Komplette Workflow zur Analyse von Histon-post-translationale Modifikationen Mit Bottom-up-Massenspektrometrie: Von Histone Extraktion in Datenanalyse

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, ein einfaches Verfahren bereitzustellen, um die relative Häufigkeit von posttranslationalen Histonmodifikationen zu bewerten, die wesentliche Rollen in der Chromatinbiologie spielen, beispielsweise bei der Regulation der Genexpression und der Chromosomenkondensation. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Chromatinbiologie zu beantworten, etwa welche Histonmodifikationen ihre relative Häufigkeit bei Stimulation oder Behandlung bestimmter Zellen oder Gewebe verändern.

Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass wir mit der massenspektrometriebasierten Proteomik die meisten bekannten PTMs an bekannten Proteinen in einer einzigen Analyse gleichzeitig quantifizieren können. Die Analyse von Histonmodifikationen hat zahlreiche Anwendungen, darunter die Abschätzung epigenetischer Veränderungen und der Chromatinfunktion von Individuen oder Modellsystemen nach Behandlung mit Wirkstoffen oder Stress. Neben Simone werden zwei weitere Mitglieder meines Labors die Verfahren dieses Protokolls demonstrieren.

Natarajan Bhanu, ein Forschungsspezialist, und Kelly Karch, eine Doktorandin. Wie in diesem Arbeitsablauf gezeigt, handelt es sich um ein 10-Schritte-Protokoll, das die Histonenreinigung aus Zellkulturen oder Geweben, die Derivatisierung der Histone, Verdauung und Entsalzung sowie die Massenspektrometrie-Analyse mittels Nanoflow-Flüssigkeitschromatographie umfasst. In diesem Video werden nur ausgewählte Verfahren veranschaulicht.

Um mit dem Verfahren zur Isolierung von Kernen aus intakten Zellen zu beginnen, tauen Sie auf Eis Zellen auf, die zuvor gewonnen und bei minus 80 Grad Celsius gelagert wurden. Bereiten Sie außerdem den Kernisolationspuffer (NIB) gemäß der Beschreibung im Protokolltext vor. Entnehmen Sie ein Fünftel des Volumens an NIB und geben Sie NP-40 Alternative hinzu, um eine Endkonzentration von 0,2 % zu erreichen. Das verbleibende Volumen von vier Fünfteln wird für die Waschschritte verwendet.

Waschen Sie das Zellpellet mit NIB ohne NP-40 Alternative unter Verwendung eines 1:10-Verhältnisses von Zellpelletvolumen zu Puffervolumen. Zentrifugieren Sie bei 700 RCF für fünf Minuten und entfernen Sie den Überstand. Lyse das Zellpellet, indem Sie es auf Eis stellen und NIB mit 0,2 % NP-40 Alternative im Verhältnis von 1:10 (Zellpelletvolumen zu Puffervolumen) hinzufügen.

Homogenisieren Sie die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren. Inkubieren Sie die homogenisierten Zellen fünf bis 10 Minuten auf Eis, damit die Zellen lysieren und die Kerne freisetzen. Zentrifugieren Sie bei 1000 RCF fünf bis 10 Minuten bei vier Grad Celsius.

Das Pellet enthält hauptsächlich Zellkerne, während der Überstand überwiegend zytoplasmatische Bestandteile enthält. Bewahren Sie die zytoplasmatische Fraktion gegebenenfalls auf. Waschen Sie das Pellet der Kerne, indem Sie es vorsichtig in NIB ohne NP-40 Alternative unter Verwendung eines 1:10-Verhältnisses von Pelletvolumen zu Puffervolumen erneut suspendieren.

Zentrifugieren Sie bei 1000 RCF für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und entfernen Sie den Überstand. Nachdem das NP-40-Alternative vollständig aus dem Nuklei-Pellet entfernt wurde, geben Sie eiskalte 0,2-molare Schwefelsäure im Verhältnis von 1:5 (Volumen der Nuklei zu Volumen der Schwefelsäure) hinzu. Lösen Sie die Nuklei durch vorsichtiges Pipettieren in der Schwefelsäure wieder auf.

Die Probe unter konstanter Rotation oder vorsichtigem Schütteln zwei bis vier Stunden bei vier Grad Celsius inkubieren. Anschließend die Probe bei 3400 RCF und vier Grad Celsius fünf Minuten lang zentrifugieren und den Überstand in ein neues Gefäß überführen. Danach erneut zentrifugieren und den Überstand in ein neues Gefäß überführen, um ungelöste Bestandteile zu entfernen.

Um die Histone auszufällen, geben Sie kalte, 100%ige Trichloressigsäure (TCA) im Volumenverhältnis 1:3 zum gesammelten Überstand hinzu. Das Vorhandensein von Histonen zeigt sich durch eine Trübung der Probe. Mischen Sie durch mehrmaliges Vorsichtiges Umstülpen des Reaktionsgefäßes.

Die Mischung mindestens eine Stunde auf Eis inkubieren. Bei 3400 RCF fünf Minuten lang zentrifugieren. Nach der Zentrifugation werden die Histone die Röhrenwände bedecken und sich ebenfalls am Boden ablagern.

Ein weißes, unlösliches Pellet bildet sich ebenfalls am untersten Ende des Röhrchens, das hauptsächlich Nicht-Histon-Proteine und andere Biomoleküle enthält. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Absaugen, ohne die Röhrchenwände oder das Pellet am Boden des Röhrchens abzukratzen. Spülen Sie das Röhrchen unter Verwendung einer gläsernen Pasteurpipette mit 100 % eiskalter Acetonlösung plus 0,1 % Salzsäure aus, sodass die ausgefallenen Proteine, die die Wände und den Boden bedecken, benetzt werden.

Zentrifugieren Sie bei 3400 RCF für zwei Minuten. Aspirieren Sie das Überstand sorgfältig, ohne die Wände oder das Pellet zu berühren. Spülen Sie das Gefäß mit 100 % eiskalter Aceton, zentrifugieren Sie erneut und entfernen Sie den Überstand, ohne die Wände oder das Pellet zu berühren.

Anschließend wird die Histonquantifizierung und Reinheitsanalyse wie im Protokolltext beschrieben durchgeführt. Eine optionale Fraktionierung von Histonvarianten mittels umgekehrter Phasen-HPLC kann ebenfalls vor der Histonderivatisierung durchgeführt werden. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Histonproben in 40 Mikrolitern 50 Millimolar Ammoniumbicarbonat, pH 8,0, lösen.

Überprüfen Sie den pH-Wert, indem Sie eine P10-Pipettenspitze ohne Ansaugen in die Probe einführen und die Pipettenspitze auf einen pH-Indikatorstreifen auftragen. Verwenden Sie Ammoniumhydroxid und Ameisensäure, um den pH-Wert auf 8,0 einzustellen. Ab diesem Punkt müssen alle Schritte, die die Verwendung von Propionsäureanhydrid beinhalten, in einem Abzug durchgeführt werden.

Verarbeiten Sie maximal drei bis vier Proben gleichzeitig, um die Reaktivität des Propionsäureanhydrids aufrechtzuerhalten. Stellen Sie das Propionylierungsreagenz frisch her, indem Sie Propionsäureanhydrid und Acetonitril im Volumenverhältnis 1:3 mischen. Geben Sie das Propionylierungsreagenz zu jeder Probe im Volumenverhältnis 1:4 hinzu.

Fügen Sie schnell Ammoniumhydroxid hinzu, um den pH-Wert der Lösung wieder auf 8,0 einzustellen. Gewöhnlich ist es geeignet, Ammoniumhydroxid im Volumenverhältnis von 1:5 zur Probe hinzuzufügen, um den pH-Wert 8,0 wiederherzustellen. Mischen Sie sofort durch Vortexen.

Überprüfen Sie den pH-Wert. Inkubieren Sie die Proben 15 Minuten bei Raumtemperatur. Nachdem alle Proben einer Propionylierung unterzogen wurden, trocknen Sie die Proben im Vakuumkonzentrator auf 10 bis 20 Mikroliter ein.

Suspensionen erneut aufnehmen oder mit ddH2O verdünnen, bis ein Endvolumen von 40 µL erreicht ist. Da Salze die Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie beeinträchtigen, müssen die Proben vor der Analyse entsalzt werden. Für dieses Video wird lediglich der Aufbau der Stage-Tips demonstriert.

Verwenden Sie eine P1000-Pipettenspitze, um eine Scheibe des C18-Materials aus einer Festphasen-Extraktionsplatte auszustanzen. Benutzen Sie eine geschmolzene Quarzkapillare, um die Mini-Scheibe aus der P1000-Spitze herauszudrücken und in den Boden einer P100- oder P200-Pipettenspitze zu befördern. Stellen Sie sicher, dass die Scheibe sicher am unteren Ende der Spitze verklemmt ist.

Wenn mehr als 25 Mikrogramm Probe entsalzt werden sollen, verwenden Sie zwei C18-Mini-Scheiben in derselben P100- oder P200-Spitze. Verwenden Sie einen Zentrifugenadapter, um die Stage-Tips in 1,5-ml- oder 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu fixieren. Spülen Sie das Harz, indem Sie es mit 50 Mikrolitern 100 % Acetonitril zentrifugieren, um das C18-Material zu aktivieren und potenzielle Verunreinigungen zu entfernen.

Die Desalzierung der Probe wird anschließend wie im Protokolltext beschrieben durchgeführt. Histone Peptide liegen in einer Vielzahl isobarer Formen vor. Zwei in der Histonenanalyse häufig vorkommende Beispiele sind dargestellt.

Das extrahierte Ionen-Chromatogramm ihrer Vorläufermasse und relativen Isotope, das oben dargestellt ist, ist identisch. Das extrahierte Ionen-Chromatogramm der Produktionen, das unten gezeigt wird, ermöglicht jedoch die Unterscheidung der beiden isobaren Formen. Nur eindeutige Fragmentionen, die rot hervorgehoben sind, sollten zur Schätzung der relativen Häufigkeit der beiden Spezies verwendet werden.

Es wurden Histone aus humanen embryonalen Stammzellen mit und ohne Retinsäurestimulation analysiert. Die relative Quantifizierung zweier Histon-H3-Peptide zeigte eine deutliche Verringerung der Acetylierung in humanen embryonalen Stammzellen, die zur Differenzierung stimuliert wurden. Dies steht im Einklang mit früheren Berichten über eine höhere Acetylierung in embryonalen Stammzellen im Vergleich zu differenzierenden Zellen.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie in drei Tagen durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Ein Tag für die Histonextraktion, der zweite Tag für die Proteinderivatisierung und den Verdau sowie der dritte Tag für die Peptidderivatisierung, das Stage-Tipping und die LC-MS-Analyse. Die Histonreinigung kann für andere Zwecke genutzt werden, die über die Analyse von Peptiden hinausgehen, einschließlich der mittleren und umfassenden Proteomik, bei der es möglich ist, kombinatorische Histonmodifikationen zu charakterisieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man histonische posttranslationale Modifikationen mithilfe der massenspektrometriebasierten Proteomik identifizieren und quantifizieren kann.