HLA-Ig Basierend Artificial Antigen-präsentierende Zellen für eine effiziente Ex vivo Erweiterung des menschlichen CTL

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, künstliche antigenpräsentierende Zellen oder einen A-PC für die ex vivo-Expansion von humanem Antigen-spezifischem CTL für einen möglichen Einsatz in der adoptiven Immuntherapie zu verwenden. Dies wird erreicht, indem zunächst HLA A, zwei IG und monoklonale Anti-Human-Antikörper CD 28 an magnetische Dyna-Kügelchen konjugiert werden, um A zu einem PC zu machen. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Qualitätskontrolle und die Peptidbeladung des A A PC durchzuführen. Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, acht positive T-Zellen des menschlichen peripheren Blutes CD zu isolieren. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, acht positive Zöliakie-T-Zellen eine Woche lang mit einem A-PC zu inkubieren.

Die CTL werden dann geerntet und charakterisiert, bevor sie entweder verwendet oder für eine weitere Woche erneut stimuliert werden, um das gewünschte Maß an Spezifität und Expansion zu erreichen. Letztendlich können Teum- oder Färbeergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass CTL, die in Gegenwart von A A PC expandiert werden, eine erhöhte Antigenspezifität aufweisen. Heute zeige ich Ihnen ein HI IG-basiertes A A PC-System und wie Sie dieses System nutzen können, um CMV-spezifisches humanes CTL exvivo im Vergleich zu anderen bestehenden Methoden effizient zu erweitern.

Unsere A A PC-Technologie bietet mehrere wichtige Vorteile. Es ist von der Stange erhältlich, es ist in unbegrenzter Menge, und sagen wir, ein PC kann für alle HRAA-zwei positiven Spender verwendet werden. Okay, fangen wir an: Übertragen Sie einen Milliliter M vier 50 Epoxidkügelchen aus einem Vorrat von ca. 400 Millionen Kügelchen in eine sterile Screwup-Glasfeile.

Waschen Sie die Kügelchen einmal, indem Sie einen Milliliter Boid-Puffer hinzufügen und dann das Glasfläschchen gegen einen Dyin-All-Magneten NBC One halten, während die Kügelchen an der Seite des Fläschchens haften. Entfernen Sie die Schlinge durch Aspiration Resus. Suspendieren Sie die Kügelchen in einer Mischung aus Boidpuffer, HLA A, zwei IG-Dimer und monoklonalem Anti-Human-Antikörper CD 28.

Um die Konjugation von Protein und Kügelchen zu erleichtern, drehen Sie das Glasfläschchen auf einem Rotator 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius. Setzen Sie dann das Rohr in einen MPC-Einmagneten ein und entfernen Sie den gesamten Boratpuffer. Nachdem der Puffer entfernt wurde, waschen Sie die Kügelchen zweimal mit einem Milliliter Bead-Wash-Puffer

Inkubieren Sie nun die Kügelchen in einem Milliliter Bead-Wash-Puffer und drehen Sie das Fläschchen weitere 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius, um die verbleibenden Proteinbindungsstellen auf den Kügelchen zu blockieren. Entfernen Sie dann den Puffer aus dem Glasfläschchen und ersetzen Sie ihn durch einen Milliliter frischen Bead-Wash-Puffer. Übertragen Sie 100 Mikroliter Faxwaschpuffer auf Faxröhren und fügen Sie dann fünfmal 10 zu den fünften Kügelchen hinzu.

Färben Sie die Kügelchen mit einem Mikroliter Anti-Muse-IgG, einem PE und einem Mikroliter Anti-Muse-IgG, zwei Mal nach dem Färben für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Mindestens drei Milliliter Fax-Waschpuffer auf jede der Färbeproben. Pelletieren Sie dann den A A PC, indem Sie ihn fünf Minuten lang bei 300 g bei vier Grad Celsius ausgeben.

Reus suspendiert den A A PC in frischen Faxpuffer und liest das Färbeergebnis sofort mit dem Durchflusszytometer ab. Waschen Sie die Kügelchen wie zuvor zweimal mit sterilem PBS. Laden Sie als Nächstes die Kügelchen mit 10 Mikrolitern CMV-Peptid.

Zählen Sie die Kügelchen mit dem Hämozytometer und beschriften Sie sie dann mit dem Datum und der Konzentration der Kügelchen. Als Kügelchen pro Milliliter. Inkubieren Sie das A, A PC mit dem Peptid für mindestens drei Tage bei vier Grad Celsius, zentrifugieren Sie etwa 100 Milliliter frisches peripheres Blut von einem HLA A zwei positiven Spender in 10 Natrium-Heparin-Vacutainer-Röhrchen bei 300 G für 10 Minuten.

Bei Raumtemperatur die oberste Plasmaschicht vorsichtig durch Aspiration entfernen. Das gesammelte Plasma wird durch steriles PBS ersetzt und das Blut in einen sterilen Kulturkolben T 75 überführt. Mischen Sie das Blut und das PBS gut, indem Sie es pipettieren, sobald das gesamte Blut in 15 Millilitern der Fial-Packung plus in vier konische 50-Milliliter-Röhrchen entnommen wurde.

Überlagern Sie langsam 30 bis 35 Milliliter der Blutzellen mit dem Fial in jedem Röhrchen. Unter Beibehaltung der Grenzfläche zwischen den Fial- und den Blutzellen zentrifugieren Sie den Blut- und Fialgradienten bei 500 GS für 20 Minuten bei Raumtemperatur, wobei der Bruch und die Beschleunigung so gering wie möglich sind, um eine klare Grenzfläche zwischen den Schichten zu erhalten, aspirieren Sie nach dem Spin die obere Plasmaschicht und verwenden Sie dann eine serologische Pipette, um die PBMC-Schicht vorsichtig zu aspirieren. Das PBMC wird in ein frisches konisches 50-Milliliter-Röhrchen überführt, wenn alle PBMC mit 30 Millilitern PBS geerntet wurden, in die Zellen überführt und zentrifugiert.

Entsorgen Sie anschließend das Supernat und waschen Sie das Pellet. Ein weiteres Mal mit 30 Millilitern PBS, um den Rest-Fi-Call zu entfernen, dann reichern Sie die acht positive T-Zell-Population der Zöliakie mit einem Milton Human CD acht positiven T-Zell-Isolationskit an. Zählen Sie gemäß dem Protokoll des Herstellers die acht positiven T-Zellen der CD und bestätigen Sie die Reinheit per Faxanalyse.

Suspendieren Sie 1 Million CTL in acht Millilitern T-Zell-Wachstumsfaktor, zwei x Kulturmedium plus acht Milliliter vollständigem RPMI-Medium und fügen Sie eins mal 10 der sechs A A PC-Mischung hinzu. Nun, dann verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 160 Mikroliter Zellen pro Vertiefung auf eine 96-Well-U-Boden-Gewebekulturplatte zu plättieren. Inkubieren Sie die Zellen sieben Tage lang bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid.

Füttern Sie die Zellen am vierten Tag mit 80 Mikrolitern T-Zellwachstum pro Well. Faktor zwei x Kulturmedium. Ernten Sie die Zellen am siebten Tag und legen Sie die Zellen dann gegen den Magneten, um den alten A A PC zu entfernen, wenn alle Kügelchen an der Wand des Fläschchens haften.

Ernten Sie die Zellen und geben Sie sie in ein weiteres konisches 50-Milliliter-Röhrchen und zählen Sie die Zellzahl. Bestimmen Sie die Antigenspezifität des A A PC durch Tetramerfärbung gemäß dem Protokoll des Herstellers. Wiederholen Sie die geernteten Zellen mit einem neuen A A PC unter den gleichen Bedingungen, um eine erhöhte Zellzahl in Antigenspezifität zu erzeugen.

Hier ist ein repräsentatives Ergebnis der Tetramerfärbung von CMV-spezifischem CTL, das von A A PC nach einer Woche Kultur erzeugt wurde. Hier ist ein repräsentatives intrazelluläres Zytokin-Färbeergebnis der CMV-spezifischen CTL, das durch A-A-P-C-C-M-V-Spezifität erzeugt wurde, betrug 61% durch Tetramerfärbung. Diese Methode kann verwendet werden, um Schlüsselfragen im Bereich der T-Zellen zu beantworten, z. B. wie wir die optimalen kulturellen Bedingungen und die Anforderungen an die funktionelle Modulation der T-Zellen identifizieren können.

Die Lowly-Methode lieferte Einblicke in die Behandlung von Viruserkrankungen. Es kann auch in anderen Bereichen wie Krebs eingesetzt werden.