Komplette Workflow zur Analyse von Histon-post-translationale Modifikationen Mit Bottom-up-Massenspektrometrie: Von Histone Extraktion in Datenanalyse

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, ein einfaches Verfahren zur Bewertung der relativen Häufigkeit von posttranslationalen Histonmodifikationen bereitzustellen, die in der Chromatinbiologie eine wesentliche Rolle spielen, wie z. B. die Regulation der Genexpression und die Chromosomenkondensation. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Chromatinbiologie zu beantworten. Zum Beispiel, welche Histonmodifikationen ihre relative Häufigkeit bei Stimulation oder Behandlung bestimmter Zellen oder Gewebe ändern.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir durch den Einsatz massenspektrometrischer Proteomik die meisten bekannten PTMs auf bekannten Proteinen gleichzeitig in einer einzigen Analyse quantifizieren können. Die Analyse von Histonmodifikationen hat zahlreiche Anwendungen, einschließlich der Abschätzung epigenetischer Veränderungen und der Chromatinfunktion von Individuen oder Modellsystemen bei medikamentöser Behandlung oder Stress. Neben Simone werden zwei weitere Mitglieder meines Labors die Verfahren dieses Protokolls demonstrieren.

Natarajan Bhanu, ein Forschungsspezialist, und Kelly Karch, eine Doktorandin. Wie in diesem Arbeitsablauf gezeigt, handelt es sich um ein 10-stufiges Protokoll, das die Histonreinigung aus Zellkulturen oder Geweben, die Histonderivatisierung, den Aufschluss und die Entsalzung sowie die massenspektrometrische Analyse mittels Nanoflow-Flüssigkeitschromatographie umfasst. In diesem Video werden nur ausgewählte Verfahren demonstriert.

Um mit der Isolierung von Zellkernen aus intakten Zellen zu beginnen, tauen Sie Zellen auf Eis auf, die zuvor geerntet und bei minus 80 Grad Celsius gelagert wurden. Und bereiten Sie den nuklearen Isolationspuffer (NIB) vor, wie im Protokolltext beschrieben. Entfernen Sie ein Fünftel des NIB-Volumens und fügen Sie NP-40 Alternative bis zu einer Endkonzentration von 0,2 % hinzu. Die restlichen vier Fünftel des Volumens werden für die Wäsche verwendet.

Waschen Sie das Zellpellet mit NIB ohne NP-40 Alternative, wobei ein Verhältnis von 1:10 zwischen Zellpelletvolumen und Puffervolumen verwendet wird. Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 700 RZB und entfernen Sie den Überstand. Lysieren Sie das Zellpellet, indem Sie es auf Eis legen und NIB mit 0,2 %NP-40 Alternative in einem Verhältnis von 1:10 zwischen Zellpelletvolumen und Puffervolumen hinzufügen.

Homogenisieren Sie die Zellen durch schonendes Pipettieren. Inkubieren Sie die homogenisierten Zellen fünf bis 10 Minuten lang auf Eis, damit die Zellen lysieren und die Zellkerne freisetzen können. Zentrifugieren Sie bei 1000 RCF für fünf bis 10 Minuten bei vier Grad Celsius.

Das Pellet enthält hauptsächlich Zellkerne, während das Überkorn hauptsächlich zytoplasmatische Komponenten enthält. Bewahren Sie die zytoplasmatische Fraktion auf, falls gewünscht. Waschen Sie das Kernpellet, indem Sie es vorsichtig wieder mit NIB ohne NP-40-Alternative aufwirbeln, wobei ein Verhältnis von Pelletvolumen zu Puffervolumen von 1:10 verwendet wird.

Zentrifugieren Sie bei 1000 RCF fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius und entfernen Sie den Überstand. Nachdem die NP-40-Alternative vollständig aus dem Kernpellet entfernt wurde, fügen Sie eiskalte 0,2 molare Schwefelsäure in einem Verhältnis von 1:5 zwischen Kernvolumen und Schwefelsäurevolumen hinzu. Suspendieren Sie die Kerne in der Schwefelsäure durch schonendes Pipettieren.

Inkubieren Sie die Probe mit konstanter Rotation oder leichtem Schütteln für zwei bis vier Stunden bei vier Grad Celsius. Als nächstes zentrifugieren Sie die Probe bei 3400 RCF bei vier Grad Celsius für fünf Minuten und überführen das Übergewicht in ein neues Röhrchen. Zentrifugieren Sie erneut und überführen Sie das Übergewicht in ein neues Röhrchen, um unlösliches Material zu entfernen.

Um die Histone auszufällen, fügen Sie gekühlte 100%ige Trichloressigsäure oder TCA zu dem gesammelten Übergewicht im Volumenverhältnis von 1:3 hinzu. Das Vorhandensein von Histonen wird dadurch angezeigt, dass sich die Probe trübt. Mischen Sie, indem Sie das Röhrchen einige Male umdrehen.

Inkubiere die Mischung mindestens eine Stunde lang auf Eis. Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 3400 RCF. Nach der Zentrifugation beschichten die Histone die Seiten des Röhrchens und lagern sich auch am Boden ab.

Boden des Röhrchens bildet sich auch ein weißes, unlösliches Kügelchen, das hauptsächlich Nicht-Histon-Proteine und andere Biomoleküle enthält. Entfernen Sie vorsichtig das Überkorn durch Aspiration, ohne die Seiten des Rohrs oder das Pellet am Boden des Rohrs abzukratzen. Spülen Sie das Röhrchen mit einer Pasteur-Glaspipette mit 100 % eiskaltem Aceton und 0,1 % Salzsäure, um die ausgefällten Proteine zu bedecken, die die Seiten und den Boden bedecken.

Zentrifugieren Sie zwei Minuten lang bei 3400 RCF. Saugen Sie das Supernatent vorsichtig an, ohne die Seiten oder das Pellet abzukratzen. Spülen Sie das Röhrchen mit 100% eiskaltem Aceton, zentrifugieren Sie erneut und entfernen Sie das Überkorn, ohne die Seiten oder das Pellet abzukratzen.

Anschließend wird die Histonquantifizierung und Reinheitsanalyse durchgeführt, wie im Protokolltext beschrieben. Eine optionale Fraktionierung von Histonvarianten durch Umkehrphasen-HPLC kann auch vor der Histonderivatisierung durchgeführt werden. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Histonproben in 40 Mikrolitern 50 Millimolar Ammoniumbicarbonat mit einem pH-Wert von 8,0 auflösen.

Überprüfen Sie den pH-Wert, indem Sie eine P10-Pipettenspitze ohne Aspiration in die Probe einführen und die Pipettenspitze mit einem pH-Indikatorstreifen berühren. Verwenden Sie Ammoniumhydroxid und Ameisensäure, um den pH-Wert auf 8,0 einzustellen. Von hier an müssen alle Schritte, bei denen Propionanhydrid verwendet wird, in einem Abzug durchgeführt werden.

Verarbeiten Sie maximal drei bis vier Proben gleichzeitig, um die Reaktivität von Propionanhydrid zu erhalten. Bereiten Sie ein frisches Propionylierungsreagenz vor, indem Sie Propionanhydrid mit Acetonitril in einem Volumenverhältnis von 1:3 mischen. Geben Sie das Propionylierungsreagenz zu jeder Probe in einem Volumenverhältnis von 1:4.

Fügen Sie schnell Ammoniumhydroxid hinzu, um den pH-Wert von 8,0 wiederherzustellen. In der Regel ist die Zugabe von Ammoniumhydroxid mit einem Volumenverhältnis von 1:5 zur Probe geeignet, um den pH-Wert von 8,0 wiederherzustellen. Sofort durch Vortexen mischen.

Überprüfen Sie den pH-Wert. Inkubieren Sie die Proben 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nachdem alle Proben der Propionylierung unterzogen wurden, trocknen Sie die Proben in einem Vakuumkonzentrator auf 10 bis 20 Mikroliter

Proben mit ddH20 resuspendieren oder verdünnen, bis ein Endvolumen von 40 Mikrolitern erreicht ist. Da Salze die Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie behindern, müssen die Proben vor der Analyse entsalzt werden. Für die Zwecke dieses Videos wird nur der Aufbau der Stage-Tips demonstriert.

Verwenden Sie eine P1000-Pipettenspitze, um eine Scheibe mit C18-Material von einer Festphasen-Extraktionsscheibe zu stanzen. Verwenden Sie eine Quarzglaskapillare, um die Mini-Scheibe aus der P1000-Spitze in den Boden einer P100- oder P200-Pipettenspitze zu schieben. Stellen Sie sicher, dass die Scheibe an der Unterseite der Spitze fest verkeilt ist.

Wenn Sie mehr als 25 Mikrogramm Probe entsalzen, verwenden Sie zwei C18-Mini-Disks in derselben P100- oder P200-Spitze. Verwenden Sie einen Zentrifugenadapter, um die Tischspitzen in 1,5- oder Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu halten. Spülen Sie das Harz, indem Sie es mit 50 Mikrolitern 100 % Acetonitril drehen, um das C18-Material zu aktivieren und potenzielle Verunreinigungen zu entfernen.

Anschließend erfolgt die Probenentsalzung, wie im Protokolltext beschrieben. Histonpeptide kommen in einer Vielzahl von isobaren Formen vor. Es werden zwei Beispiele gezeigt, die in der Histonanalyse häufig vorkommen.

Das extrahierte Ionenchromatogramm ihrer Vorläufermasse und relativen Isotope, wie oben gezeigt, ist identisch. Das extrahierte Ionenchromatogramm der Produktionen (siehe unten) ermöglicht jedoch die Unterscheidung der beiden isobaren Formen. Nur einzigartige Fragmentionen, die rot hervorgehoben sind, sollten verwendet werden, um die relative Häufigkeit der beiden Spezies abzuschätzen.

Es wurden Histone analysiert, die aus humanen embryonalen Stammzellen mit und ohne Retinsäurestimulation extrahiert wurden. Die relative Quantifizierung von zwei Histon-H3-Peptiden zeigte eine deutliche Verringerung der Acetylierung in humanen embryonalen Stammzellen, die zur Differenzierung stimuliert wurden. Dies steht im Einklang mit früheren Berichten über eine höhere Acetylierung in embryonalen Stammzellen im Vergleich zu differenzierenden Zellen.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Ein Tag für die Histonextraktion, der zweite Tag für die Proteinderivatisierung und der Verdau und der dritte Tag für die Peptidderivatisierung, das Stage-Tipping und die LC-MS-Analyse. Die Histonreinigung kann für andere Zwecke als die Analyse von Peptiden genutzt werden, einschließlich der Middle-Down- und Top-Down-Proteomik, bei der es möglich ist, kombinatorische Histonmodifikationen zu charakterisieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man posttranslationale Histonmodifikationen mit Hilfe der massenspektrometrischen Proteomik identifiziert und quantifiziert