HLA-Ig Basierend Artificial Antigen-präsentierende Zellen für eine effiziente Ex vivo Erweiterung des menschlichen CTL

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, künstliche antigenpräsentierende Zellen oder eine A PC zur ex vivo-Expansion menschlicher antigenspezifischer CTL für eine mögliche Anwendung in der adoptiven Immuntherapie zu verwenden. Dies wird erreicht, indem zunächst HLA A two IG und ein anti-humaner CD 28 monoklonaler Antikörper an magnetische Dyna-Beads konjugiert werden, um eine A A PC herzustellen. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht in der Qualitätskontrolle und der Peptidbeladung der A A PC. Der dritte Schritt des Verfahrens ist die Isolierung menschlicher peripherer CD acht-positiver T-Zellen. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, CD acht-positive T-Zellen eine Woche lang mit einer A PC zu inkubieren.

Die CTL werden anschließend geerntet und charakterisiert, bevor sie entweder verwendet oder für eine weitere Woche erneut stimuliert werden, um den gewünschten Grad an Spezifität und Expansion zu erreichen. Letztendlich können Tetramer- oder Färbungsergebnisse erhalten werden, die zeigen, dass CTL, die in Gegenwart von A A PC expandiert wurden, eine erhöhte Antigenspezifität aufweisen. Heute werde ich Ihnen ein auf HI IG basierendes A A PC-System zeigen und wie man dieses System verwendet, um CMV-spezifische humane CTL ex vivo effizienter zu expandieren als mit anderen bestehenden Methoden.

Unsere A A PC-Technologie bietet mehrere wichtige Vorteile. Sie ist kommerziell erhältlich, nahezu unbegrenzt verfügbar und, wie man sagen könnte, für alle HRAA-zwei-positiven Spender einsetzbar. Beginnen wir nun: Übertragen Sie ein Milliliter M vier 50 Epoxidperlen aus einer Stammlösung mit etwa 400 Millionen Perlen in eine sterile Schraubglasflasche.

Waschen Sie die Kügelchen einmal, indem Sie ein Milliliter Boid-Puffer hinzufügen und das Glasvial dann an ein Dauermagnet-NBC-1-Gerät stellen, während die Kügelchen an der Wand des Vials haften. Entfernen Sie die Überstände durch Absaugen. Resuspendieren Sie die Kügelchen in einer Mischung aus Boid-Puffer, HLA-A2-Ig-Dimer und anti-humanem CD28 monoklonalem Antikörper.

Danach die Protein-Kügelchen-Konjugation fördern, indem das Glasfläschchen 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius auf einem Rotator rotiert wird. Anschließend das Gefäß in einen MPC-One-Magneten stellen und sämtlichen Boratpuffer entfernen. Nach dem Entfernen des Puffers die Kügelchen zweimal mit je einem Milliliter Kügelchenwaschpuffer waschen.

Incubieren Sie die Kügelchen nun in einem Milliliter Kügelchen-Waschpuffer und rotieren Sie das Gefäß 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius, um verbleibende Proteinbindungsstellen auf den Kügelchen zu blockieren. Entfernen Sie danach den Puffer aus dem Glasgefäß und ersetzen Sie ihn durch einen Milliliter frischen Kügelchen-Waschpuffer. Übertragen Sie 100 Mikroliter Fax-Waschpuffer in Fax-Röhrchen und geben Sie anschließend fünfmal 10 hoch 5 Kügelchen hinzu.

Färben Sie die Kügelchen mit einem Mikroliter anti-muse IgG, einem PE und einem Mikroliter anti-muse IgG zwei a fite nach der Färbung für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Geben Sie drei Milliliter Fax-Waschpuffer zu jeder der Färbe-Proben hinzu. Pelletieren Sie anschließend die A A PC durch Zentrifugation bei 300 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.

Suspendieren Sie die A A PC erneut in frischem Fax-Puffer und lesen Sie das Färbungsergebnis unverzüglich mit dem Durchflusszytometer ab. Waschen Sie die Kügelchen zweimal wie zuvor mit steriler PBS. Laden Sie anschließend die Kügelchen mit 10 Mikrolitern CMV-Peptid.

Zählen Sie die Kügelchen mit einem Hämocytometer und beschriften Sie sie anschließend mit Datum und Konzentration der Kügelchen in Kügelchen pro Milliliter. Inkubieren Sie die A A PC mit dem Peptid mindestens drei Tage bei vier Grad Celsius. Zentrifugieren Sie etwa 100 Milliliter frisches peripheres Blut von einem HLA-A2-positiven Spender in 10 ml Sodiumheparin-Vakutainer-Röhrchen bei 300 ×g für 10 Minuten.

Entfernen Sie bei Raumtemperatur vorsichtig die obere Plasmaschicht durch Absaugen. Ersetzen Sie das gesammelte Plasma durch steriles PBS und überführen Sie das Blut in einen sterilen T-75-Kulturgefäß. Mischen Sie das Blut und PBS gründlich durch Pipettieren, nachdem das gesamte Blut in einem Fialpack mit 15 Millilitern sowie in vier 50-Milliliter-Konusröhrchen gesammelt wurde.

Überlagern Sie langsam 30 bis 35 Milliliter der Blutzellen auf der Fial in jedem Röhrchen. Unter Beibehaltung einer deutlichen Grenzfläche zwischen Fial und den Blutzellen zentrifugieren Sie das Blut-Fial-Gradienten bei 500 ×g für 20 Minuten bei Raumtemperatur mit ausgeschaltetem Bremsmodus und möglichst niedriger Beschleunigung, um nach der Zentrifugation eine klare Grenzfläche zwischen den Schichten zu erhalten. Aspirieren Sie anschließend die oberste Plasmaschicht ab und verwenden Sie dann eine serologische Pipette, um die PBMC-Schicht vorsichtig abzusaugen. Überführen Sie die PBMC in ein frisches 50-Milliliter-Konischgefäß. Wenn alle PBMC gewonnen wurden, geben Sie 30 Milliliter PBS zu den Zellen hinzu und zentrifugieren Sie diese.

Als Nächstes verwerfen Sie das Überstand und waschen das Pellet erneut mit 30 Milliliter PBS, um den restlichen Fi-Call zu entfernen. Anschließend bereichern Sie die CD8-positiven T-Zell-Population mithilfe eines Milton Human CD8-positive T-cell Isolation Kits gemäß der Herstelleranleitung. Zählen Sie die CD8-positiven T-Zellen und bestätigen Sie die Reinheit durch FACS-Analyse.

Suspendieren Sie 1 Million CTL in acht Millilitern T-Zell-Wachstumsfaktor-zwei-x-Kulturmedium plus acht Millilitern vollständigem RPMI-Medium und geben Sie 1 × 10⁶ der A A PC-Mischung hinzu. Verwenden Sie anschließend eine Mehrkanalpipette, um 160 Mikroliter Zellen pro Vertiefung in eine 96-Loch-U-Boden-Zellkulturplatte abzugeben. Inkubieren Sie die Zellen sieben Tage lang bei 37 °C in 5 % CO₂.

Füttern Sie die Zellen am vierten Tag mit 80 Mikrolitern pro Vertiefung T-Zell-Wachstumsfaktor-Zwei-mal-Kulturmedium. Ernten Sie die Zellen am siebten Tag und setzen Sie sie dann dem Magneten aus, um die alten A A PC zu entfernen, sobald alle Kügelchen an der Wand des Gefäßes haften.

Die Zellen gewinnen und in ein anderes 50-Milliliter-Konischgefäß überführen sowie die Zellzahl bestimmen. Die Antigen-Spezifität der A A PC mittels Tetramer-Färbung gemäß Herstellervorschrift ermitteln. Die gewonnenen Zellen erneut mit frischen A A PC unter denselben Bedingungen kultivieren, um die Zellzahl bei Erhalt der Antigen-Spezifität zu erhöhen.

Hier ist ein repräsentatives Tetramer-Färbungsergebnis von CMV-spezifischen CTL, die nach einer Woche Kultur durch A-A-P-C generiert wurden. Dargestellt ist ein repräsentatives Ergebnis der intrazellulären Zytokinfärbung von CMV-spezifischen CTL, die durch A-A-P-C generiert wurden – die Spezifität für CMV betrug 61 % mittels Tetramer-Färbung. Diese Methode kann verwendet werden, um zentrale Fragen im Bereich der T-Zellen zu beantworten, beispielsweise, wie wir die optimalen Kulturbedingungen identifizieren können und welche Anforderungen an die funktionelle Modulation von T-Zellen bestehen.

Die bescheidene Methode lieferte Erkenntnisse zur Behandlung von Viruserkrankungen. Sie kann auch auf andere Bereiche wie die Krebsforschung angewendet werden.