Erkennung von Post-translationale Modifikationen auf Native Intact Nukleosomen mittels ELISA

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die relativen Niveaus posttranslationaler Modifikationen innerhalb von Präparaten von zellulären Gesamtnukleosomen, die aus einer Million Zellen gewonnen wurden, genau zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst qualitativ hochwertige homogene Kulturen von Säugetierzellen hergestellt werden. Dann werden die Zellkerne durch mechanische Aufschluss mit einem Downs, einem Homogenisator und einer Zentrifugation aus den Zellen isoliert.

Der nächste Schritt besteht darin, intakte Nukleosomen zu erhalten, indem das in den Zellkernen vorhandene Chromatin verdaut und eine Reihe von hypotonen Extraktionen durchgeführt wird. Schließlich werden die Nukleosomen mit einem ELIZA-Assay mit den entsprechenden Kontrollen abgefragt, um spezifische posttranslationale Modifikationen zu identifizieren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die das relative Ausmaß spezifischer Modifikationen in Nukleosomenproben zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Western Blotting und Chromatin-Immunpräzipitation besteht darin, dass ein globales Bild einer Reihe von Nukleosomenmodifikationszuständen leicht bestimmt werden kann. Die Methode ist viel empfindlicher und genauer als Western Blotting und kann in den meisten Labors durchgeführt werden, die für allgemeine molekularbiologische Experimente ausgestattet sind. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Stammzell- und Epigenetik zu beantworten, z. B. was passiert, wenn wichtige Differenzierungs- und Reprogrammierungsereignisse auftreten.

Zu Beginn des Eingriffs anisiert Tryps zunächst die Zellen mit drei Millilitern Trypsin pro 15 Zentimeter großer Platte zu frisch tryps inisierten Zellen. Fügen Sie 20 Milliliter eiskaltes PBS-Butyrat hinzu. Übertragen Sie die Zellen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie das Röhrchen, um die Zellen fünf Minuten lang bei 1000 U/min zu sammeln, saugen Sie den Überstand an und fügen Sie 10 Milliliter eiskaltes PBS-Butyrat hinzu, um die Zellsuspension erneut fünf Minuten lang bei 1000 U/min zu waschen und zu zentrifugieren.

Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in vier Millilitern Lysepuffer mit Proteaseinhibitoren, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Pipettieren Sie anschließend die Zellen in einen Stößel-Down-Homogenisator vom Typ B auf Eis-Down-Homogenisierung mit 20 Hüben. Anschließend wird das Homogenat in ein Zentrifugenröhrchen auf Eis umgefüllt.

Die Probe wird 10 Minuten lang bei 2000 g zentrifugiert. Bei vier Grad Celsius. Entferne den Supernamen, der das zytoplasmatische Material und die Reanimation enthält.

Suspendieren Sie das Pellet in zwei Millilitern eiskaltem Waschpuffer C Mit Proteaseinhibitoren schichten Sie das resuspendierte Material vorsichtig auf ein fünf Milliliter Kissen mit 30 % Saccharose in einem kalten Zentrifugenröhrchen. Um die Zellkerne zu isolieren, zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 2.400 G in einem Schwingeimer, wobei die Rotorkerne durch das Kissen wandern und zelluläre Trümmer an der Grenzfläche verbleiben. Nach der Zentrifugation vorsichtig das gesamte Flüssigkeitsvolumen entfernen und die Zellkerne in 250 Mikrolitern eiskaltem Waschpuffer C mit Proteaseinhibitoren erneut suspendieren, die Kerne in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen.

Um mit der Isolierung der Nukleosomen zu beginnen, fügen Sie den Zellkernen drei Mikroliter 0,1 molares Calciumchlorid hinzu und legen Sie sie in einen 37 Grad Celsius heißen Block, bis die Temperatur ausgeglichen ist. Geben Sie dann zwei Einheiten Mikro-Kocal-Nuklease in 10 Mikroliter Mikro-Kocal-Nuklease, puffern Sie und inkubieren Sie 12 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Mischen Sie häufig mit einer Pipettenspitze.

Nach der Inkubation die Reaktion mit sechs Mikrolitern 0,5 molaren Natrium E-D-T-A-P-H acht stoppen und zum Abkühlen auf Eis legen. Anschließend wird die Probe nach der Zentrifugation vier Minuten lang bei 2000 g zentrifugiert, die Schlinge verworfen und das Pellet wieder suspendiert. Inkubieren Sie die Probe in 300 Mikrolitern 0,2 Millimol oder Natrium-EDTA eine Stunde lang auf Eis und wiederholen Sie sie durch leichtes Pipettieren zum Mischen.

Nach einer Zentrifugation bei 3000 g für vier Minuten. Bei vier Grad Celsius sammelt man den Überstand, der die freien Nukleosomen enthält, in einem neuen Fuge-Röhrchen und lagert auf Eis gezielt weitere Nukleosomen reus. Suspendieren Sie das Pellet wie zuvor in 300 Mikrolitern 0,2 Millimol oder Natrium EDT und inkubieren Sie eine Stunde lang auf Eis mit gelegentlichem sanftem Mischen.

Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Probe. Kombinieren Sie die resultierende Schlinge erneut mit der restlichen Probe in der Mikrofuge-Röhre auf Eis. Um mit dem Nukleosomen-Eliza-Assay zu beginnen, laden Sie eine 96-Well-Eliza-Platte mit einer absteigenden Reihe von fünf zweifachen seriellen Verdünnungen von Nukleosomen und Beschichtungspuffer, beginnend mit 0,1 Mikrogramm pro 50 Mikroliter in der oberen Vertiefung, sollten alle Verdünnungsreihen in dreifacher Ausfertigung geladen werden.

Denken Sie daran, Vertiefungen mit Beschichtungspuffer nur als Kontrollen einzuschließen. Inkubieren Sie die Platte am nächsten Tag über Nacht bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie eine Tellerwaschmaschine, um die Platten mit 200 Mikrolitern pro Vertiefung von 0,5 % zwischen 20 in PBS bei Raumtemperatur viermal für insgesamt 10 Minuten zu waschen.

Geben Sie nun 100 Mikroliter Blockierlösung pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem Rotator. Entfernen Sie nach der Inkubation den Blockierungspuffer, indem Sie die umgedrehte Platte kräftig über eine Spüle schütteln. Als nächstes fügen Sie den verdünnten Primärantikörper in einem Volumen von 50 Mikrolitern pro Vertiefung in einer Lösung von 5 % PSA in 0,05 % zwischen 20 in PBS hinzu und inkubieren Sie die Lösung eine Stunde lang auf einem Rotator bei Raumtemperatur.

Waschen Sie die Platten nach der Inkubation des Primärantikörpers wie zuvor mit der Plattenwaschmaschine. Sobald der Waschvorgang abgeschlossen ist, fügen Sie 50 Mikroliter pro Vertiefung Meerrettichperoxidase-konjugierten Sekundärantikörper hinzu, der in PBS mit 5 % BS, A und 0,5 %20 verdünnt ist und nach der Inkubation des Sekundärantikörpers eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem Rotator inkubiert. Waschen Sie die Teller wie zuvor.

Verwenden Sie die Tellerwaschmaschine, um die Platte zu entwickeln. Geben Sie 50 Mikroliter TMB Eliza-Substrat in jede Vertiefung und inkubieren Sie 10 Minuten lang. Bei Raumtemperatur färben sich die Vertiefungen der ELIZA-Platte blau und die Intensität ist proportional zur Menge der in jeder Vertiefung vorhandenen Nukleosomenmodifikationen.

Na dann stoppt die Reaktion. Durch Zugabe von 50 Mikrolitern pro Vertiefung von zwei normalen Schwefelsäuren. Die Farbe ändert sich in Braun: Zentrifugieren Sie die Platte zwei Minuten lang bei 1500 U/min, um eventuelle Luftblasen abzuleiten.

Die Platte ist nun bereit für die Quantifizierung auf einem farbmetrischen Plattenlesegerät. Lesen Sie abschließend die Platte bei 450 Nanometern ab und exportieren Sie die Ergebnisse zur Analyse. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Tagen durchgeführt werden, wenn sie nach ihrer Entwicklung richtig ausgeführt wird.

Diese Technik öffnete Forschern auf dem Gebiet der Stammzellforschung die Tür, um epigenetische Reaktionen auf Differenzierungs- und Reprogrammierungsereignisse auf der Ebene des gesamten Epiproteoms zu erforschen.