / well PBS/0.5% Tween-20 bei RT und für eine Summe von 10 min in einem Plattenwäscher. </li><li> Add Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugiertem 2 ° Abs, verdünnt 1:5000 (oder je nach Bedarf) in PBS/0.05% Tween-20 / 5% BSA bei RT für eine Stunde auf einem Rotator. </li><li> Wash Platten 4 mal mit 200 ul / well PBS/0.5% Tween-20. Jeder waschen bei RT und für insgesamt 10 Minuten mit einem Plattenwäscher. </li><li> Entwickeln Sie die Platten durch Zugabe von 50 ul TMB Substrat in jede Vertiefung für 10 min bei RT. Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 50 ul / Vertiefung 2N H 2 SO 4 und lesen Sie die Platten 450 nm. (Tipp: Zentrifugation bei 1500 rpm für 2 min mit einem Platten-Rotor, um die Luftblasen in den Vertiefungen vor dem Lesen Extinktionen abführen). </li><li> Export der Messwerte in Excel Dateien für quantitative und statistische Analysen. </li></ol> Reagenzien <table border="1"><tbody><tr><td> PBS / Butyrat </td></tr><tr><td> 135 mM NaCl </td></tr><tr><td> 2,5 mM KCl </td></tr><tr><td> 8 mM Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 1,5 mM KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 10 mM Na-Butyrat </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Lysispuffer </td></tr><tr><td> 250 mM Saccharose </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 </td></tr><tr><td> 10 mM Na-Butyrat </td></tr><tr><td> 4 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 0,1% Triton X-100 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Waschpuffer C </td></tr><tr><td> 250 mM Saccharose </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 </td></tr><tr><td> 10 mM Na-Butyrat </td></tr><tr><td> 4 mM MgCl 2 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Saccharose-Kissen </td></tr><tr><td> 30% (w / v) Saccharose in Waschpuffer C </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Microccocal Nuclease Puffer </td></tr><tr><td> 5 mM NaPO 4, pH 7,0 </td></tr><tr><td> 0,025 mm CaCl 2 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Coating-Puffer </td></tr><tr><td> 80ml Lösung A + 170ml Lösung B + 250ml dH 2 O </td></tr><tr><td> Lösung A: 0,2 M Na 2 CO 3 </td></tr><tr><td> Lösung B: 0,2 M NaHCO 3 </td></tr></tbody></table> 5. Repräsentative Ergebnisse Mit dem NU-ELISA-Methode, eine Reihe von mehreren identischen Platten hergestellt werden, die beladen mit Chromatin in Form von mononucleosomes vorbereitet werden können. Wir bereiten in der Regel Folge von identisch beladenen Platten, so dass jeder mit unterschiedlichen anti-PTM-spezifischen Antikörpern (Abs) untersucht werden können. Wir haben auch stets einen Teller, der mit einem Ab, dass Histone erkennt ohne Rücksicht auf deren Modifikation Staat insgesamt Chromatin Ladekontrolle untersucht werden können. Diese Kontrolle ist notwendig, um später quantitativ zu vergleichen PTM Inhalt der Nukleosomen aus verschiedenen Proben hergestellt von wesentlicher Bedeutung. Um quantifizieren das Niveau der PTMs innerhalb einer bestimmten Chromatin Probe korrigieren wir die Rohstoffe Extinktionswerte mit diesem Ansatz: Zuerst subtrahieren wir alle Hintergrund-Signal mit Werten aus Kontrollvertiefungen enthält keine Chromatin (Hintergrund ist in der Regel vernachlässigbar) erhalten. Wir haben dann zu standardisieren PTM-spezifische Signale zu NU-ELISA Ergebnisse aus einem identisch geladen Platte, die mit einem Ab, dass Nukleosomen unabhängig von deren Modifikation Staat erkennt untersucht wurde erhalten. (Wir haben polyklonalen Abs spezifisch für Histone H2A H2B oder für diesen Zweck verwendet). Wir bestimmen dann Mittelwerte und Varianzen für jede Verdünnung von Chromatin, und verwenden Sie Daten aus dem linearen Teil der ELISA-Test erhalten. Ausführliche Beispiele von NU-ELISA mathematischen und statistischen Analysen wurden bisher 4 gemeldet <img src="/files/ftp_upload/2593/2593fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Schematische diagam der NU-ELISA Schritte. A. Mammalian Cells geerntet werden; B. Kerne sind aus Zellen, die durch Dounce h getrenntomogenization, C. aufgeschlossenen Zellen auf der Spitze eines 30% w / v Saccharose-Kissen, D. Nach dem Zentrifugieren geladen werden, werden Kerne in das Pellet abgeschieden; E, F. Chromatin sind in situ überwiegend mononucleomes durch MNase verdaut; G, H , Ich. Löslich mononucleosomes durch hypotone Behandlung und wiederholte Zentrifugation des restlichen Kernmaterial extrahiert. J. Mononucleosomes aus verschiedenen Proben (mit samp. 1 und 2 in diesem Fall) auf Mikrotitervertiefungen in Serie identisch beladenen Platten beschichtet und verhört mit PTM-Risikoabdeckung spezieller ABS-und PTM-unabhängige Abs insgesamt Chromatin Laden zu bestimmen. K. Darstellung der Differenz-Signal-Erkennung Ebenen in zwei Proben, die in ihrer PTM Inhalt unterscheiden, aber ähnliche insgesamt Chromatingehalt, wie anti-H2B-Immunreaktivität beurteilt.

<ol><li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389, 251-260 (1997).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293, 1074-1080 (2001).</li>
<li>Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation+and+an+epigenetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation and an epigenetic code.</a> Bioessays. 22, 836-845 (2000).</li>
<li>Dai, B., Rasmussen, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epiproteomic+signatures+distinguish+embryonic+stem+cells+from+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Global epiproteomic signatures distinguish embryonic stem cells from differentiated cells.</a> Stem Cells. 25, 2567-2574 (2007).</li>
<li>Tanasijevic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+accumulation+of+epigen+etic+heterogeneity+during+human+ES+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Progressive accumulation of epigen etic heterogeneity during human ES cell culture.</a> Epigenetics. 4, 330-338 (2009).</li>
<li>Thomas, J. O. Isolation and fractionation of chromatin and linker histones. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThomas%2C+JO+%22Chromatin%3A+a+practical+approach%22">Chromatin: a practical approach</a>. Gould, H. , Oxford University Press. Oxford. 12-14 (1998).</li>
<li>Thorne, A. W., Cary, P. D., Crane-Robinson, C. Extraction and separation of core histones and non-histone chromosomal proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThorne%2C+AW+%22Chromatin%3A+a+practical+approach%22">Chromatin: a practical approach</a>. Gould, H. , Oxford University Press. Oxford. 38-39 (1998).</li>
</ol>

NU-ELISA bietet eine Methode, um den globalen Status der Nukleosomen PTMs Gegenwart in einem bestimmten Zelltyp zu ermitteln. NU-ELISA-Studien haben gezeigt, dass die globale nucleosome Änderung Staaten Vergleiche unterschiedlicher Zelltypen 4 unterscheiden. Darüber hinaus ändern NU-ELISA PTM-Profilen, wenn Zellen epigenetische modulatorische Substanzen wie ausgesetzt sind Trichostatin-A oder, wenn die Maus embyronic Stammzellen sind 4 differenziert. Die Methode wurde auch erfolgreich auf das Chromatin der menschlichen ES-Zellen 5-Studie angewandt. Es ist wichtig zu beachten, die NU-ELISA, in seiner jetzigen Form kann nur der Composite-Signatur PTMs innerhalb des Summe der zellulären Epigenom zu erkennen. Dies unterscheidet sich deutlich von genomweiten Chromatinimmunpräzipitation, der die Verteilung eines bestimmten PTM über spezifische genetische Loci bestimmen kann. Die ersten Schritte des NU-ELISA-Verfahren werden aus den bisherigen Methoden angepasst mononucleosomes aus Säugetier-Kerne 6,7 isolieren. Diese angepasste Methoden bieten eine sinnvolle Möglichkeit, qualitativ hochwertige intakt mononucleosomes aus Säugetier-Zellen zu erhalten, und die erhaltenen Fraktionen sind umfassend in ihrem Chromatin Inhalt, sondern enthalten eine Vielzahl von zusätzlichen Kernmaterial. Da die spezifischen Abs verwendet werden, ist verunreinigt nicht nukleosomalen Material gut in die NU-ELISA-Test vertragen, im Gegensatz zu Massen-spec Ansätze, die eine größere Reinheit erfordern. Allerdings ist NU-ELISA empfindlicher und quantitative als Western-Blot-4, so dass eine gute Alternative zu Western und Massenspektrometrie zum Nachweis von nukleosomalen PTMs.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Mikrokokken Nucleae </td><td> Sigma </td><td> N3755 </td><td> Machen Aliquots von 2 U/10μl Puffer bei -20 ° C gelagert </td></tr><tr><td> Nunc MaxiSorp Mikrotiterplatten </td><td> Fischer </td><td> 12-565-135 </td><td> Klebeplatte Abdeckungen können auch durch Fisher bestellt werden </td></tr><tr><td> Automatisierte Plattenwäscher </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1-Step TMB-Substrat ELISA </td><td> Durchstechen </td><td> 34028 </td><td> Lagerung bei 4 ° C vorwärmen auf RT vor dem Gebrauch oder als auf dem Datenblatt gerichtet </td></tr><tr><td> Mikrotiterplatten-Reader </td><td> Bio-Rad-Mikroplatten-Reader (Modell: 680) </td><td></td><td> Die meisten kolorimetrischen Plattenlesegerät Modelle eignen sich </td></tr></tbody></table>

erkennung von post-translationale modifikationen auf native intact nukleosomen mittels elisa

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

Das Genom der Eukaryoten existiert als Chromatin, die sowohl DNA und Proteine ​​enthält. Die Grundeinheit des Chromatins ist das Nukleosomen, die 146 Basenpaaren der DNA mit je zwei der Histone H2A, H2B, H3 und H4 1 zugeordnet enthält. Die N-terminalen Enden der Histone sind reich an Lysin und Arginin und post-transkriptionell durch Acetylierung, Methylierung und andere post-translationale Modifikationen (PTM) modifiziert. Die PTM-Konfiguration der Nukleosomen kann sich auf die transkriptionelle Aktivität von assoziierten DNA, wodurch eine Art der Genregulation, dass epigenetische in der Natur ist 2,3. Wir entwickelten eine Methode namens Nukleosomen ELISA (NU-ELISA) zur quantitativen Bestimmung globaler PTM Unterschriften von Nukleosomen aus Zellen extrahiert. NU-ELISA ist empfindlicher und quantitative als Western-Blot, und ist nützlich, um die epiproteomic Zustand der spezifischen Zelltypen zu verhören. Dieses Video Zeitschriftenartikel zeigt detaillierte Verfahren zur NU-ELISA-Analyse durchzuführen.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) ist eine sensible und quantitative Methode zur globalen Muster der post-translationale Modifikationen in Zubereitungen native, intakte Nukleosomen zu erkennen. Diese Änderungen umfassen Methylierungen, Acetylierungen und Phosphorylierungen an bestimmten Histon Aminosäurereste und damit NU-ELISA bietet eine globale Proteom-Test des Gesamtsystems Chromatin Modifikation Staaten von spezifischen Zelltypen.

Erkennung von Post-translationale Modifikationen auf Native Intact Nukleosomen mittels ELISA

Das Genom von Eukaryoten liegt als Chromatin vor, welches sowohl DNA als auch Proteine enthält. Die Grundeinheit des Chromatins ist das Nukleosom, das 146 ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die relativen Mengen an posttranslationalen Modifikationen in Präparationen von gesamten zellulären Nukleosomen, die aus einer Million Zellen gewonnen wurden, genau zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst hochwertige, homogene Kulturen von Säugetierzellen hergestellt werden. Anschließend werden die Zellkerne durch mechanische Zerstörung mit einem Dounce-Homogenisator und Zentrifugation isoliert.Der nächste Schritt besteht darin, intakte Nukleosomen zu gewinnen, indem die im Zellkern vorhandene Chromatin-DNA verdaut und eine Reihe hypotonischer Extraktionen durchgeführt wird. Abschließend werden die Nukleosomen mithilfe eines ELIZA-Assays unter Verwendung geeigneter Kontrollen untersucht, um spezifische posttranslationale Modifikationen nachzuweisen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die relativen Konzentrationen bestimmter Modifikationen in den Nukleosomenproben anzeigen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie der Western-Blot-Analyse und der Chromatin-Immunpräzipitation besteht darin, dass ein umfassender Überblick über zahlreiche Zustände der Nukleosomenmodifikation leicht ermittelt werden kann. Die Methode ist deutlich empfindlicher und genauer als die Western-Blot-Analyse und kann in den meisten Laboren durchgeführt werden, die für allgemeine molekularbiologische Experimente ausgestattet sind. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Stammzellenforschung und Epigenetik zu beantworten, beispielsweise, was geschieht, wenn wichtige Differenzierungs- und Reprogrammierungsereignisse stattfinden.Um das Verfahren zu beginnen, setzen Sie zunächst die Zellen mit drei Millilitern Trypsin pro 15-Zentimeter-Platte an, um frisch trypsinierte Zellen zu erhalten. Geben Sie 20 Milliliter eiskalte PBS-Butyratlösung hinzu. Überführen Sie die Zellen in ein 50-Milliliter-Konischglas und zentrifugieren Sie das Gefäß, um die Zellen bei 1000 U/min fünf Minuten lang zu pelletieren. Aspirieren Sie den Überstand und geben Sie 10 Milliliter eiskalte PBS-Butyratlösung zum Waschen hinzu. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension erneut bei 1000 U/min fünf Minuten lang.Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in vier Milliliter Lysepuffer mit Proteaseinhibitoren, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Danach pipettieren Sie die Zellen in einen Homogenisator mit A-Typ-B-Pestel und homogenisieren sie auf Eis mit 20 Hubstößen. Anschließend überführen Sie das Homogenat in ein Zentrifugenröhrchen auf Eis.Zentrifugieren Sie die Probe bei 2000 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie das Überstand, der das zytoplasmatische Material und Resus enthält.Suspendieren Sie das Pellet in zwei Milliliter eiskaltem Waschpuffer C mit Proteaseinhibitoren, und schichten Sie das resuspendierte Material vorsichtig auf ein fünf Milliliter großes 30%-Saccharose-Kissen in einem kalten Zentrifugenröhrchen. Um die Kerne zu isolieren, zentrifugieren Sie bei 2.400 ×g für fünf Minuten in einem Schwenkkorbrotor; die Kerne wandern durch das Kissen, während zelluläre Trümmer an der Grenzfläche verbleiben. Entfernen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig das gesamte Flüssigkeitsvolumen und resuspendieren Sie die Kerne in 250 Mikroliter eiskaltem Waschpuffer C mit Proteaseinhibitoren. Überführen Sie anschließend die Kerne in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.Um mit der Isolierung von Nukleosomen zu beginnen, geben Sie drei Mikroliter einer 0,1-molaren Calciumchloridlösung zu den Zellkernen hinzu und stellen Sie diese in einen Wärmeprobehalter bei 37 Grad Celsius, bis die Temperatur ausgeglichen ist. Fügen Sie anschließend zwei Einheiten Mikrococcal-Nuklease in 10 Mikrolitern Mikrococcal-Nuklease-Puffer hinzu und inkubieren Sie 12 Minuten bei 37 Grad Celsius. Mischen Sie die Probe häufig mit einer Pipettenspitze.Nach der Inkubation die Reaktion mit sechs Mikrolitern 0,5 M Natrium-EDTA-pH 8 stoppen und zur Abkühlung auf Eis stellen. Anschließend die Probe bei 2000 ×g vier Minuten lang zentrifugieren, nach der Zentrifugation das Überstand entfernen und das Pellet in 300 Mikrolitern 0,2 Millimol Natrium-EDTA resuspendieren. Die Probe eine Stunde lang auf Eis inkubieren, wobei gelegentlich vorsichtig pipettiert wird, um sie zu mischen.Nach einer Zentrifugation bei 3000 G für vier Minuten bei vier Grad Celsius das Überstand, der die freien Nukleosomen enthält, in ein neues Fuge-Röhrchen sammeln und auf Eis lagern, um zusätzliche Nukleosomen erneut zu verwenden. Den Pellet in 300 Mikrolitern 0,2 Millimol Natrium-EDTA wie zuvor suspendieren und eine Stunde lang auf Eis unter gelegentlichem, sanftem Mischen inkubieren.Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Probe. Kombinieren Sie erneut das resultierende Überstand mit der verbleibenden Probe im Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Um den Nukleosom-ELISA zu beginnen, geben Sie eine absteigende Reihe von fünf zweifachen seriellen Verdünnungen von Nukleosomen und Beschichtungspuffer in eine 96-Loch-ELISA-Platte, beginnend mit 0,1 Mikrogramm pro 50 Mikroliter im obersten Loch; alle Verdünnungsreihen sollten im Dreifachen beladen werden.Denken Sie daran, Wells mit nur Beschichtungspuffer als Kontrollen einzuschließen. Inkubieren Sie die Platte am nächsten Tag über Nacht bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie einen Plattenwascher, um die Platten viermal bei Raumtemperatur mit jeweils 200 µL pro Well einer 0,5 %igen Lösung zwischen 20 in PBS zu waschen, insgesamt 10 Minuten.Geben Sie nun 100 Mikroliter Blockierungslösung pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur auf einem Rotator. Entfernen Sie nach der Inkubation die Blockierpufferlösung, indem Sie die umgedrehte Platte kräftig über einem Ausguss schütteln. Fügen Sie anschließend den verdünnten primären Antikörper in einem Volumen von 50 Mikrolitern pro Vertiefung in einer Lösung aus 5 % PSA in 0,05 % Tween 20 in PBS hinzu und inkubieren Sie die Lösung eine Stunde lang auf einem Rotator bei Raumtemperatur.Nach der Inkubation mit dem primären Antikörper die Platten wie zuvor mit dem Plattenwascher waschen. Sobald der Waschvorgang abgeschlossen ist, 50 Mikroliter pro Mulde eines mit Meerrettichperoxidase konjugierten sekundären Antikörpers hinzufügen, der in PBS mit 5 % BSA und 0,5 % Tween 20 verdünnt ist, und eine Stunde bei Raumtemperatur auf einem Rotator inkubieren. Anschließend die Platten erneut wie zuvor waschen.Entwicklung der Platte mithilfe des Plattenwäschers. Fügen Sie 50 Mikroliter TMB-ELIZA-Substrat zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten lang. Bei Raumtemperatur färben sich die Brunnen der ELIZA-Platte blau, wobei die Intensität der Färbung proportional zur Menge an Nukleosommodifikationen in jedem Brunnen ist.Dann beenden Sie die Reaktion, indem Sie 50 Mikroliter pro Vertiefung zweinormaler Schwefelsäure hinzufügen. Die Farbe wechselt zu braun; zentrifugieren Sie die Platte bei 1500 U/min für zwei Minuten, um eventuelle Luftblasen aufzulösen.Die Platte ist nun bereit zur Quantifizierung mittels eines farbmetrischen Plattenlesegeräts. Abschließend die Platte bei 450 Nanometern auslesen und die Ergebnisse zur Analyse exportieren. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie nach ihrer Entwicklung in zwei Tagen durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.Diese Technik eröffnete Forschern auf dem Gebiet der Stammzellforschung die Möglichkeit, epigenetische Reaktionen auf Differenzierungs- und Reprogrammierungsereignisse auf der Ebene des gesamten Epi-Proteoms zu untersuchen.

detection-post-translational-modifications-on-native-intact

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ubiquitinierung ist ein wichtiger posttranslationale Modifikation durch eine Gruppe von drei Enzymen durchgeführt. Mutationen von Genen in dieser Modifikation beteiligt sind mit vielen verschiedenen menschlichen Krankheiten assoziiert. Hier beschreiben wir Protokolle, um Protein-Ubiquitinierung in kultivierten Zellen...

Detektion von Protein Ubiquitination

Durch die Kombination von nativen und Vernetzungs Chromatinimmunpräzipitation mit hochauflösender Massenspektrometrie ermöglicht ChroP Ansatz, um die Verbund Proteom-Architektur der Histon-Modifikationen, Varianten und Nicht-Histon-Proteine ​​synergizing bei funktionell unterschiedlichen Chromatindomänen sezieren.

Der Ansatz kombiniert ChroP ChIP und Massenspektrometrie zu sezieren Locus-spezifische Proteomik Landschaften des Chromatin

Hier beschreiben wir biochemische Assays, die zur Charakterisierung von ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Enzymen verwendet werden können, um 1) ATP-abhängiges Nukleosomengleiten zu katalysieren, 2) mit Nukleosomensubstraten zu interagieren und 3) ATP auf nukleosomen- oder DNA-abhängige Weise zu hydrolysieren.

Biochemischen Assays zur Analyse von Aktivitäten von ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Enzyme

Dieses Protokoll beschreibt einen voll integrierten Workflow für die Charakterisierung von Histon-post-translationale Modifikationen mittels Massenspektrometrie (MS). Der Workflow umfasst Histon-Reinigung aus Zellkulturen oder Geweben, Histon-Derivatisierung und Verdauung, MS-Analyse unter Verwendung von Nano-Flow-Flüssigkeitschromatographie und Anweisungen für die Datenanalyse. 3 Tage - Das Protokoll wird innerhalb von 2 für die Fertigstellung konzipiert.

Komplette Workflow zur Analyse von Histon-post-translationale Modifikationen Mit Bottom-up-Massenspektrometrie: Von Histone Extraktion in Datenanalyse

Dieses Protokoll beschreibt die Rekonstitution von Nukleosomen unterschiedlich isotopenmarkierten Schwester Histone enthält. Zur gleichen Zeit, asymmetrisch posttranslational modifiziert Nukleosomen kann nach der Verwendung eines Histon vormodifiziert Kopie erzeugt werden. Diese Präparate können leicht zu untersuchen Modifikationsübersprechmechanismen verwendet werden, gleichzeitig auf beiden Schwester Histone, durch hochauflösende NMR-Spektroskopie.

Rekonstitution von Nukleosomen mit differentiell isotopenmarkierten Schwester Histone

Wir präsentieren Ihnen eine effektive und reproduzierbare Methode zum isolieren und Kultur neurale Vorläuferzellen aus embryonalen und postnatale Hirngewebe für Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) von Histon 3 Lysin 79 Dimethylation (H3K79me2) - eine Histon-Markierung befindet sich innerhalb der globulären Domäne des Histon 3.

Isolierung und Kultivierung von neuronalen Vorläuferzellen gefolgt von Chromatin Immunopräzipitation Histon 3 Lysin 79 Dimethylation Marke

Untersuchung mehrere, können endogene post-translationalen Modifikationen für ein Zielprotein extrem schwierig sein. Hier beschriebene Techniken nutzen eine optimierte Lyse Puffer und Filter System entwickelt mit spezifischen PTM-targeting, Affinität Matrizen, die Acetylierung, Ubiquitination, Sumoylierung 2/3 und Tyrosin Phosphorylierung Änderungen für ein Ziel zu erkennen Protein mit einem einzigen, gestrafften System.

Nutzung eines umfassenden Immunopräzipitation Bereicherung System um eine endogene Post-translationale Modifikation Profil für Zielproteine zu identifizieren

Ubiquitination ist eine post-translationale Modifikation, die eine wichtige Rolle in zellulären Prozessen spielt und durch Deubiquitination eng koordiniert wird. Defekte in beiden Reaktionen liegen den menschlichen Pathologien zugrunde. Wir bieten Protokolle zur Durchführung von Ubiquitination und Deubiquitination Reaktion in vitro mit gereinigten Komponenten.

In Vitro Ubiquitination und Deubiquitination Assays von Nucleleosomalhistones

Das vorliegende Protokoll zeigt eine modifizierte Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung von DNA-Protein-Crosslinks (DPCs) und deren posttranslationalen Modifikationen (PTMs), einschließlich Ubiquitylierung, SUMOylierung und ADP-Ribosylierung, die durch Topoisomerase-Inhibitoren und Formaldehyd induziert werden, wodurch die Bildung und Reparatur von DPCs und ihren PTMs untersucht werden kann.

Quantitativer Nachweis von DNA-Protein-Vernetzungen und deren posttranslationale Modifikationen

Ein analytischer Arbeitsablauf, der auf Flüssigkeitschromatographie, Mobilitätsspektrometrie mit gefangenen Ionen und Flugzeit-Massenspektrometrie (LC-TIMS-ToF MS/MS) basiert, für eine hochzuverlässige und hochgradig reproduzierbare "Bottom-up"-Analyse von Histonmodifikationen und -identifizierung basierend auf Hauptparametern (Retentionszeit [RT], Kollisionsquerschnitt [CCS] und genaues Masse-zu-Ladungs-Verhältnis [m/z]).

Histonmodifikations-Screening mittels Flüssigkeitschromatographie, Ionenmobilitätsspektrometrie und Flugzeit-Massenspektrometrie

Genetische Varianten im menschlichen Spindlin-Familienmitglied 4 (SPIN4) wurden kürzlich bei Patienten mit Knochenüberwucherung identifiziert, einer neuartigen Entwicklungsstörung. Ein Protokoll und neue Ergebnisse zur Beschreibung der biochemischen Identifikation modifizierter Histone im Kontext von Nukleosomen als SPIN4-bindende Substrate werden präsentiert.

Identifikation modifizierter Histone als bindende Substrate des menschlichen Spindlin-Familienmitglieds 4 (SPIN4) mittels Peptidarrays und natives Nukleosomen-Pulldowns

Erfahren Sie die Nukleosom-ELISA-Methode zur Erkennung post-translationaler Modifikationen in Chromatin. Diese Technik liefert eine globale Übersicht über Epigenetik und Stammzellbiologie.

Erkennung von Post-translationale Modifikationen auf Native Intact Nukleosomen mittels ELISA

Weitere Videos entdecken