Name: Komplette Workflow zur Analyse von Histon-post-translationale Modifikationen Mit Bottom-up-Massenspektrometrie: Von Histone Extraktion in Datenanalyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Lernen Sie die Bottom-up-Massenspektrometrie zur Analyse von Histon-post-translationale Modifikationen. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Quantifizierung mehrerer PTMs für epigenetische Studien.

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Diese Arbeit wurde durch die Finanzierung von NIH Zuschüsse (DP2OD007447, R01GM110174 und R01AI118891) unterstützt.

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Das hier beschriebene Protokoll ist optimiert Kosten, Zeit und Leistung berücksichtigen. Andere Zubereitungen sind möglich, aber sie haben ihre Grenzen, insbesondere bei der Kupplung mit MS-Analyse. Zum Beispiel kann das Hochsalzextraktionsprotokoll verwendet werden Histone 26 anstelle von TCA - Fällung (Abschnitt 3) zu reinigen. Hochsalz Protokoll ist intrinsisch milder, da es nicht starken Säure nicht verwendet. Auf diese Weise bleibt säurelabile PTM und erhöht die Ausbeute der extrahierten Histone, als TCA-Fällung Co-Ausscheidungen viele andere Chromatin-Bindungsproteine. Jedoch führt Hochsalzextraktion Proben für HPLC-MS / MS zu konzentriert Salz enthält. Bei einer alternativen Herstellung können Histone Verdau ohne Propionylierung (Abschnitt 6 - 8) durchgeführt werden, beispielsweise durch Trypsin Inkubationszeit verringert und die Enzym / Substrat - Verhältnis 27 oder Verwendung ArgC als Verdauungsenzym 28-30. Jedoch Derivatisierung mit Propionsäureanhydrid wird empfohlen, da it führt zur Erzeugung von hydrophoberen Peptide, die besser in der Flüssigchromatographie zurückgehalten werden. Für chemische Derivatisierung wurde eine Vielzahl von organischen Säureanhydriden wurden bewertet und ihre Vorteile diskutiert umfassend 18. Nichtsdestoweniger erwies Propionsäureanhydrid zu den besten Kompromiß zwischen Effizienz, minimiert Nebenprodukten und verbesserter Peptid Hydrophobizität. Potenziell können Propionsäureanhydrid in der isotopisch markierte Form erworben werden; Dies ermöglicht zum Multiplexen Analyse aufgrund der Möglichkeit, mehrere Proben zu mischen und sie auf der Ebene MS auf der Basis der unterschiedlichen Massen von der schweren Etikett verliehen diskriminieren. Jedoch führt diese Analyse zu einer erhöhten Komplexität des LC-MS-Chromatogramm und verringert die Menge der Probe, die für jede einzelne Bedingung eingespritzt werden kann. In dieser Hinsicht sollten einige wichtige Aspekte des Protokolls markiert. Folgendes sollte als ch verwendet werdenecklist Fehler zu finden, in das Verfahren im Falle negativer Ergebnisse der Durchführung erhalten werden. Zuerst wird nach der Keimfällung sollte das Pellet vorsichtig mit NIB ohne NP-40 Alternative (Abschnitt 2.10) bis zur vollständigen Entfernung des Detergens (erkennbar durch das Fehlen von Blasen während des Mischens) gewaschen werden. Sie dies nicht, so würde Histon-Extraktion mit Säuren beeinträchtigen. Zweitens, nach dem Histon-Fällung mit TCA (Abschnitt 3.9) Waschungen des Pellets mit Aceton ist von entscheidender Bedeutung. Das Vorhandensein von konzentrierter Säure würde nichts schaden, den folgenden Schritt, wenn Propionylierung und Verdauung (Abschnitt 6.1) direkt durchgeführt werden. Es wäre nicht problematisch bei Histon-Fraktionierung durchgeführt wird (Teil 5). Drittens ist es wichtig, dass die Propionylierung Reaktion schnell durchgeführt wird (siehe Abschnitt 6,3-6,7). 4 aufeinander folgende Proben - mit dem gleichen Propionylierung-Mix (Propionsäureanhydrid + Acetonitril) für mehr als 3 Um dies zu tun, zu vermeiden. Darüber hinaus ist pH der wichtigste Aspekt von Trypsinverdaus (Kapitel 7). Wenn nichtrund 8,0 (7,5-8,5) wird die Verdauung unwirksam. Dies kann passieren, wenn die Probe in diesem Schritt in Propionsäure reich sein wird. NH 4 OH kann , bis Bedarf hinzugefügt werden. Auch für die Forscher vertraut mit Proteomik Workflows wird es normal fühlen, die Probe zu säuern zu Trypsinverdaus beenden. Dies sollte nicht durchgeführt werden, da es die folgende Reaktion gefährden, das heißt Propionylierung von Peptid N-Termini (Abschnitt 8.1). Schließlich wird in der gleichen Ausgabe, ist es wichtig für die Datenanalyse, die nicht-modifizierten Peptide sind eigentlich nicht unmodifizierte zu erinnern; alle freien Lysinreste und N-Termini durch Propionylierung (56,026 Da) belegt werden. Somit, keine Ergebnisse Durchführung Extrahieren Ionenchromatographie der Masse eindeutig der Peptidsequenz entsprechende führen würde. Die Einschränkungen des Verfahrens sind vor allem im Zusammenhang mit der Unfähigkeit, die kombinatorische PTMs des Erfassens, aufgrund der kurzen Peptidsequenzen, und die Vorspannungen in den wahren abun ErreichungTanz einer Modifikation, aufgrund der Tatsache, dass Peptide in verschiedenen modifizierten Formen mit unterschiedlichen Effizienzen ionisieren können. Die erste Ausgabe kann durch die Kombination dieser Technik mit einem mittleren oder Top-down - Ansatz ( zusammengefasst in 16) gelöst werden. Diese Art der Analyse, auch wenn technisch anspruchsvoller, ist ideal für die Untersuchung Koexistenz Frequenzen von Modifikationen. Darüber hinaus erlaubt es eine bessere Unterscheidung von Histon-Varianten, die nicht immer von unten nach oben erzielt werden kann, da einige Peptide, die die gleiche Sequenz in verschiedenen Histon-Varianten haben. Das zweite Problem, bezogen auf die Ionisationseffizienz kann 31 unter Verwendung einer Bibliothek von synthetischen Peptiden , gelöst werden. Dieser Ansatz gewährleistet eine genauere Abschätzung der relativen Häufigkeit von Histon-PTMs. Jedoch in den meisten Experimenten wird das gewünschte Ergebnis die relativen Veränderungen der gegebenen Änderungen zwischen analysierten Bedingungen. In diesem Fall ist eine solche Korrektur nicht erforderlich ist, aufgrund der Tatsache, dass alle Proben die gleichen bia habens. Schließlich ermöglicht dieses Protokoll für die Analyse von Histon-PTMs, die in 3 Tagen abgeschlossen werden kann nLC gekoppelt Tandem-MS verwendet wird. Vergleiche mit anderen Techniken als MS, dh Antikörpern basierende Strategien , wie in der Einleitung erwähnt, sind nicht geeignet, da sie nicht einmal annähernd dieses Niveau der Durchsatz erreichen können. Darüber hinaus Antikörper basierte Techniken erlauben nicht für die Entdeckung von neuen Modifikationen, aber sie sind auf der Bestätigung und Quantifizierung von vorhergesagten Marken, die ausschließlich auf Basis. Wir spekulieren, so dass die Bottom-up-Proteomik auf Histon-Peptide werden auf die intuitive Vorteile aufgrund der Popularität in der Proteomik Labors gewinnen in die Regulation der Histonmarkierungen zu wissen, die Protagonisten in Tuning-Genexpression und damit die Regulierung des Proteoms auswirken. Darüber hinaus enthält das beschriebene Protokoll jüngsten Verbesserungen in der Probenvorbereitung und die Software für die Datenanalyse, die auch für labora Histon-Analyse trivialere machenTorys, die nie Charakterisierung dieser Art von hyper Peptide erfahren.

Epigenetics ist als das Studium der erblichen Veränderungen in der Genexpression definiert , die durch Mechanismen entstehen andere als die zugrundeliegende DNA - Sequenz 1 zu verändern. Epigenetische Regulation ist von entscheidender Bedeutung bei der Entwicklung als der Organismus dramatische phänotypische Veränderungen erfährt, obwohl seine DNA-Gehalt ändert sich nicht. Es gibt mehrere kritische Komponenten für die richtige epigenetische Wartung erforderlich, einschließlich Histon post-translationale Modifikationen (PTMs), Histon - Varianten, nicht-kodierenden RNAs, DNA - Methylierung und DNA - Bindungsfaktoren, von denen jede 2 - Genexpression durch verschiedene Mechanismen beeinflussen. Während zum Beispiel ist die DNA - Methylierung eine hoch stabile Modifikation , die Gen - Übersetzung 3, Histonvarianten und Histon PTMs beeinflussen 4 sind viel dynamischer und Chromatin in vielfältiger Weise reprimiert. Histon-PTMs sind meist an den N-terminalen Enden lokalisiert, da sie die am meisten ausgesetzt und flexibel sind regionsdes Proteins. Allerdings ist auch die Nukleosomen Kern stark verändert im Vergleich zu durchschnittlichen Proteine ​​5. Auch wenn Histonmarkierungen haben in den letzten zehn Jahren viele Verbindungen zwischen den bekannten Histonmarkierungen und deren Funktion noch unklar sind ausführlich charakterisiert worden. Dies ist vor allem auf die Tatsache zurückzuführen, dass die meisten Histon PTM allein nicht funktionieren, sondern Funktion zusammen mit anderen PTM ( &quot;cross-talk&quot;) einen bestimmten Prozess wie Transkription 6,7 zu verändern. Zum Beispiel aktiviert die kombinatorische Markierung H3S10K14ac auf dem Gen p21 seine Transkription, die mit nur einem der beiden nicht PTMs 8 auftreten würden. Die HP1 Protein Compacts Chromatin durch die Anerkennung H3K9me2 / me3 und die Änderung in der Nähe Nukleosomen zu verbreiten. Allerdings kann HP1 nicht binden H3K9me2 / 3 , wenn die benachbarte S10 phosphoryliert ist 9. Acetylierung von H3K4 hemmt die Bindung des Proteins an spChp1 H3K9me2 / me3 in Schizosaccharomyces pombe 10. Weiterhin d das Histon Lysinemethylase PHF8 hat die höchste Nukleosomen Bindungseffizienz , wenn drei PTM H3K4me3, K9ac und K14ac 11 vorhanden sind. Diese Beispiele unterstreichen die Bedeutung der einen globalen Überblick über Histon PTM Veränderungen zu erreichen, anstatt sich auf einzelne Modifikationen. Das Vorhandensein von Sequenzvarianten erhöht auch die Komplexität der Histon-Analyse, wie Histon-Isotypen im allgemeinen stark ähnliche Sequenzen haben, aber haben oft unterschiedliche Rollen in Chromatin. Zum Beispiel hat H2A.X eine C-terminale Sequenz , die auf DNA - Schädigung im Vergleich zur kanonischen H2A 12, und es ist erforderlich für die Inaktivierung von Geschlechtschromosomen in männlichen Maus Meiose leichter 13 phosphoryliert wird; In ähnlicher Weise ersetzt CENP-A kanonische Histon H3 in Romeren 14. Trotz ihrer unterschiedlichen Funktionen teilen sich diese Varianten, einen großen Teil ihrer Aminosäuresequenz mit der jeweiligen kanonischen Histon, was es schwierig macht, sie getrennt zu identifizieren und zu quantifizieren. </p&gt; Antikörper-basierte Techniken wie Western-Blotting wurden ausgiebig angenommen Histone zu charakterisieren. Jedoch sind Antikörper-basierte Ansätze begrenzt aus den folgenden Gründen: (i) sie können nur das Vorhandensein einer Änderung zu bestätigen und kann nicht unbekannt PTMs identifizieren; (Ii) sie aufgrund des Vorhandenseins von koexistierenden Markierungen vorgespannt sind, die Bindungsaffinität beeinflussen können; (iii) sie können nicht kombinatorischen Markierungen identifizieren, da nur sehr wenige Antikörper für diesen Zweck verfügbar sind , und (iv) sie kreuzreagieren zwischen sehr ähnlichen Histonvarianten oder ähnliche PTMs (beispielsweise Di- und Trimethylierung von Lysinresten). Egelhofer et al. durch Dot - Blot oder Western mehr als 25% der kommerziellen Antikörper - Spezifität Tests fehlschlagen Blot, und unter spezifischen Antikörpern mehr als 20% scheitern in Chromatinimmunpräzipitation Experimente 15 beschrieben ist. Die Massenspektrometrie (MS) ist derzeit der am besten geeignete Analysewerkzeug neuartige und / oder kombinatorischen PTM zu studieren,und es wurde für Histon - Proteine ​​( beschrieben in 16) weitgehend umgesetzt. Dies ist vor allem aufgrund der hohen Empfindlichkeit und Massengenauigkeit von MS, und die Möglichkeit zur Durchführung groß angelegte Analysen. Der Bottom-up-Strategie ist die am häufigsten verwendeten MS-basierte Proteomik Strategie für Histon-Charakterisierung und deren PTMs, wobei das intakte Protein enzymatisch in kleine Peptide gespalten (5 bis 20 aa). Diese Verdauung erleichtert sowohl LC-Trennung und MS-Detektion. Messen im Bereich von 600 - 2.000 Da häufig sind leichter ionisiert und mit höherer Massengenauigkeit und Auflösung als größere Massen identifiziert. MS / MS-Fragmentierung wird auch verbessert, wie auch kurze Peptide im allgemeinen gut geeignet für kollisionsinduzierte Dissoziation (CID). Histone stellen jedoch eine Herausforderung für die Bottom-up-MS, wie sie in basischen Aminosäureresten hoch angereichert sind, nämlich Lysin und Arginin. Daher führt Trypsin-Verdau zur Generierung von Peptiden, die zu sm sindalle für LC Bindung und eine eindeutige Lokalisierung des PTM. Um dieses Problem zu umgehen, unser Protokoll enthält Lysin und Peptid - N-terminale chemische Derivatisierung 17. Die Verwendung von Propionsäureanhydrid wird für eine effiziente chemische Derivatisierung zu empfehlen , da im Vergleich zu anderen Reagenzien 18. Solche Derivatisierung blockiert die ɛ -Aminogruppen von unmodifizierten und Monomethylether Lysinresten, Trypsin die Proteolyse durchzuführen erlaubt nur an der C-terminalen Argininreste. Derivatisierten Amine können nicht Protonen mit der Lösung auszutauschen, und somit werden die Peptide im Allgemeinen nur zweifach oder dreifach geladenen, erleichtert MS und MS / MS-Detektion. Darüber hinaus erhöht N-terminale Peptid Derivatisierung Hydrophobizität und somit Umkehrphasen-chromatographische Retention. Hier beschreiben wir den Workflow Histone zu reinigen und bereiten sie für die PTM - Analyse über Bottom-up Proteomik (Abbildung 1). Diese Strategie erreicht Quantifizierung einzelner Histonmarkierungen und kombinatorische Markierungen foder Histon PTM, die relativ nahe in der Aminosäuresequenz sind.

<table><tbody><tr><td>Trypsin 0,25% EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td>Für die Entnahme von Zellen</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roche</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid Hexahydrat</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid, wasserfrei</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>15508-013</td><td></td></tr><tr><td>AEBSF</td><td>EMD Millipore Corp</td><td>101500</td><td></td></tr><tr><td>Microcystin</td><td>Sigma</td><td>M4194</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbutyrat</td><td>Sigma</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease und Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-frei (100x) &nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>78445</td><td></td></tr><tr><td>NP-40 Alternative</td><td>CALBIOCHEM</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>Schwefelsäure, ACS-Qualität</td><td>Fisher Chemical</td><td>7664-93-9</td><td></td></tr><tr><td>Trichloressigsäure</td><td>Sigma</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma</td><td>179124 HCl</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Chemical</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>Bradford-Reagenz</td><td>Biorad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>30% Acrylamid/bis 29:1 &#8212; 500 ml</td><td>Biorad</td><td>1610156</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie</td><td>Fisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>C18 Säule (5 &#181; m) 2,1&nbsp; mm x 250&nbsp; mm</td><td>Grace</td><td>218TP52</td><td></td></tr><tr><td>C18 Säule (5 &#181; m) 4,6&nbsp; mm x 250&nbsp; mm</td><td>Grace</td><td>218TP54</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril in HPLC-Qualität</td><td>Fisher Chemical</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Wasser in HPLC-Qualität</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6 4</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11650</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonat</td><td>Sigma</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumhydroxid</td><td>Sigma</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>propionisch Anhydrid</td><td>Sigma</td><td>240311</td><td></td></tr><tr><td>Sequenzierqualität modifiziertes Trypsin</td><td>Promega</td><td>PRV5113</td><td>Für die Verdauung von Histonen für MS</td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma</td><td>49199</td><td></td></tr><tr><td>C18 Extraktionsscheibe</td><td>Empore</td><td>2215</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Sigma</td><td>F0507</td><td></td></tr></tbody></table>

komplette workflow zur analyse von histon-post-translationale modifikationen mit bottom-up-massenspektrometrie: von histone extraktion in datenanalyse

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nukleosomen sind die kleinsten Struktureinheit des Chromatins, bestehend aus 147 Basenpaaren um eine Oktamers von Histon-Proteine ​​gewickelt DNA. Histon-Funktion wird durch umfangreiche posttranslationale Modifikation durch eine Vielzahl von Kernproteine ​​vermittelt. Diese Änderungen sind von entscheidender Bedeutung für die nukleare Integrität, wie sie in der Genregulation, DNA-Reparatur und Chromosomenkondensation beteiligt Chromatinstruktur und rekrutieren Enzyme regulieren. Obwohl ein großer Teil der wissenschaftlichen Gemeinschaft Antikörper-basierte Techniken nimmt Histon PTM Überfluß zu charakterisieren, sind diese Ansätze geringen Durchsatz und voreingenommen gegen hyper Proteine, wie das Epitop, das durch in der Nähe Modifikationen behindert werden könnten. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Nano-Flüssigchromatographie (nLC) und Massenspektrometrie (MS) für eine genaue Quantifizierung von Histon-Modifikationen. Dieses Verfahren ist für eine große Vielzahl von Histon-PTMs und die relative Häufigkeit mehrerer Histon zu charakterisieren Varianten innerhalb single analysiert. In diesem Protokoll werden Histone mit Propionsäureanhydrid durch Verdau gefolgt derivatisierten Peptiden mit Trypsin von 5 zu erzeugen - 20 aa lang. Nach dem Verdau werden die neu freigelegten N-Termini der Peptide Histon derivatisierten chromatographischen Retention während NLC-MS zu verbessern. Dieses Verfahren ermöglicht die relative Quantifizierung von Histon PTMs über vier Größenordnungen.

Als Beispiel haben wir analysiert, aus humanen embryonalen Stammzellen (hES) mit und ohne Retinoesäure (RA) Stimulation, beginnend mit 200 &amp; mgr; l Zellpellets extrahiert Histone. Das Vorhandensein von RA in der Zellkultur führt zu ESC Differenzierung. Aus dem Zellpellet, etwa 50 bis 100 &amp; mgr; g von Histonen extrahiert wurden, die mehr als ausreichend ist, um mehrere LC-MS Injektionen von Histon-Peptiden durchzuführen. Nach Derivatisierung, Verdauung und Entsalzen, wurden die Proben auf eine Säule 75 um x 15 cm C 18 geladen (Teilchendurchmesser 3 um, Porengröße 300 Å) im seriellen Modus mit einem flüssigen nano Chromatographiesystem Hochleistungs mit Mikrofluidik - Chips gekoppelt ist ein Hybrid-Linearfalle Quadrupol - Orbitrap-Massenspektrometer. MS Erwerb wurde unter Verwendung von DIA durchgeführt. Parallel Proben auch auf ein Hybridionenfalle-Orbitrap-Massenspektrometer mit einem DDA-Verfahren unter Verwendung einer Nanoströmungs UHPLC gekoppelt analysiert wurden (Daten nicht gezeigt). Imjeder Zyklus eine vollständige MS Orbitrap Detektion wurde mit dem Scanbereich von 290 bis 1400 m / z, einer Auflösung von 60.000 (bei ​​200 m / z) und AGC von 10 6. Dann werden die Daten abhängig Erfassungsmodus mit einer dynamischen angewendet wurde durchgeführt , Ausschluss von 30 sec. MS / MS-Scans wurden von den intensivsten denen auf Elternionen gefolgt. Ionen mit einem Ladezustand von einer wurden von MS / MS ausgeschlossen. Ein Isolationsfenster von 2 m / z verwendet wurde. Ionen wurden unter Verwendung von stoßinduzierte Dissoziation (CID) mit Kollisionsenergie von 35% fragmentiert. Ionenfallen - Erkennung wurde mit normalen Scan Range - Modus und normalen Abtastrate mit AGC von 10 4 verwendet. Roh MS Daten wurden Annahme Software für die Extraktion von Vorläufer- und Fragment Ionenchromatogramme analysiert, nämlich Skyline 23 und EpiProfile 22. EpiProfile wurde für Histon-Peptide optimiert, wie es intelligente Spitzenbereich Extraktion aufgrund Vorkenntnisse von pep integrierttide Retentionszeit. Auf der anderen Seite wird Skyline optimiert für DIA - Analysen und damit zeigten die DIA Figuren (4 und 5A) sind Screenshots von dieser Software. Aus dem extrahierten Ionenchromatogramm wird die Fläche unter der Kurve wiedergewonnen, und das verwendet wird, um die Fülle von jedem Peptid zu bestimmen. Die Fläche des chromatographischen Peak für die [M + H] berechnet wurde , +, [M + 2H] 2+ und [M + 3H] 3+ -Ionen des gleichen Peptids, obwohl in den meisten Fällen die [M + 2H] 2+ war die vorherrschende Form. Dies liefert den rohen Abundanz eines bestimmten modifizierten Form eines Peptids. Um die relative Häufigkeit von PTMs, die Summe aller verschiedenen modifizierten Formen eines Histon-Peptid zu erreichen, wurde als 100% betrachtet, und die Fläche des jeweiligen Peptids wurde durch die Gesamtfläche für die Histon-Peptid in all ihren modifizierten Formen geteilt . Histone Peptide sind in einer vafalt von isobar Formen (Abbildung 5). Isobaren Peptide, zB K18ac und K23ac, kann nur an der MS / MS quantifiziert werden, wo ihre einzigartige Fragmentionen verwendet werden , das Verhältnis der isobaren Spezies (5A und 5B) zu bestimmen. Dieses Verhältnis wird verwendet, um die Fläche des chromatographischen Peaks zwischen den beiden Arten zu unterteilen. Wenn DDA verwendet, diese isobar Formen wurden in einer Liste von gezielten Massen enthalten, da diese Peptide für die Fragmentierung durch ihre gesamte Elution ausgewählt werden müssen, die nicht in einem Standard-DDA Experiment auftreten würde. Die Unterscheidung der relativen Abundanz der isobaren Spezies wird dann durch die Überwachung der Elutionsprofil der Fragmentionen durchgeführt. Auf der anderen Seite, DIA Art der Erfassung erfordert keine Aufnahmeliste. Allerdings ist diese Art der Erwerbsmethode nicht kompatibel mit herkömmlichen Datenbanksuche, und somit könnte die Entdeckung unbekannter modifizierten Peptide verhindern. <p class = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Lysine Acetylierung (+ 42,011 Da) wurde aus dem fast isobar Trimethylierung (+ 42.047 Da) durch die Verwendung hochauflösende MS Erfassung (&gt; 30.000) unterschieden. Darüber hinaus ist die Acetylierung hydrophober als Trimethylierung, der Elution von acetylierten Peptide führen später als die jeweiligen trimethyliertem diejenigen. Die unmodifizierten Form des gleichen Peptid eluierte später sogar aufgrund der Tatsache, dass das Lysin propionyliert wird. Zusammenfassend ist die Reihenfolge der Hydrophobizität für ein Peptid mit einem modifizierbaren Seite Di- und trimethylierte &lt;acetylierten &lt;unmodifizierten (propionyliert) &lt;monomethylierten (propionyliert). hESCs zeigte eine deutliche Reduktion der acetylierten Peptide , wenn für die Differenzierung (6A und 6B) stimuliert. Dies war nicht überraschend, da frühere Ergebnisse höhere Acetylierung in WSR berichtet , im Vergleich zu differirenden 25,was die allgemein permissive Natur des pluripotenten Chromatin. Durch die Fokussierung auf Histon H3 wurden 35 verschiedene modifizierte Formen quantifiziert (6C). Jedoch alle Histon proteoforms, die mit diesem Ansatz untersucht werden können, sind mehr als 200, einschließlich aller Histonvarianten und geringer Häufigkeit Modifikationen (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus zeigte unsere Analyse, dass eine hohe Reproduzierbarkeit zwischen technische Replikate erhalten werden, wie durch die geringe Größe der Fehlerbalken (entspricht ± Standardabweichung) belegt. Verwendung von NLC-MS-Daten Zusammengefasst beschreibt dieser Abschnitt, wie die relative Häufigkeit von Histon-modifizierten Peptide zu extrahieren. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig1.jpg" /> Abb . 1: Workflow für den Bottom-up - MS / MS - Histon - Analyse Die zehn Schritte für Histon - Analyse gezeigt werden , einschließlich einer Schätzung der Zeit für jeden Schritt erforderlich.<html> Die Abschnittsnummer ist in Klammern, wie sie in der Handschrift gegeben. Abschnitt 5 beschreibt Probenfraktionierung die verschiedenen Histonvarianten zu isolieren, kann verzichtet werden , wenn es eine Notwendigkeit für hochempfindliche Analyse einer bestimmten Variante ist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig2.jpg" /> Abbildung 2: Reversed-Phase High Flow LC für Histone Variant Fractionation und Coomassie - Gel (A) LC-UV - Chromatogramm intakt Histon Trennung darstellt.. Histon-H3-Varianten können voneinander entsprechend ihrer Elutionszeit unterschieden werden. Die Fraktionen können entweder manuell erfasst werden oder eine automatische Fraktionssammler verwendet wird . (B) Coomassie - Gel von drei Replikaten von Histon - Reinigung.= &quot;Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig3.jpg" /> Abbildung 3:. Herstellung von Stage-Kipp - Stecker mit einem P1000 Pipettenspitze, Punsch eine Scheibe aus C 18 Material aus einer Festphasenextraktion Scheibe (zweite Platte). Die Minidisk wird in der Spitze (Mitte) halten, so dass es in eine kleinere P100 / 200 Pipettenspitze, jede Art von kleinen Kapillare herausgeschoben werden kann. In diesem Beispiel verwendeten wir ein 700 um Außendurchmesser Quarzglasrohr. Die Minidisk- sollte auf der Unterseite des P100 / 200 Pipettenspitze geschoben werden, bis es nicht weiter (letzte Panel) gehen kann. Die Bühne Spitze ist bereit für die Histon-Entsalzung, da es eine ausreichende Kapazität hat genügend Probenmaterial für zahlreiche Wiederholungen zu behalten. Insbesondere ist ein Minidisk- genug für 15 bis 20 &amp; mgr; g sample. Wenn mehr Probe erforderlich ist, können mehrere Platten aufeinander gepackt werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig4.jpg" /> Abbildung 4:. Schematische Darstellung der DDA und DIA Methoden Wenn DDA verwendet, die MS - Scan - Zyklus wird durch sequentielle Auswahl von Vorläuferionen für MS / MS - Fragmentierung nach ihrer Intensität und Ladezustand charakterisiert. Sobald ein Vorläufer-Ionen fragmentiert worden ist in einer Ausschlussliste gesetzt, um sich wiederholende Auswahl des gleichen Peptids zu vermeiden, so dass die MS kann &quot;graben&quot; in weniger reichlich Signale. Diese Akquisition Methode ist die Methode der Wahl in der Proteomik für Discovery-Modus. Die Quantifizierung erfolgt durch die Integration des Scan-Signal eines bestimmten Ionen neben den identifizierten MS erreicht /MS-Spektrum. In DIA wird die gesamte m / z-Bereich bei jedem Zyklus fragmentiert. Dieser Ansatz ist weniger geeignet für die Discovery-Modus, aber es erzeugt eine chromatographische Profil aller Ionen, Vorprodukte und Produkte. Dies führt zu mehr Vertrauen Quantifizierung und Diskriminierung von isobar Formen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig5.jpg" /> Abbildung 5: Quantifizierung der Isobaric Peptide (A) Beispiel für zwei isobaren Peptide häufig reichlich in Histon - Analyse.. Das extrahierte Ionenchromatogramms (XIC) ihrer Vorläufermasse und relative Isotope (oben) ist identisch. Jedoch erlaubt die XIC der Produkt-Ionen (unten) für die Unterscheidung der zwei isobaren Formen. Bemerkenswert ist, nur einzigartige Fragmentionen sollten uns seined die relative Häufigkeit der beiden Arten. (B) Darstellung der einzigartigen Fragmentionen für die beiden beschriebenen Peptide (rot markiert). (C) Liste der häufigsten analysierten Peptide in Homo sapiens mindestens ein isobar Äquivalent zu schätzen. Sequenzvarianten zwischen den genannten Histon - Peptide werden angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig5large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig6.jpg" /> Abbildung 6: Repräsentative Ergebnisse von humanen embryonalen Stammzellen mit und ohne Retinsäurebehandlung (A) Relative Quantifizierung des Histon H3 - Peptid KQLATKAAR (aa 18 - 26) in all seinen modifizierten proteoforms.. Die relative Häufigkeit wurde mit allen proteoforms als 100% geschätzt (reltiven Anteil des unmodifizierten Peptids nicht dargestellt) (B) Relative Quantifizierung der Histon H3 - Peptid KSTGGKAPR (aa . 9 -. 17) , (C) die relative Häufigkeit erkannter Peptide für die kanonische Histon H3 mit und ohne Zellbehandlung mit Retinsäure. Die Figur zeigt, in welchem ​​der beiden Behandlungen die angegebenen Änderungen mehr reichlich vorhanden sind (&gt; 50%). Insgesamt zeigen wir , dass Histon H3 Acetylierung verringert sich in den meisten der Lysinreste nach Induktion der Zelldifferenzierung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig6large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Lösung # </td><td colspan="7"> Zusammensetzung </td></tr><tr><td> 1 </td><td colspan="7"> Nuclear Isolation Buffer (NIB) Lager wird wie folgt hergestellt und gefroren als 100 ml Aliquots bei -20 ° C gelagert; aufgetaut15 mM Tris, 60 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 1 mM CaCl 2 und 250 mM Saccharose: NIB kann bei 4 ° C für einige Wochen gelagert werden. Der pH-Wert des Puffers wird auf 7,5 mit HCl eingestellt. </td></tr><tr><td> 2 </td><td colspan="7"> Protease - Inhibitoren (fügen frisch Puffer vor der Verwendung): 1 M Dithiothreitol (DTT) in ddH 2 O (1,000x); 200 mM AEBSF in ddH 2 O (400x) </td></tr><tr><td> 3 </td><td colspan="7"> Phosphatase-Inhibitor (fügen frisch Puffer vor der Verwendung): 2,5 &amp; mgr; M Microcystin in 100% Ethanol (500x) </td></tr><tr><td> 4 </td><td colspan="7"> HDAC-Inhibitor (fügen frisch Puffer vor der Verwendung): 5 M Natriumbutyrat, hergestellt durch Titration von 5 M Buttersäure mit NaOH auf pH 7,0 (500x) </td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="7"> NP-40 Alternative: 10% v / v in ddH 2 O </td></tr><tr><td> 6 </td><td colspan="7"> 0,2 MH 2 SO 4 in ddH 2 O </td></tr><tr><td> 7</td><td colspan="7"> Trichloressigsäure (TCA): 100% w / v in ddH 2 O </td></tr><tr><td> 8 </td><td colspan="7"> Aceton + 0,1% ige Salzsäure (HCl): 0,1% v / v HCl in Aceton </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Lösungen.

Dieses Protokoll beschreibt einen voll integrierten Workflow für die Charakterisierung von Histon-post-translationale Modifikationen mittels Massenspektrometrie (MS). Der Workflow umfasst Histon-Reinigung aus Zellkulturen oder Geweben, Histon-Derivatisierung und Verdauung, MS-Analyse unter Verwendung von Nano-Flow-Flüssigkeitschromatographie und Anweisungen für die Datenanalyse. 3 Tage - Das Protokoll wird innerhalb von 2 für die Fertigstellung konzipiert.

Komplette Workflow zur Analyse von Histon-post-translationale Modifikationen Mit Bottom-up-Massenspektrometrie: Von Histone Extraktion in Datenanalyse

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, ein einfaches Verfahren bereitzustellen, um die relative Häufigkeit von posttranslationalen Histonmodifikationen zu bewerten, die wesentliche Rollen in der Chromatinbiologie spielen, beispielsweise bei der Regulation der Genexpression und der Chromosomenkondensation. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Chromatinbiologie zu beantworten, etwa welche Histonmodifikationen ihre relative Häufigkeit bei Stimulation oder Behandlung bestimmter Zellen oder Gewebe verändern.Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass wir mit der massenspektrometriebasierten Proteomik die meisten bekannten PTMs an bekannten Proteinen in einer einzigen Analyse gleichzeitig quantifizieren können. Die Analyse von Histonmodifikationen hat zahlreiche Anwendungen, darunter die Abschätzung epigenetischer Veränderungen und der Chromatinfunktion von Individuen oder Modellsystemen nach Behandlung mit Wirkstoffen oder Stress. Neben Simone werden zwei weitere Mitglieder meines Labors die Verfahren dieses Protokolls demonstrieren.Natarajan Bhanu, ein Forschungsspezialist, und Kelly Karch, eine Doktorandin. Wie in diesem Arbeitsablauf gezeigt, handelt es sich um ein 10-Schritte-Protokoll, das die Histonenreinigung aus Zellkulturen oder Geweben, die Derivatisierung der Histone, Verdauung und Entsalzung sowie die Massenspektrometrie-Analyse mittels Nanoflow-Flüssigkeitschromatographie umfasst. In diesem Video werden nur ausgewählte Verfahren veranschaulicht.Um mit dem Verfahren zur Isolierung von Kernen aus intakten Zellen zu beginnen, tauen Sie auf Eis Zellen auf, die zuvor gewonnen und bei minus 80 Grad Celsius gelagert wurden. Bereiten Sie außerdem den Kernisolationspuffer (NIB) gemäß der Beschreibung im Protokolltext vor. Entnehmen Sie ein Fünftel des Volumens an NIB und geben Sie NP-40 Alternative hinzu, um eine Endkonzentration von 0,2 % zu erreichen. Das verbleibende Volumen von vier Fünfteln wird für die Waschschritte verwendet.Waschen Sie das Zellpellet mit NIB ohne NP-40 Alternative unter Verwendung eines 1:10-Verhältnisses von Zellpelletvolumen zu Puffervolumen. Zentrifugieren Sie bei 700 RCF für fünf Minuten und entfernen Sie den Überstand. Lyse das Zellpellet, indem Sie es auf Eis stellen und NIB mit 0,2 % NP-40 Alternative im Verhältnis von 1:10 (Zellpelletvolumen zu Puffervolumen) hinzufügen.Homogenisieren Sie die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren. Inkubieren Sie die homogenisierten Zellen fünf bis 10 Minuten auf Eis, damit die Zellen lysieren und die Kerne freisetzen. Zentrifugieren Sie bei 1000 RCF fünf bis 10 Minuten bei vier Grad Celsius.Das Pellet enthält hauptsächlich Zellkerne, während der Überstand überwiegend zytoplasmatische Bestandteile enthält. Bewahren Sie die zytoplasmatische Fraktion gegebenenfalls auf. Waschen Sie das Pellet der Kerne, indem Sie es vorsichtig in NIB ohne NP-40 Alternative unter Verwendung eines 1:10-Verhältnisses von Pelletvolumen zu Puffervolumen erneut suspendieren.Zentrifugieren Sie bei 1000 RCF für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und entfernen Sie den Überstand. Nachdem das NP-40-Alternative vollständig aus dem Nuklei-Pellet entfernt wurde, geben Sie eiskalte 0,2-molare Schwefelsäure im Verhältnis von 1:5 (Volumen der Nuklei zu Volumen der Schwefelsäure) hinzu. Lösen Sie die Nuklei durch vorsichtiges Pipettieren in der Schwefelsäure wieder auf.Die Probe unter konstanter Rotation oder vorsichtigem Schütteln zwei bis vier Stunden bei vier Grad Celsius inkubieren. Anschließend die Probe bei 3400 RCF und vier Grad Celsius fünf Minuten lang zentrifugieren und den Überstand in ein neues Gefäß überführen. Danach erneut zentrifugieren und den Überstand in ein neues Gefäß überführen, um ungelöste Bestandteile zu entfernen.Um die Histone auszufällen, geben Sie kalte, 100%ige Trichloressigsäure (TCA) im Volumenverhältnis 1:3 zum gesammelten Überstand hinzu. Das Vorhandensein von Histonen zeigt sich durch eine Trübung der Probe. Mischen Sie durch mehrmaliges Vorsichtiges Umstülpen des Reaktionsgefäßes.Die Mischung mindestens eine Stunde auf Eis inkubieren. Bei 3400 RCF fünf Minuten lang zentrifugieren. Nach der Zentrifugation werden die Histone die R&ouml;hrenw&auml;nde bedecken und sich ebenfalls am Boden ablagern.Ein weißes, unlösliches Pellet bildet sich ebenfalls am untersten Ende des Röhrchens, das hauptsächlich Nicht-Histon-Proteine und andere Biomoleküle enthält. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Absaugen, ohne die Röhrchenwände oder das Pellet am Boden des Röhrchens abzukratzen. Spülen Sie das Röhrchen unter Verwendung einer gläsernen Pasteurpipette mit 100 % eiskalter Acetonlösung plus 0,1 % Salzsäure aus, sodass die ausgefallenen Proteine, die die Wände und den Boden bedecken, benetzt werden.Zentrifugieren Sie bei 3400 RCF für zwei Minuten. Aspirieren Sie das Überstand sorgfältig, ohne die Wände oder das Pellet zu berühren. Spülen Sie das Gefäß mit 100 % eiskalter Aceton, zentrifugieren Sie erneut und entfernen Sie den Überstand, ohne die Wände oder das Pellet zu berühren.Anschließend wird die Histonquantifizierung und Reinheitsanalyse wie im Protokolltext beschrieben durchgeführt. Eine optionale Fraktionierung von Histonvarianten mittels umgekehrter Phasen-HPLC kann ebenfalls vor der Histonderivatisierung durchgeführt werden. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Histonproben in 40 Mikrolitern 50 Millimolar Ammoniumbicarbonat, pH 8,0, lösen.Überprüfen Sie den pH-Wert, indem Sie eine P10-Pipettenspitze ohne Ansaugen in die Probe einführen und die Pipettenspitze auf einen pH-Indikatorstreifen auftragen. Verwenden Sie Ammoniumhydroxid und Ameisensäure, um den pH-Wert auf 8,0 einzustellen. Ab diesem Punkt müssen alle Schritte, die die Verwendung von Propionsäureanhydrid beinhalten, in einem Abzug durchgeführt werden.Verarbeiten Sie maximal drei bis vier Proben gleichzeitig, um die Reaktivität des Propionsäureanhydrids aufrechtzuerhalten. Stellen Sie das Propionylierungsreagenz frisch her, indem Sie Propionsäureanhydrid und Acetonitril im Volumenverhältnis 1:3 mischen. Geben Sie das Propionylierungsreagenz zu jeder Probe im Volumenverhältnis 1:4 hinzu.Fügen Sie schnell Ammoniumhydroxid hinzu, um den pH-Wert der Lösung wieder auf 8,0 einzustellen. Gewöhnlich ist es geeignet, Ammoniumhydroxid im Volumenverhältnis von 1:5 zur Probe hinzuzufügen, um den pH-Wert 8,0 wiederherzustellen. Mischen Sie sofort durch Vortexen. Überprüfen Sie den pH-Wert. Inkubieren Sie die Proben 15 Minuten bei Raumtemperatur. Nachdem alle Proben einer Propionylierung unterzogen wurden, trocknen Sie die Proben im Vakuumkonzentrator auf 10 bis 20 Mikroliter ein.Suspensionen erneut aufnehmen oder mit ddH2O verdünnen, bis ein Endvolumen von 40 µL erreicht ist. Da Salze die Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie beeinträchtigen, müssen die Proben vor der Analyse entsalzt werden. Für dieses Video wird lediglich der Aufbau der Stage-Tips demonstriert.Verwenden Sie eine P1000-Pipettenspitze, um eine Scheibe des C18-Materials aus einer Festphasen-Extraktionsplatte auszustanzen. Benutzen Sie eine geschmolzene Quarzkapillare, um die Mini-Scheibe aus der P1000-Spitze herauszudrücken und in den Boden einer P100- oder P200-Pipettenspitze zu befördern. Stellen Sie sicher, dass die Scheibe sicher am unteren Ende der Spitze verklemmt ist.Wenn mehr als 25 Mikrogramm Probe entsalzt werden sollen, verwenden Sie zwei C18-Mini-Scheiben in derselben P100- oder P200-Spitze. Verwenden Sie einen Zentrifugenadapter, um die Stage-Tips in 1,5-ml- oder 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu fixieren. Spülen Sie das Harz, indem Sie es mit 50 Mikrolitern 100 % Acetonitril zentrifugieren, um das C18-Material zu aktivieren und potenzielle Verunreinigungen zu entfernen.Die Desalzierung der Probe wird anschließend wie im Protokolltext beschrieben durchgeführt. Histone Peptide liegen in einer Vielzahl isobarer Formen vor. Zwei in der Histonenanalyse häufig vorkommende Beispiele sind dargestellt.Das extrahierte Ionen-Chromatogramm ihrer Vorläufermasse und relativen Isotope, das oben dargestellt ist, ist identisch. Das extrahierte Ionen-Chromatogramm der Produktionen, das unten gezeigt wird, ermöglicht jedoch die Unterscheidung der beiden isobaren Formen. Nur eindeutige Fragmentionen, die rot hervorgehoben sind, sollten zur Schätzung der relativen Häufigkeit der beiden Spezies verwendet werden.Es wurden Histone aus humanen embryonalen Stammzellen mit und ohne Retinsäurestimulation analysiert. Die relative Quantifizierung zweier Histon-H3-Peptide zeigte eine deutliche Verringerung der Acetylierung in humanen embryonalen Stammzellen, die zur Differenzierung stimuliert wurden. Dies steht im Einklang mit früheren Berichten über eine höhere Acetylierung in embryonalen Stammzellen im Vergleich zu differenzierenden Zellen.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie in drei Tagen durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Ein Tag für die Histonextraktion, der zweite Tag für die Proteinderivatisierung und den Verdau sowie der dritte Tag für die Peptidderivatisierung, das Stage-Tipping und die LC-MS-Analyse. Die Histonreinigung kann für andere Zwecke genutzt werden, die über die Analyse von Peptiden hinausgehen, einschließlich der mittleren und umfassenden Proteomik, bei der es möglich ist, kombinatorische Histonmodifikationen zu charakterisieren.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man histonische posttranslationale Modifikationen mithilfe der massenspektrometriebasierten Proteomik identifizieren und quantifizieren kann.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Durch die Kombination von nativen und Vernetzungs Chromatinimmunpräzipitation mit hochauflösender Massenspektrometrie ermöglicht ChroP Ansatz, um die Verbund Proteom-Architektur der Histon-Modifikationen, Varianten und Nicht-Histon-Proteine ​​synergizing bei funktionell unterschiedlichen Chromatindomänen sezieren.

Der Ansatz kombiniert ChroP ChIP und Massenspektrometrie zu sezieren Locus-spezifische Proteomik Landschaften des Chromatin

Der Zweck dieses Artikels ist es, eine umfassende, systematische Leitfaden für die effiziente Reinigung der Histone H3 und H4 und die Quantifizierung von Schimmelpilzschäden Histon-Rückständen.

Reinigung des H3 und H4-Histon-Proteine und die Quantifizierung der acetylierte Histone Noten in Zellen und Hirngewebe

Das Protokoll wurde entwickelt, um intakte Histone effektiv aus Sorghumblattmaterialien für die Profilierung von histonenposttranslationalen Modifikationen zu extrahieren, die als potenzielle epigenetische Marker dienen können, um die Konstruktion von dürreresistenten Kulturen zu unterstützen.

Isolierung von Histon von Sorghum Blattgewebe für Top Down Mass Spektrometrie Profilierung von potenziellen epigenetischen Markern

Dieses Protokoll beschreibt, wie ein dreidimensionales Zellkultursystem verwendet werden kann, um Chromatinmodifikationen in einem nahezu physiologischen Zustand zu modellieren, zu behandeln und zu analysieren.

Globale Quantifizierung von posttranslationalen Histonmodifikationen in einem 3D-Zellkulturmodell von Lebergewebe

Ein analytischer Arbeitsablauf, der auf Flüssigkeitschromatographie, Mobilitätsspektrometrie mit gefangenen Ionen und Flugzeit-Massenspektrometrie (LC-TIMS-ToF MS/MS) basiert, für eine hochzuverlässige und hochgradig reproduzierbare "Bottom-up"-Analyse von Histonmodifikationen und -identifizierung basierend auf Hauptparametern (Retentionszeit [RT], Kollisionsquerschnitt [CCS] und genaues Masse-zu-Ladungs-Verhältnis [m/z]).

Histonmodifikations-Screening mittels Flüssigkeitschromatographie, Ionenmobilitätsspektrometrie und Flugzeit-Massenspektrometrie

Dieses Protokoll ermöglicht eine effiziente Histonextraktion aus verschiedenen klinischen Proben für eine anschließende posttranslationale Modifikationsanalyse mittels LC-MS/MS. Durch die robuste Erkennung wichtiger Histonmodifikationen dient sie als wertvolles Werkzeug für umfassende epigenetische Profilierung in großen klinischen Kohorten.

Extraktion von Histonen aus klinischen Proben für epigenetische Profilierung mittels Massenspektrometrie

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Automatisierung der posttranslationalen Analyse einzelzelliger Histon-Modifikationen unter Verwendung einer isotopischen Zweiplex-Markierungsstrategie und der ArgC-Verdauung. Dieser Workflow ermöglicht quantitative, reproduzierbare und hochsensible Profilierung der Chromatinheterogenität und epigenetischen Antworten bei Einzelzellauflösung.

Automatisierte Probenvorbereitung für die multiplexierte Analyse einzelzelliger Histon-Posttranslationalen Modifikationen (sc-hPTM2)

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) ist eine sensible und quantitative Methode zur globalen Muster der post-translationale Modifikationen in Zubereitungen native, intakte Nukleosomen zu erkennen. Diese Änderungen umfassen Methylierungen, Acetylierungen und Phosphorylierungen an bestimmten Histon Aminosäurereste und damit NU-ELISA bietet eine globale Proteom-Test des Gesamtsystems Chromatin Modifikation Staaten von spezifischen Zelltypen.

Erkennung von Post-translationale Modifikationen auf Native Intact Nukleosomen mittels ELISA

Eine zuverlässige und nützlicher Ansatz zur Histon-Modifikationen auf spezifische Pflanzen-Gene erkennen beschrieben. Der Ansatz kombiniert Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) und real-time quantitative PCR. Es ermöglicht den Nachweis von Histon-Modifikationen auf bestimmte Gene mit eine Rolle in verschiedenen physiologischen Prozessen.

Erkennung von Histon-Modifikationen in Pflanzenblättern

Wir beschreiben eine Reihe von Tests zur Expression von H1 Linker Histonen zu analysieren. mRNA einzelner Gene H1 werden quantitativ durch zufällige Primer basieren reverse Transkription durch real-time PCR gefolgt gemessen, während Protein Quantifizierung der H1-Histone durch HPLC-Analyse erreicht wird.

Expressionsanalyse von Säugetier-Linker-Histon-Subtypen

Lernen Sie die Bottom-up-Massenspektrometrie zur Analyse von Histon-post-translationale Modifikationen. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Quantifizierung mehrerer PTMs für epigenetische Studien.

Komplette Workflow zur Analyse von Histon-post-translationale Modifikationen Mit Bottom-up-Massenspektrometrie: Von Histone Extraktion in Datenanalyse (Video) | JoVE Journal

Komplette Workflow zur Analyse von Histon-post-translationale Modifikationen Mit Bottom-up-Massenspektrometrie: Von Histone Extraktion in Datenanalyse

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