Erkennung von Post-translationale Modifikationen auf Native Intact Nukleosomen mittels ELISA
26. April 2011
Nucleosome ELISA (NU-ELISA) ist eine sensible und quantitative Methode zur globalen Muster der post-translationale Modifikationen in Zubereitungen native, intakte Nukleosomen zu erkennen. Diese Änderungen umfassen Methylierungen, Acetylierungen und Phosphorylierungen an bestimmten Histon Aminosäurereste und damit NU-ELISA bietet eine globale Proteom-Test des Gesamtsystems Chromatin Modifikation Staaten von spezifischen Zelltypen.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die relativen Mengen an posttranslationalen Modifikationen in Präparationen von gesamten zellulären Nukleosomen, die aus einer Million Zellen gewonnen wurden, genau zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst hochwertige, homogene Kulturen von Säugetierzellen hergestellt werden. Anschließend werden die Zellkerne durch mechanische Zerstörung mit einem Dounce-Homogenisator und Zentrifugation isoliert.
Der nächste Schritt besteht darin, intakte Nukleosomen zu gewinnen, indem die im Zellkern vorhandene Chromatin-DNA verdaut und eine Reihe hypotonischer Extraktionen durchgeführt wird. Abschließend werden die Nukleosomen mithilfe eines ELIZA-Assays unter Verwendung geeigneter Kontrollen untersucht, um spezifische posttranslationale Modifikationen nachzuweisen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die relativen Konzentrationen bestimmter Modifikationen in den Nukleosomenproben anzeigen.
Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie der Western-Blot-Analyse und der Chromatin-Immunpräzipitation besteht darin, dass ein umfassender Überblick über zahlreiche Zustände der Nukleosomenmodifikation leicht ermittelt werden kann. Die Methode ist deutlich empfindlicher und genauer als die Western-Blot-Analyse und kann in den meisten Laboren durchgeführt werden, die für allgemeine molekularbiologische Experimente ausgestattet sind. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Stammzellenforschung und Epigenetik zu beantworten, beispielsweise, was geschieht, wenn wichtige Differenzierungs- und Reprogrammierungsereignisse stattfinden.
Um das Verfahren zu beginnen, setzen Sie zunächst die Zellen mit drei Millilitern Trypsin pro 15-Zentimeter-Platte an, um frisch trypsinierte Zellen zu erhalten. Geben Sie 20 Milliliter eiskalte PBS-Butyratlösung hinzu. Überführen Sie die Zellen in ein 50-Milliliter-Konischglas und zentrifugieren Sie das Gefäß, um die Zellen bei 1000 U/min fünf Minuten lang zu pelletieren. Aspirieren Sie den Überstand und geben Sie 10 Milliliter eiskalte PBS-Butyratlösung zum Waschen hinzu. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension erneut bei 1000 U/min fünf Minuten lang.
Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in vier Milliliter Lysepuffer mit Proteaseinhibitoren, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Danach pipettieren Sie die Zellen in einen Homogenisator mit A-Typ-B-Pestel und homogenisieren sie auf Eis mit 20 Hubstößen. Anschließend überführen Sie das Homogenat in ein Zentrifugenröhrchen auf Eis.
Zentrifugieren Sie die Probe bei 2000 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie das Überstand, der das zytoplasmatische Material und Resus enthält.
Suspendieren Sie das Pellet in zwei Milliliter eiskaltem Waschpuffer C mit Proteaseinhibitoren, und schichten Sie das resuspendierte Material vorsichtig auf ein fünf Milliliter großes 30%-Saccharose-Kissen in einem kalten Zentrifugenröhrchen. Um die Kerne zu isolieren, zentrifugieren Sie bei 2.400 ×g für fünf Minuten in einem Schwenkkorbrotor; die Kerne wandern durch das Kissen, während zelluläre Trümmer an der Grenzfläche verbleiben. Entfernen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig das gesamte Flüssigkeitsvolumen und resuspendieren Sie die Kerne in 250 Mikroliter eiskaltem Waschpuffer C mit Proteaseinhibitoren. Überführen Sie anschließend die Kerne in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.
Um mit der Isolierung von Nukleosomen zu beginnen, geben Sie drei Mikroliter einer 0,1-molaren Calciumchloridlösung zu den Zellkernen hinzu und stellen Sie diese in einen Wärmeprobehalter bei 37 Grad Celsius, bis die Temperatur ausgeglichen ist. Fügen Sie anschließend zwei Einheiten Mikrococcal-Nuklease in 10 Mikrolitern Mikrococcal-Nuklease-Puffer hinzu und inkubieren Sie 12 Minuten bei 37 Grad Celsius. Mischen Sie die Probe häufig mit einer Pipettenspitze.
Nach der Inkubation die Reaktion mit sechs Mikrolitern 0,5 M Natrium-EDTA-pH 8 stoppen und zur Abkühlung auf Eis stellen. Anschließend die Probe bei 2000 ×g vier Minuten lang zentrifugieren, nach der Zentrifugation das Überstand entfernen und das Pellet in 300 Mikrolitern 0,2 Millimol Natrium-EDTA resuspendieren. Die Probe eine Stunde lang auf Eis inkubieren, wobei gelegentlich vorsichtig pipettiert wird, um sie zu mischen.
Nach einer Zentrifugation bei 3000 G für vier Minuten bei vier Grad Celsius das Überstand, der die freien Nukleosomen enthält, in ein neues Fuge-Röhrchen sammeln und auf Eis lagern, um zusätzliche Nukleosomen erneut zu verwenden. Den Pellet in 300 Mikrolitern 0,2 Millimol Natrium-EDTA wie zuvor suspendieren und eine Stunde lang auf Eis unter gelegentlichem, sanftem Mischen inkubieren.
Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Probe. Kombinieren Sie erneut das resultierende Überstand mit der verbleibenden Probe im Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Um den Nukleosom-ELISA zu beginnen, geben Sie eine absteigende Reihe von fünf zweifachen seriellen Verdünnungen von Nukleosomen und Beschichtungspuffer in eine 96-Loch-ELISA-Platte, beginnend mit 0,1 Mikrogramm pro 50 Mikroliter im obersten Loch; alle Verdünnungsreihen sollten im Dreifachen beladen werden.
Denken Sie daran, Wells mit nur Beschichtungspuffer als Kontrollen einzuschließen. Inkubieren Sie die Platte am nächsten Tag über Nacht bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie einen Plattenwascher, um die Platten viermal bei Raumtemperatur mit jeweils 200 µL pro Well einer 0,5 %igen Lösung zwischen 20 in PBS zu waschen, insgesamt 10 Minuten.
Geben Sie nun 100 Mikroliter Blockierungslösung pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur auf einem Rotator. Entfernen Sie nach der Inkubation die Blockierpufferlösung, indem Sie die umgedrehte Platte kräftig über einem Ausguss schütteln. Fügen Sie anschließend den verdünnten primären Antikörper in einem Volumen von 50 Mikrolitern pro Vertiefung in einer Lösung aus 5 % PSA in 0,05 % Tween 20 in PBS hinzu und inkubieren Sie die Lösung eine Stunde lang auf einem Rotator bei Raumtemperatur.
Nach der Inkubation mit dem primären Antikörper die Platten wie zuvor mit dem Plattenwascher waschen. Sobald der Waschvorgang abgeschlossen ist, 50 Mikroliter pro Mulde eines mit Meerrettichperoxidase konjugierten sekundären Antikörpers hinzufügen, der in PBS mit 5 % BSA und 0,5 % Tween 20 verdünnt ist, und eine Stunde bei Raumtemperatur auf einem Rotator inkubieren. Anschließend die Platten erneut wie zuvor waschen.
Entwicklung der Platte mithilfe des Plattenwäschers. Fügen Sie 50 Mikroliter TMB-ELIZA-Substrat zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten lang. Bei Raumtemperatur färben sich die Brunnen der ELIZA-Platte blau, wobei die Intensität der Färbung proportional zur Menge an Nukleosommodifikationen in jedem Brunnen ist.
Dann beenden Sie die Reaktion, indem Sie 50 Mikroliter pro Vertiefung zweinormaler Schwefelsäure hinzufügen. Die Farbe wechselt zu braun; zentrifugieren Sie die Platte bei 1500 U/min für zwei Minuten, um eventuelle Luftblasen aufzulösen.
Die Platte ist nun bereit zur Quantifizierung mittels eines farbmetrischen Plattenlesegeräts. Abschließend die Platte bei 450 Nanometern auslesen und die Ergebnisse zur Analyse exportieren. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie nach ihrer Entwicklung in zwei Tagen durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.
Diese Technik eröffnete Forschern auf dem Gebiet der Stammzellforschung die Möglichkeit, epigenetische Reaktionen auf Differenzierungs- und Reprogrammierungsereignisse auf der Ebene des gesamten Epi-Proteoms zu untersuchen.
Übersicht
Das Nukleosom-ELISA (NU-ELISA) ist eine empfindliche Methode zum Nachweis posttranslationaler Modifikationen in Nukleosomen. Diese Technik ermöglicht es Forschern, den globalen Zustand der Chromatinmodifikation in verschiedenen Zelltypen zu bewerten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Epigenetik
Hintergrund
- NU-ELISA detektiert Modifikationen wie Methylierungen, Acetylierungen und Phosphorylierungen.
- Es liefert einen globalen proteomischen Assay für Chromatinzustände.
- Diese Methode ist empfindlicher und genauer als herkömmliche Techniken wie die Westernblotting.
- NU-ELISA kann in Standard-Laboren der Molekularbiologie durchgeführt werden.
Zweck der Studie
- Um die relativen Spiegel posttranslationaler Modifikationen in Nukleosomen zu bestimmen.
- Um chromatinale Modifikationen während Differenzierungs- und Reprogrammierungsereignisse zu verstehen.
- Um Einblicke in die Stammzellbiologie und Epigenetik zu gewinnen.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Säugerzellkulturen und Isolierung von Zellkernen.
- Verdauung von Chromatin zur Gewinnung intakter Nukleosomen.
- Durchführung eines ELISA-Assays zur Quantifizierung von Nukleosomenmodifikationen.
- Verwendung von Kontrollen und seriellen Verdünnungen für eine genaue Messung.
Hauptergebnisse
- Das NU-ELISA bietet einen umfassenden Überblick über die Modifikationszustände von Nukleosomen.
- Die Ergebnisse zeigen die relativen Konzentrationen spezifischer Modifikationen in Nukleosomenproben an.
- Die Methode weist eine höhere Empfindlichkeit im Vergleich zu bestehenden Techniken auf.
- Die Befunde können die Forschung zur Stammzellen-Differenzierung und Epigenetik beeinflussen.
Schlussfolgerungen
- NU-ELISA ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung von Chromatinmodifikationen.
- Die Technik vertieft das Verständnis zellulärer Prozesse in der Neurowissenschaft und Biologie.
- Sie erschließt neue Ansatzpunkte für zukünftige Forschung zur epigenetischen Regulation.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Eine genaue Quantifizierung posttranslationaler Modifikationen an nativen Nukleosomen ermöglicht die mechanistische Absicherung epigenetischer Zielstrukturen in der frühen Entdeckungsphase. NU-ELISA liefert einen empfindlichen, globalen Nachweis chromatinbezogener Zustände, der die Zielstrukturvalidierung und die Assay-Entwicklung für die auf Epigenetik ausgerichtete Arzneimittelentwicklung unterstützt. Diese Methode erhöht die Vorhersagesicherheit, indem sie Modifikationsmuster mit funktionellen Ergebnissen in Modellen der Stammzelldifferenzierung und -reprogrammierung verknüpft.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Messung globaler PTM-Signaturen an intakten Nukleosomen.
- Operationaler Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch eine quantitative, reproduzierbare Beurteilung der Landschaft histonischer Modifikationen.
- Prädiktiver Wert: Fördert das Vertrauen in Zielstrukturen, indem Nukleosomen-PTM-Profile mit der transkriptionellen Aktivität in krankheitsrelevanten Systemen korreliert werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt standardisierte Nukleosom-Präparationen, die für die nachgeschaltete ELISA-basierte Identifizierung epigenetischer Modulatoren geeignet sind.
- Quantitativer Output: Liefert dosisabhängige, lineare Messwerte mittels serieller Verdünnung, die die Bestätigung von Hits und die Optimierung von Wirkstoffkandidaten ermöglichen.
- Plattformwiederverwendung: Kompatibel mit gängiger ELISA-Infrastruktur, wodurch eine skalierbare Anpassung an verschiedene histonische PTM-Ziele möglich ist.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Verbindet den Modifikationszustand von Nukleosomen mit epigenetischen Mechanismen bei der Differenzierung und Reprogrammierung von Stammzellen.
- Translationale Kontinuität: Unterstützt die Abstimmung von Biomarkern, indem sie die Dynamik posttranslationaler Modifikationen über zelluläre Zustände hinweg verfolgt, die für Krankheitsmodelle relevant sind.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Liefert Entscheidungsgrundlagen für Go/No-Go-Entscheidungen, indem sie mechanistische Einblicke in die Wirkung von Substanzen auf die Chromatinregulation bereitstellt.
Pipeline- und Workflow-Integration
NU-ELISA ist in den Entdeckungsworkflow der Epigenetik integriert, der von der Testung der Zielhypothese über die Identifizierung von Leitstrukturen bis hin zur präklinischen Validierung reicht, und liefert quantitative Daten zum Chromatinzustand.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch Messung von PTM-Änderungen als Reaktion auf genetische oder pharmakologische Störungen.
- Screening: Ermöglicht die Entwicklung von Assays für das Screening epigenetischer Modulatoren mit hoher Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit.
- Analytik: Erzeugt quantitative Daten auf Modifikationsebene, die Vergleiche über verschiedene experimentelle Bedingungen und Zeitpunkte hinweg ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet mit präklinischen Arbeiten, indem sie Chromatinveränderungen modelliert, die bei Differenzierung und Reprogrammierung beobachtet werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Profilierung von Nukleosomen-PTMs über mehrere Zelllinien und Behandlungsbedingungen hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet vorhersagbare Sicherheit bei der Target-Validierung durch direkte Messung nativer nucleosomaler PTMs.
- Operationaler Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch ein kontrolliertes ELISA-Format mit interner Verdünnungsreihe.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem die Abhängigkeit von methoden mit geringer Durchsatzleistung und halbquantitativen Verfahren wie der Western Blotting reduziert wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung epigenetischer Targets basierend auf Modifikationsdynamiken in krankheitsrelevanten Modellen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Chromatin-Biochemie und ELISA-Optimierung.
- Basiert auf dem Zugang zu Zentrifugation, Wärmeblöcken und Mikroplatten-Readern, wie sie in molekularbiologischen Laboren üblich sind.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen hinsichtlich der Antikörper-Validierung und der Konsistenz bei der Nukleosom-Isolierung.
- Zu berücksichtigende Anpassungsaspekte sind die Titration von Mikrokokkal-Nuklease sowie die Optimierung der Salzbedingungen für verschiedene Zelltypen.
- Praktische Einschränkungen bestehen in der Abhängigkeit von hochwertigen Antikörpern und der möglichen Variabilität der Nukleosom-Extraktions-Effizienz.
