Silizium-Mikrochips zur Manipulation Zell-Zell-Interaktion

Hallo, ich bin Elliot Hu.Ich bin Postdoktorand in Tias Labor hier am Massachusetts Institute of Technology. Heute bereiten wir Zellkulturen auf mikromechanischen Siliziumchips vor. Die Geräte sehen aus wie kleine Waben, die ineinander greifen, und sie ermöglichen es uns, die Wechselwirkungen zwischen zwei verschiedenen Zellpopulationen präzise zu manipulieren.

Heute werden wir die Interaktion zwischen Leberhepatozyten und stützenden Stromazellen untersuchen. Konkret werden drei T-Drei-Fibroblastenzellen auf der Oberseite der Waben kultiviert, so dass man durch Verschieben der Wabenfinger die Zellen bewegen und ihre räumliche Anordnung verändern kann. Jedes Gerät ist in zwei Teile unterteilt, die in zwei möglichen Konfigurationen zusammengesteckt werden können.

Die erste bringt die beiden Zellpopulationen miteinander in Kontakt. Die zweite trennt die beiden Populationen leicht, so dass sich die Zellen nicht berühren können. Hier werden Kontaktinteraktionen verhindert, aber Wechselwirkungen durch sezernierte Faktoren bleiben erhalten.

Beginnen wir damit, darüber zu sprechen, wie man die Teile mit einer Pinzette handhabt. Ich verwende sowohl sowohl größere Teflonpinzetten als auch kleinere Metallpinzetten mit runder Spitze. Bei der größeren Pinzette kann man die Teile an den Rändern so aufnehmen, bei den größeren Teilen bei den Bügeln muss man aufpassen, dass man die Bügel nicht bricht, da sie sehr zerbrechlich sind.

Sie möchten sie also an der Rückseite des Teils so aufnehmen. Mit der Metallpinzette kannst du in das Loch greifen und die Späne direkt aufnehmen. Die größeren Teile passen in eine Wand einer 12-Well-Platte, während die kleineren Teile entweder in eine 24-Well-Platte passen oder mit dem größeren Teil kombiniert werden können.

In einer 12-Well-Platte verwende ich normalerweise die Metallpinzette. Wenn ich die Teile in den Platten anfasse, um zwei Teile miteinander zu verbinden, lege ich normalerweise zuerst das größere Teil in die Vertiefung und schiebe es ganz zur Seite. Dann nehme ich die kostenlose Reparatur und lege sie auf die andere Seite der Vertiefung, und ich schiebe sie zusammen, indem ich zwei Pinzetten in jedes Loch stecke.

Jetzt kann ich die Teile einfach miteinander verriegeln, entweder in der Spaltkonfiguration oder in der Kontaktkonfiguration. Wenn ich die Teile auseinandernehmen möchte, ziehe ich die Teile gerne in die Spaltkonfiguration und ziehe sie dann vertikal nach oben, um das Teil zu entfernen. Jetzt sind die Geräte aus Silikon gefertigt, so dass sie beschichtet werden müssen, um eine ordnungsgemäße Zelladhäsion zu ermöglichen.

Sie werden die Geräte wahrscheinlich bereits mit Polystyrol beschichtet und plasmabehandelt erhalten, daher gehen wir davon aus, dass dies unser Ausgangspunkt ist. Zunächst werden wir Kollagen verwenden, um die Oberfläche zu beschichten, an der sich die Hepatozyten festsetzen. Wir werden die Hepatozytenkämme in ein Kollagen mit einer Kapazität von 50 Mikrogramm pro Mille, eine Lösung, legen und 45 Minuten lang bei 37 °C inkubieren.

Die Fibroblastenkämme hingegen müssen wir nicht beschichten. Nach der Inkubation saugen wir die Kollagenlösung ab und waschen und gießen. Jetzt werden wir das ES in Kontakt mit komplementären Teilen miteinander verriegeln, so dass wir eine flache Oberfläche für die Zellaussaat bilden.

Zuerst werden wir einige Brunnen mit 70 % Ethanol füllen. Ich lege ein Paar in jede Vertiefung und verschließe sie dann zusammen. Nach dem Zusammenschließen wollen wir die Teile unter dem Mikroskop betrachten, um sicherzustellen, dass sie koplanar sind.

Hin und wieder können die Teile falsch ausgerichtet aneinander verriegeln. Und am Mikroskop sehen Sie, dass sie sich auf zwei verschiedenen Fokusebenen befinden. Trennen Sie in diesem Fall einfach die Teile und schieben Sie sie wieder zusammen. Nachdem wir überprüft haben, ob die Ausrichtung in Ordnung ist, lassen wir die Teile eine Weile in Ethanol ruhen, um sie zu sterilisieren.

Oft bin ich in Eile, also weiche ich einfach 10 Minuten ein. Nach der Sterilisation müssen wir wegspülen. Das Ethanol gründlich aspirieren und in Wasser waschen, dann aspirieren und erneut in Wasser waschen und schließlich das Wasser ansaugen und durch Ihre Nährmedien ersetzen.

Lassen Sie uns nun Zellen auf die Geräte säen. In der Regel suspendieren wir die Zellen in einer Konzentration von 500.000 Zellen pro Milliliter und pipettieren eine Millilitersuspension über jedes Wabenpaar mit einer 12-Well-Platte. Also haben wir die Fibroblasten mit 500.000 Zellen pro Milliliter in zwei der Vertiefungen ausgesät.

In ähnlicher Weise haben wir eine Suspension von 500.000 Hepatozyten pro Vertiefung genommen und sie in die beiden anderen Vertiefungen ausgesät. Nun, vor der Inkubation, werden wir die Zellen gründlich schütteln, um sicherzustellen, dass sie gleichmäßig verteilt sind. Und ich schüttle gerne dreimal vertikal, dreimal horizontal und wiederhole das dann dreimal.

Nach dem Schütteln legen wir es in den Inkubator und lassen die Zellen 15 Minuten lang ruhen, dann schütteln wir sie wieder. Nachdem wir eine Stunde lang alle 15 Minuten geschüttelt haben, werden wir die Zellsuspension absaugen und mit einer neuen Zellsuspension spielen. Und wir werden das wiederholen, bis wir eine konfluente Schicht von Zellen haben.

Typischerweise sind bei Fibroblasten ein oder zwei Sitzgelegenheiten erforderlich. Und mit Hepatozyten kann es zwei bis vier Sitzplätze aufnehmen. Um eine konfluente Monoschicht zu erhalten, werden die Zellen mit einer ziemlich hohen Dichte platziert, das Schütteln sorgt dafür, dass die Zellen gleichmäßig verteilt sind.

Nach dem ersten Sitzen bildet sich eine spärliche Zellschicht. Beachten Sie, dass Zellen nur an den Fingern haften, die mit Polystyrol und Kollagen beschichtet wurden. Nach der Aussaat frischer Zellen und einer weiteren Stunde Inkubation, die wiederum alle 15 Minuten geschüttelt wird, wächst die Zellschicht dichter.

Nach der dritten Aussaat haben wir eine gute Zelldichte, und jetzt können wir aufhören, nachdem die Zellen auf die Waben ausgesät wurden. Wir wollen die Zellen in die gewünschte experimentelle Konfiguration manipulieren. Die Geräte werden nun von ihren komplementären Teilen getrennt und 24 Stunden lang inkubiert.

Nach 24 Stunden haben sich die Zellen zu einer konfluenten Monoschicht über die Oberfläche der Waben ausgebreitet. Jetzt wollen wir eine Co-Kultur bilden. Hepatozytenkamm und Fibroblastenkamm werden nun in dieselbe Vertiefung überführt und in der gewünschten Ausgangskonfiguration miteinander verriegelt.

Falls gewünscht. Nach einer gewissen Zeit können Sie die Konfiguration ändern. Zum Beispiel können wir nach 18 Stunden zur Spaltkonfiguration übergehen, Teile werden in die gleiche gelegt, gut zusammengeschoben, bis die Spaltkonfiguration erreicht ist, und dann wieder in Kontakt in die Spaltkonfiguration geschoben.

Und jetzt entfernen wir einen Kamm. Was wir jetzt tun werden, ist, den Prozess des Abstreifens der alten Polystyrolbeschichtung zu durchlaufen, die Chips zu reinigen und dann eine neue Polystyrolbeschichtung aufzutragen und sie für die Zellkultur vorzubereiten. Auch hier stellen wir sicher, dass durch das Abziehen der alten Polystyrolbeschichtung und das Aufbringen einer frischen Schicht sichergestellt wird, dass nichts von der Geschichte des vorherigen Experiments ein neues Experiment beeinträchtigt.

Nachdem Sie mit Ihrem Experiment fertig sind, möchten Sie als erstes Ihre Zellen bleichen und dann Ihre Waben und Ihr Wasser abspülen. Bevor du also die Chips in die Zehen steckst, solltest du sicherstellen, dass sie vollständig trocken sind. Hier haben wir also ein paar Kämme, die ich gerade eine Weile an der Luft trocknen lassen und überprüft habe, ob sie vollständig trocken sind.

Und so werden wir es uns jetzt etwas angeschaut und in diesen Glaslautsprecher stecken. Ich werde hier eine Glaspipette verwenden, damit wir sie nicht auflösen. Halloween löst Plastik auf, daher können wir keine typische Styroporpipette verwenden.

Okay, das ist auch schon genug. Und jetzt nehmen wir einfach ein paar dieser Teile, legen sie in die Spitze, und ich schalte den Shaker ein, um zu rühren, und wir decken ihn mit Alufolie ab, damit das Toluol nicht verdunstet. Nach zwei Stunden sollte das Toluol also den größten Teil des Polystyrols auf den Waben aufgelöst haben, und wir können sie einfach herausziehen und die Waben an der Luft trocknen.

Nach der Halloween-Spülung sollten die Teile relativ frei von Styropor sein und relativ sauber sein. Wir müssen jedoch die Teile extrem sauber haben, damit die neue Schicht aus Polystyrol eine gute Haftung bildet, wenn sie nicht extrem sauber ist. Das Poly ty neigt dazu, sich in der Mitte des Experiments abzulösen, wenn die Zellen anfangen, daran zu ziehen.

Was wir jetzt also machen werden, ist eine Piranha-Säure-Reinigung. Ich habe die Teile in einen Glaslautsprecher eingebaut und wir werden das Ganze erhitzen. Also stellen wir eine Herdplatte auf.

Und hier haben wir Schwefelsäure und Wasserstoffperoxid. Ich werde zuerst die Schwefelsäure einfüllen und hier sicherstellen, dass alle Späne unter der Flüssigkeit eingetaucht sind. Manchmal neigen sie dazu, zu schwimmen.

Und auch jetzt, wo wir mit ziemlich ätzenden Chemikalien arbeiten, stellen Sie sicher, dass Sie die richtige Schutzausrüstung tragen. Hier. Ich trage Nitrilhandschuhe. Jetzt gießen wir das Wasserstoffperoxid in die Säure und passen Sie hier auf, denn es handelt sich um eine exotherme Reaktion.

Man kann also sehen, dass es ein wenig raucht, während es reagiert, aber wir wollen dem System etwas Energie hinzufügen, um es noch reaktiver zu machen. Jetzt werden wir es auf 120 Grad Celsius erhitzen, etwa bei eins 20 Grad, damit Sie sicher sein können, dass alle Überreste Ihrer Zellkultur vollständig von Ihren Chips entfernt werden. An diesem Punkt möchten Sie die Reaktion einfach ihren vollen Lauf nehmen lassen, bis das gesamte Wasserstoffperoxid verbraucht ist.

Und an diesem Punkt wird die Mischung aufhören zu sprudeln. Es dauert also etwa eine halbe Stunde, bis die Reaktion ihren Lauf nimmt. Und wenn Sie die Blasen nicht mehr sehen, können Sie die Herdplatte einfach ausschalten und abkühlen lassen.

Und wir werden sie in ein BAK-Kurvenwasser übertragen. Und noch einmal: Stellen Sie sicher, dass Sie hier eine Teflonpinzette und kein Metall verwenden, und Sie können sie einfach aufheben und übertragen. Jetzt spülen wir es einfach unter einem stetigen Strom von DDH zwei O.Ich nehme es normalerweise direkt aus der Meine und lasse es hier mindestens 10 Minuten laufen.

Und indem wir das tun, werden wir alle Spuren von Säure abwaschen, nachdem wir sie 10 Minuten lang unter einem Wasserstrahl zerkleinert haben. Die Säure sollte wieder von den Chips entfernt werden, und wir werden sie einfach unter Wasser lagern, bis wir bereit sind, das Polystyrol mit 45.000 Molekulargewicht zu beschichten, das wir von Sigma erhalten haben. Und wir werden hier einen kleinen Teil davon abwägen.

Wir haben 400 Milligramm und werden es in Toluol bei 100 Milligramm pro Milliliter auflösen. Toluol muss also in der Haube gehandhabt werden. Und die andere Sache ist, dass wir, da wir ein Toluol zum Auflösen von Polystyrol verwenden werden, sicherstellen wollen, dass wir keine Laborkleidung verwenden, die aus Polystyrol hergestellt ist.

Hier verwenden wir also Polypropylen, konisch und eine Glaspipette. Da ich also 400 Milligramm Polystyrol habe, werde ich vier Milliliter Zehen hinzufügen, und jetzt werden wir es eine halbe Stunde lang wirbeln, bis sich das Polystyrol auflöst. Jetzt werden wir die Röhre einfach mit der niedrigsten Geschwindigkeit für etwa 20 Minuten bis eine halbe Stunde

Also werde ich das Rohr an den Wirbeln befestigen. Ich muss es nicht die ganze Zeit dort halten. Nach 20 bis 30 Minuten sollte sich das Polystyrol aufgelöst haben und wir sind bereit, es zu beschichten.

Jetzt werden wir das Polystyrol in unserer Anlage spinnbeschichten. Unser Spin-Coder befindet sich in einer Reinraumanlage. Und so müssen wir hier eine Mütze, eine Schutzbrille, einen Talar, Stiefeletten und Handschuhe tragen, aber das ist in Ihrer Einrichtung vielleicht nicht dasselbe.

Bevor wir dieses Futter verwenden, möchte ich es vor dem Styropor schützen. Wir werden es also mit Aluminiumfolie abdecken und diese so flach wie möglich auf die Oberfläche bringen, damit der Chip bündig auf der Oberfläche sitzen kann. Wir werden ein kleines Loch genau in der Mitte stechen, damit wir ein Vakuum auf dem Chip halten können.

Der Spin-Coder ist auf 2.400 U/min und 30 Sekunden eingestellt. Jetzt können wir einen unserer Chips nehmen, ihn so platzieren, dass die Mitte des Chips das Loch bedeckt, und ich werde das Vakuum zuerst ausschalten, wenn ich das Polystyrol aufsetze, das Vakuum einschalte und dann mit dem Schleudern beginne. Für die kleineren Teile können wir also nur weniger als 10 Tropfen absetzen.

Und für die größeren Teile braucht es etwas mehr als 10 Tropfen Polystyrol. Und wir drehen es 30 Sekunden lang bei 2.400 U/min. Jetzt nehmen wir die mit Polystyrol beschichteten Chips und legen sie in den Ofen bei 120 Grad Celsius, das ist über dem Glasübergangspunkt des Polystyrols.

Es wird also die Oberfläche neu auffluten, um sie ein wenig zu glätten, und es wird auch den Kunststoff verdichten und härten. Also lasse ich es normalerweise über Nacht im Ofen. Es dauert wahrscheinlich mindestens ein paar Stunden, bis der Vorgang abgeschlossen ist.

Nach einem Backen über Nacht sind die Chips also bereit für die Plasmabehandlung. Jetzt werden wir das Polystyrol einem Sauerstoffplasma aussetzen, und das wird die Oberflächenenergie so verändern, dass Proteine und Zellen besser daran haften. Wir laden also einfach die Chips in die Plasmakammer und pumpen sie auf ein Vakuum herunter.

Eine gute Einstellung ist 200 mil, Tour Vakuum und 200 Watt Leistung für eine Minute unter einem Strom von Sauerstoffgas. Jetzt, da das System nach unten gepumpt ist, werden wir den Sauerstoff einführen. Okay, jetzt können wir die HF-Stromversorgung einschalten und das Plasma eine Minute lang einschalten.

Wenn das Plasma also läuft, leuchtet es tatsächlich. Es ist wie eine fluoreszierende Glühbirne. Nach einer Minute Plasmabelichtung werden wir den Druck in der Atmosphäre wieder nach oben bringen und wir können die Teile herausziehen.

Jetzt sind die Teile bereit für die Proteinbeschichtung und die Zellfütterung. Das Ziel bei der Entwicklung dieses Geräts war es, dass wir in der Lage sind, die Mikroarchitektur des Gewebes dynamisch zu manipulieren. Die Mikroorganisation des Gewebes im Körper, insbesondere dort, wo die Zellen zueinander platziert sind, ist also sehr wichtig für die Bestimmung der Funktion jeder einzelnen Zelle in Laborkulturen.

Bis vor kurzem waren wir nicht in der Lage, das gut zu replizieren, aber in den letzten fünf oder 10 Jahren haben die Menschen begonnen, Zellen auf ein Gewebekultursubstrat zu mikrostrukturieren, wodurch die Zellen genau dort platziert werden, wo wir sie in einer Gewebekulturplatte haben möchten. Und dabei konnten wir einige wichtige Aspekte der grundlegenden Biologie von Zellzellinteraktionen auf der Mikroskala entdecken. Was wir bisher nicht geschafft haben, ist, das dynamisch zu tun.

Das heißt, die Organisation einer Zellkultur mitten in Ihrem Experiment zu verändern. Und das ist wichtig, denn im Körper, also im Körper, ist das Gewebe eigentlich keine statische Umgebung. Wir haben Zellen, die sich bewegen und sich neu organisieren, insbesondere bei der Wundheilung oder -entwicklung.

Aber selbst in einem, einem normalen Organ in der Homöostase, gibt es eine Menge Zeug, das sich bewegt. Der schwierigste technische Aspekt, den es zu erlernen gilt, ist die Frage, wie man die Teile physisch isst. Und wenn Sie anfangs mit dem System arbeiten, sind Sie vielleicht eingeschüchtert davon, wie zerbrechlich die Teile sind oder wie klein die Emotionen sind, die Sie erzeugen müssen.

Aber ich denke, wenn man nur eine Weile damit übt, sollte man nicht allzu große Schwierigkeiten haben. Einige der Orte, an denen wir sehen, dass dieses Gerät eine Rolle spielt, zum Beispiel bei der Embryonalentwicklung, werden Zellen mit einer Reihe verschiedener Zellumgebungen in Kontakt kommen, während die Zellen durch verschiedene embryonale Schichten knospen. Und es ist bekannt, dass die Wechselwirkungen mit jeder der Schichten, wenn sie nacheinander in Kontakt kommen, uns alle auf einem spezifischen Differenzierungsweg weiter vorantreiben.

Und so denken wir, dass diese Art von Gerät gut sein könnte, um zu versuchen, diese Art von Ereignis im Labor zu replizieren. Einer der Aspekte der Mikroorganisation, den wir besonders untersuchen wollten, war ein Unterschied zwischen Zellen, die durch Kontaktinteraktionen kommunizieren, bei denen die Zellmembranen gegeneinander aneinander stoßen können, und löslichen Faktoren, die in das umgebende Medium sezerniert werden, das zu einer Zelle diffundiert, die etwas weiter entfernt ist. Und oft, wenn Zellen in Co-Kultur sind und sich gegenseitig beeinflussen, war nicht klar, ob es sich dabei um Kontaktinteraktionen oder sezernierte Faktoren handelt, die eine Rolle spielen.