Name: HLA-Ig Basierend Artificial Antigen-präsentierende Zellen für eine effiziente Ex vivo Erweiterung des menschlichen CTL (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Erfahren Sie die Methode zur Expansion antigenspezifischer CTL mittels HLA A2-Ig-basierter künstlicher Antigen-präsentierender Zellen. Diese Technik ermöglicht effiziente Ex-vivo-Vermehrung für adoptive Immuntherapie.

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Wir möchten Aaron Selya für hilfreiche Diskussionen danken. Diese Arbeit wurde vom NIH AI29575, CA108835, AI077097 zu JS, ein Pilot Zuschuss von der Johns Hopkins Malaria Research Institute und dem Department of Defense zu gewähren PC 040972 bis MO unterstützt

1. Making, HLA-A2-Ig Basis AAPC <ol><li> Bereiten Sie sterile Boratpuffer <ol><li> Lösen Sie Borsäure in Wasser bis 0,1 zu machen. Den pH-Wert auf 7,0. </li><li> Filter durch einen 0,22 &amp;mgr; m Sterilfilter und lagern bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Bereiten Sie sterile Bead Waschpuffer <ol><li> Nehmen Sie 956ml PBS w / o Magnesium oder Calcium. </li><li> Fügen Sie 30ml humanem AB-Serum. </li><li> Add EDTA 2 mM Endkonzentration. </li><li> Add 0.1gsodium Azid. </li><li> Filter durch ein 0,22 um sterile Filter und lagern bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Nehmen Sie 1 ml Invitrogen M-450 Epoxy Perlen ab Lager, rund 400 Millionen Beads (Perlen können von Zählkammer gezählt werden), und in eine sterile, Schraubverschluss Glasfläschchen. </li><li> Legen Sie die Flasche gegen eine Dynal Magneten MPC-1, während die Perlen an der Seite des Fläschchens haften, entfernen Sie die Überstände durch Absaugen. Wash Perlen einmal mit 1 ml Boratpuffer. </li><li> Resuspendieren Perlen in einer Mischung aus 1 ml Boratpuffer und 20 ug HLA-A2-Ig-Dimer und 20 ug anti-human CD28 mAb (Clone 9,3). </li><li> Protein zu Wulst Konjugation: put der Glasflasche auf Rotator und drehen bei 4 ° C für 24 Stunden. </li><li> Das Röhrchen wird in MPC-1 Magnet und entfernen Sie alle Boratpuffer. </li><li> Waschen Sie die Kugeln zweimal mit 1 ml Bead Waschpuffer. </li><li> Inkubieren Sie die Perlen in 1ml Bead Waschpuffer bei 4 ° zu drehen C für 24 Stunden. Da Bead Waschpuffer enthält humanem AB-Serum, wird es alle Restprotein Bindungsstelle auf die Perlen zu blockieren. </li><li> Entfernen Sie den Überstand aus Glasflasche, mit 1 ml frisches Bead Waschpuffer zu ersetzen. </li></ol> 2. Qualitätskontrolle von AAPC und Peptid-Beladung, Lagerung <ol><li> Fügen Sie ~ 5 × 10 5 Perlen auf 100 &amp;mgr; FACS-Waschpuffer in FACS-Röhrchen und Fleck mit 1μl der Anti-Maus-IgG1-PE (erkennt den Fc-Teil des HLA-A2-Ig) und 1μl der Anti-Maus-IgG2a-FITC (zu erkennen den Fc-Teil des anti-CD28 mAb). Nach der Färbung für 20 Minuten in FACS-Waschpuffer, wieder waschen und lesen Sie das Färbeergebnis sofort Durchflußzytometer (Abbildung 4). </li><li> Peptide Verladung auf die Perlen: Waschen Sie die Kugeln zweimal in Glasfläschchen mit 1ml sterile PBS. Resuspendieren mit 1 ml sterilem PBS fügen Sie dann 10 &amp;mgr; l von CMV-Peptid (1mg/ml) </li><li> Zählen Sie die Perlen durch Hämozytometer und Etikett der Flasche mit Datum und Konzentration. </li><li> AAPC sind bereit für den Einsatz nach mindestens 3 Tage Peptid Inkubation bei 4 ° C, um genügend Zeit für die Bindung des Peptids auf das HLA-A2-Ig-Dimer zu ermöglichen. Die Perlen können bei 4 ° C gelagert werden und bleiben für mindestens 6 Monate funktionsfähig. </li></ol> 3. Menschliche CTL Isolation <ol><li> Sammeln ~ 100ml frischer peripheren Blut von gesunden HLA-A2 positiven Spender in 10 BD Sodium Heparin Vacutainer-Röhrchen. Verwenden Sie eine 21-Gauge-Nadel oder größer, um eine Hämolyse zu vermeiden. </li><li> Zentrifuge bei 300xg für 10 Minuten bei Raumtemperatur </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die obere Plasmaschicht durch Aspiration. Das Plasma kann als Ergänzung für das Kulturmedium verwendet werden. </li><li> Ersetzen Sie das gesammelte Plasma mit sterilem PBS und Transfer das Blut in einem sterilen T75 Kulturflasche oder 50ml konische Röhrchen. Mix das Blut mit PBS gut durch Auf-und Abpipettieren. </li><li> Nach all dem Blut gesammelt werden, bereiten vier weitere 50ml konische Röhrchen und fügen 15ml Ficoll-Paque Plus. </li><li> Langsam Overlay 30-35ml von Blutzellen auf der Oberseite des Ficoll jeder Röhre. Halten Sie die Schnittstelle zwischen den verschiedenen Ficoll und Blutzellen. </li><li> Zentrifugation bei 500 xg für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Schalten Sie die Bremse "off" und die Beschleunigung so gering wie möglich eine klare Schnittstelle zwischen den Schichten zu erhalten. </li><li> Mit einem seriological Pipette vorsichtig absaugen PBMC-Schicht und sammeln Sie die PBMC in ein frisches 50ml konischen Rohr. Wenn alle PBMC geerntet add 30 ml PBS und Spin bei 400xg für 10 min. Überstand verwerfen und waschen noch einmal mit 30 ml PBS, um alle verbleibenden Ficoll entfernen. </li><li> Fahren Sie mit CD8 + T-Zell-Isolierung durch Miltenyi menschlichen CD8 + T-Zell-Isolation Kit nach Protokoll des Herstellers. Dieses Kit sehr bereichert für CD8 +-Zellen (in der Regel&gt; 95%) durch Minderung der CD8 - Zellen. </li><li> Zählen Sie die CD8 + T-Zellen. Die erwartete Reinheit sollte größer sein als 95%. Zu diesem Einsatz 2x10 5 Zellen bestätigen und führen Sie eine CD4/3/8 FACS-Analyse. Die restlichen CTL kann entweder sofort für Antigen-spezifische AAPC Stimulation oder sie können für die zukünftige Verwendung eingefroren werden. </li></ol> 4. In vitro AAPC Basis Kultursystem <ol><li> Bereiten Sie Kulturmediums <ol><li> Für TF (T-Zell-Wachstumsfaktor, im Labor 4 hergestellt) 2X Kulturmedium: komplettem RPMI-Medium plus 5% Spender autologem Plasma und 8% T-Zell-Wachstumsfaktor. </li><li donor autologem plasma kann durch hitze-inaktiviertem humanem ab-serum ersetzt werden.></ol></li><li> Resuspendieren 1 Million CTL in 8ml von TF 2X Kultur-Medium plus 8ml von kompletten RPMI-Medium, fügen Sie 1 × 10 6 AAPC, gut mischen. </li><li> Verwenden Sie ein Multi-Channel-Pipette auf den Teller Zellen auf 96 well U unten Zellkulturplatten. (160 ul pro Well) </li><li> Kultur-Zellen in 37 ° C, 5% CO 2 incubater für 7 Tage. Feed the Zellen an Tag 4 mit 80 ul / well TF 2X Medium. </li><li> Die Zellen sind bereit, am Tag 7 geerntet werden. Nach der Ernte statt die Zellen vor dem Magneten und entfernen Sie die alte AAPC. </li><li> Antigen-Spezifität kann durch Tetramer-Färbung nach dem Protokoll des Herstellers bestimmt werden. Phänotyp Färbung und intrazelluläre Zytokin-Färbung sind nach unserer vorherigen Studie 3 durchgeführt. </li><li> Geernteten Zellen können mit AAPC replattiert wieder unter den gleichen Bedingungen. Zellzahl und Antigen-Spezifität wird erwartet, dass nach wiederholter Stimulation erhöhen. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Ein Beispiel für AAPC nach HLA A2-Ig und anti-CD28-Konjugation ist in Abbildung 4 dargestellt. Erfolgreiche Proteinkonjugation ist offensichtlich durch eine deutliche Verschiebung der entsprechenden Antikörper-Färbung. Während die Häufigkeit von CMV-spezifischen CTL im peripheren Blut ist in der Regel 0,5-1%, nach einer Woche von AAPC-vermittelte Stimulation kann die Spezifität zu erreichen 55 bis 93% (Abb. 2 und 3). Die Expansion von Antigen-spezifischen CTL kann sehr variabel zwischen verschiedenen Gebern, aber die Ergebnisse sind reproduzierbar innerhalb des gleichen Spenders. Durch Extrapolation kann der Ausbau der CMV spezifische Zellen Tausende von fache verglichen mit Vorstufe Ebenen direkt ex vivo (Daten nicht gezeigt). Intrazelluläre Zytokin-Färbung (Abbildung 3) zeigt, dass diese erweiterte CTL polyfunktionellen, anstatt erschöpft sind, nach längerer Zellkultur und erhebliche Verbreitung. <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Representative Flussdiagramm AAPC basierte ex vivo Expansion der menschlichen CTL zur adoptiven Immuntherapie bei allogener HSCT <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Representative Tetramer Färbung durch CMV-spezifischen CTL durch AAPC nach einer Woche der Kultur erzeugt <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Representative intrazelluläre Zytokin-Färbung aufgrund der CMV-spezifischen CTL durch AAPC generiert (CMV Spezifität betrug 61%) <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Representative Färbeergebnis der M-450 Epoxy Perlen nach Proteinkonjugation mit Anti-Maus-IgG1-PE und anti-Maus IgG2-FITC gefärbt

<ol><li>Walter, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+cellular+immunity+against+cytomegalovirus+in+recipients+of+allogeneic+bone+marrow+by+transfer+of+T-cell+clones+from+the+donor%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of cellular immunity against cytomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from the donor.</a> N Engl J Med. 333, 1038-1038 (1995).</li>
<li>Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cell+transfer%3A+a+clinical+path+to+effective+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Adoptive cell transfer: a clinical path to effective cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Cancer. 8, 3669-3669 (2008).</li>
<li>Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nat Med. 9, 619-619 (2003).</li>
<li>Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+antigen-presenting+cells%3A+artificial+solution+for+real+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Artificial antigen-presenting cells: artificial solution for real diseases.</a> Trends Mol Med. 11, 412-412 (2005).</li>
</ol>

Die AAPC System, das wir hier beschreiben, ist ein effizientes System für die ex vivo Expansion der menschlichen CTL gegen eine Vielzahl von Antigenen. Besondere Vorsicht ist im Hinblick auf die Qualität des Proteins Konjugation und die gleichmäßige Verteilung der AAPC und CTL in der 96-Well-Platte Kultur genommen werden. Mit diesem Ansatz konnten wir CTL erweitern seit mehr als 8 Wochen, in denen wir von Antigen-spezifischen CTL erweitert bis zu einer Million fach 4. Es gab verschiedene künstliche APC-Systeme, die Zell-Linien oder andere azellulären Plattformen 5 worden, aber nach den veröffentlichten Daten jedes System hat sein einzigartiges Profil in Bezug auf Ausbau und Spezifität Unterstützung verschiedener Anwendungen. Wichtig ist, da die Qualität der CTL ist ebenso wichtig wie Quantität, sind die Polyfunktionalität der CMV-spezifischen CTL durch unser System generiert erwartet überlegene antivirale Wirksamkeit zu verleihen.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagens </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> Vacutainer-Röhrchen (enthält Heparin) </td><td> Becton Dickinson </td><td> 367874 </td></tr><tr><td> Menschliche CD8 + T-Zell-Isolation Kit </td><td> Miltenyi </td><td> 130-094-156 </td></tr><tr><td> Dynabeads M-450 Epoxy </td><td> Invitrogen </td><td> 140,11 </td></tr><tr><td> Dynal MPC-1 Magnet </td><td> Invitrogen </td><td> 120-01D </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque Plus- </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> RPMI Medium 1640 </td><td> Gibco </td><td> 11875 </td></tr><tr><td> HLA-A2-Ig-Dimer X </td><td> Becton Dickinson </td><td> 551263 </td></tr><tr><td> iTAgMHC Tetramer (HLA-A2-CMV)-PE </td><td> Beckman Coulter </td><td> T20099 </td></tr><tr><td> Falcon klare 96-well Mikrotiterplatte </td><td> Becton Dickinson </td><td> 353077 </td></tr><tr><td> Rat anti-Maus-IgG2a-FITC </td><td> Becton Dickinson </td><td> 553390 </td></tr><tr><td> Ziege anti-Maus-IgG1-PE </td><td> Invitrogen </td><td> P21129 </td></tr><tr><td> Humanem Serum-Typ AB </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S40110 </td></tr><tr><td> Maus anti-human CD8a-FITC </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0772 </td></tr><tr><td> Maus anti-human CD8a-APC </td><td> Becton Dickinson </td><td> 340684 </td></tr><tr><td> Maus anti-human IFN &amp;ggr;-FITC </td><td> Becton Dickinson </td><td> 340449 </td></tr><tr><td> Maus anti-human TNF-PE </td><td> Becton Dickinson </td><td> 340512 </td></tr></tbody></table>

hla-ig basierend artificial antigen-präsentierende zellen für eine effiziente ex vivo erweiterung des menschlichen ctl

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL mit optimaler Effektor-Funktion spielen eine entscheidende Rolle bei der Vermittlung von Schutz gegen verschiedene intrazelluläre Infektionen und Krebs. Jedoch können Einzelpersonen weisen suppressive Immunsystem Mikroumgebung und im Gegensatz zu aktivierenden CTL, die autologe Antigen-präsentierende Zellen können dazu neigen, tolerize oder anergize Antigen-spezifischen CTL. Als Ergebnis, obwohl noch in der experimentellen Phase, hat CTL-basierte adoptiven Immuntherapie entwickelt, um eine viel versprechende Behandlung für verschiedene Krankheiten wie Krebs und Virusinfektionen werden. In ersten Experimenten ex vivo expandierten CMV (Cytomegalovirus) spezifische CTL sind für die Behandlung von CMV-Infektion bei immunsupprimierten allogenen Knochenmark-transplantierten Patienten eingesetzt. Zwar ist es üblich, lebensbedrohliche CMV-Virämie bei diesen Patienten haben, keiner der Patienten erweitert CTL entwickeln CMV Erkrankung, was bedeutet, das Anti-CMV Immunität von der adoptiv übertragen CTL 1 hergestellt. Vielversprechende Ergebnisse wurden auch für Melanome beobachtet worden und kann auf andere Arten von Krebs 2 verlängert werden. Zwar gibt es viele Möglichkeiten, um ex vivo zu stimulieren und zu erweitern menschlichen CTL sind, werden aktuelle Ansätze der Kosten und technische Grenzen beschränkt. Zum Beispiel ist der derzeitige Goldstandard für die Verwendung von autologen DC. Dies erfordert jeden Patienten zu einer signifikanten Anzahl der Leukozyten zu spenden und ist auch sehr teuer und aufwändig. Darüber hinaus hat detaillierte In-vitro-Charakterisierung der DC erweitert CTL ergab, dass diese nur suboptimal Effektor-Funktion 3 haben. Hier präsentieren wir eine hocheffiziente AAPC basiertes System für die ex vivo Expansion von humanen CMV-spezifischen CTL zur adoptiven Immuntherapie (Abbildung 1). Die AAPC wurden durch Kopplung Zelle magnetische Kügelchen mit humanen HLA-A2-Ig-Dimer-und Anti-CD28mAb 4. Sobald AAPC gemacht sind, können sie mit verschiedenen Peptiden von Interesse geladen werden und bleiben für Monate funktionsfähig. In diesem Bericht wurden AAPC mit einer dominanten Peptid aus CMV, pp65 (NLVPMVATV) geladen. Nach der Kultivierung humaner CD8 + CTL von einem gesunden Spender mit AAPC für eine Woche, kann CMV-spezifischen CTL dramatisch in die Spezifität erhöht werden bis zu 98% (Abbildung 2) und verstärkt mehr als 10.000-fach. Wenn mehr CMV-spezifische CTL erforderlich sind, kann die weitere Expansion leicht durch repetitive Stimulation mit AAPC erreicht werden. Phänotypische und funktionelle Charakterisierung zeigt diese expandierten Zellen haben ein Effektor-Memory-Phänotyp und machen erhebliche Mengen der beiden TNF und IFN &amp;ggr; (Abbildung 3).

Ein neuer DC unabhängige Methode zur Induktion und Expansion von Antigen-spezifischen T-Zellen beschrieben. HLA A2-Ig Basis künstlicher Antigen-präsentierende Zellen (AAPC) sind mit HLA-A2 restringierte Peptide effizient erweitern CTL verschiedener Antigen-Spezifität geladen. Diese Technologie birgt ein großes Potenzial für die CTL-basierte adoptiven Immuntherapie.

HLA-Ig Basierend Artificial Antigen-präsentierende Zellen für eine effiziente Ex vivo Erweiterung des menschlichen CTL

CTL mit optimaler Effektorfunktion spielen eine entscheidende Rolle bei der Vermittlung des Schutzes gegen verschiedene intrazelluläre Infektionen und Krebserkrankungen. Einzelpersonen jedoch ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, künstliche antigenpräsentierende Zellen oder eine A PC zur ex vivo-Expansion menschlicher antigenspezifischer CTL für eine mögliche Anwendung in der adoptiven Immuntherapie zu verwenden. Dies wird erreicht, indem zunächst HLA A two IG und ein anti-humaner CD 28 monoklonaler Antikörper an magnetische Dyna-Beads konjugiert werden, um eine A A PC herzustellen. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht in der Qualitätskontrolle und der Peptidbeladung der A A PC. Der dritte Schritt des Verfahrens ist die Isolierung menschlicher peripherer CD acht-positiver T-Zellen. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, CD acht-positive T-Zellen eine Woche lang mit einer A PC zu inkubieren.Die CTL werden anschließend geerntet und charakterisiert, bevor sie entweder verwendet oder für eine weitere Woche erneut stimuliert werden, um den gewünschten Grad an Spezifität und Expansion zu erreichen. Letztendlich können Tetramer- oder Färbungsergebnisse erhalten werden, die zeigen, dass CTL, die in Gegenwart von A A PC expandiert wurden, eine erhöhte Antigenspezifität aufweisen. Heute werde ich Ihnen ein auf HI IG basierendes A A PC-System zeigen und wie man dieses System verwendet, um CMV-spezifische humane CTL ex vivo effizienter zu expandieren als mit anderen bestehenden Methoden.Unsere A A PC-Technologie bietet mehrere wichtige Vorteile. Sie ist kommerziell erhältlich, nahezu unbegrenzt verfügbar und, wie man sagen könnte, für alle HRAA-zwei-positiven Spender einsetzbar. Beginnen wir nun: Übertragen Sie ein Milliliter M vier 50 Epoxidperlen aus einer Stammlösung mit etwa 400 Millionen Perlen in eine sterile Schraubglasflasche.Waschen Sie die Kügelchen einmal, indem Sie ein Milliliter Boid-Puffer hinzufügen und das Glasvial dann an ein Dauermagnet-NBC-1-Gerät stellen, während die Kügelchen an der Wand des Vials haften. Entfernen Sie die Überstände durch Absaugen. Resuspendieren Sie die Kügelchen in einer Mischung aus Boid-Puffer, HLA-A2-Ig-Dimer und anti-humanem CD28 monoklonalem Antikörper.Danach die Protein-Kügelchen-Konjugation fördern, indem das Glasfläschchen 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius auf einem Rotator rotiert wird. Anschließend das Gefäß in einen MPC-One-Magneten stellen und sämtlichen Boratpuffer entfernen. Nach dem Entfernen des Puffers die Kügelchen zweimal mit je einem Milliliter Kügelchenwaschpuffer waschen.Incubieren Sie die Kügelchen nun in einem Milliliter Kügelchen-Waschpuffer und rotieren Sie das Gefäß 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius, um verbleibende Proteinbindungsstellen auf den Kügelchen zu blockieren. Entfernen Sie danach den Puffer aus dem Glasgefäß und ersetzen Sie ihn durch einen Milliliter frischen Kügelchen-Waschpuffer. Übertragen Sie 100 Mikroliter Fax-Waschpuffer in Fax-Röhrchen und geben Sie anschließend fünfmal 10 hoch 5 Kügelchen hinzu.Färben Sie die Kügelchen mit einem Mikroliter anti-muse IgG, einem PE und einem Mikroliter anti-muse IgG zwei a fite nach der Färbung für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Geben Sie drei Milliliter Fax-Waschpuffer zu jeder der Färbe-Proben hinzu. Pelletieren Sie anschließend die A A PC durch Zentrifugation bei 300 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.Suspendieren Sie die A A PC erneut in frischem Fax-Puffer und lesen Sie das Färbungsergebnis unverzüglich mit dem Durchflusszytometer ab. Waschen Sie die Kügelchen zweimal wie zuvor mit steriler PBS. Laden Sie anschließend die Kügelchen mit 10 Mikrolitern CMV-Peptid. Zählen Sie die Kügelchen mit einem Hämocytometer und beschriften Sie sie anschließend mit Datum und Konzentration der Kügelchen in Kügelchen pro Milliliter. Inkubieren Sie die A A PC mit dem Peptid mindestens drei Tage bei vier Grad Celsius. Zentrifugieren Sie etwa 100 Milliliter frisches peripheres Blut von einem HLA-A2-positiven Spender in 10 ml Sodiumheparin-Vakutainer-Röhrchen bei 300 ×g für 10 Minuten.Entfernen Sie bei Raumtemperatur vorsichtig die obere Plasmaschicht durch Absaugen. Ersetzen Sie das gesammelte Plasma durch steriles PBS und überführen Sie das Blut in einen sterilen T-75-Kulturgefäß. Mischen Sie das Blut und PBS gründlich durch Pipettieren, nachdem das gesamte Blut in einem Fialpack mit 15 Millilitern sowie in vier 50-Milliliter-Konusröhrchen gesammelt wurde.Überlagern Sie langsam 30 bis 35 Milliliter der Blutzellen auf der Fial in jedem Röhrchen. Unter Beibehaltung einer deutlichen Grenzfläche zwischen Fial und den Blutzellen zentrifugieren Sie das Blut-Fial-Gradienten bei 500 ×g für 20 Minuten bei Raumtemperatur mit ausgeschaltetem Bremsmodus und möglichst niedriger Beschleunigung, um nach der Zentrifugation eine klare Grenzfläche zwischen den Schichten zu erhalten. Aspirieren Sie anschließend die oberste Plasmaschicht ab und verwenden Sie dann eine serologische Pipette, um die PBMC-Schicht vorsichtig abzusaugen. Überführen Sie die PBMC in ein frisches 50-Milliliter-Konischgefäß. Wenn alle PBMC gewonnen wurden, geben Sie 30 Milliliter PBS zu den Zellen hinzu und zentrifugieren Sie diese. Als Nächstes verwerfen Sie das Überstand und waschen das Pellet erneut mit 30 Milliliter PBS, um den restlichen Fi-Call zu entfernen. Anschließend bereichern Sie die CD8-positiven T-Zell-Population mithilfe eines Milton Human CD8-positive T-cell Isolation Kits gemäß der Herstelleranleitung. Zählen Sie die CD8-positiven T-Zellen und bestätigen Sie die Reinheit durch FACS-Analyse.Suspendieren Sie 1 Million CTL in acht Millilitern T-Zell-Wachstumsfaktor-zwei-x-Kulturmedium plus acht Millilitern vollständigem RPMI-Medium und geben Sie 1 × 10⁶ der A A PC-Mischung hinzu. Verwenden Sie anschließend eine Mehrkanalpipette, um 160 Mikroliter Zellen pro Vertiefung in eine 96-Loch-U-Boden-Zellkulturplatte abzugeben. Inkubieren Sie die Zellen sieben Tage lang bei 37 °C in 5 % CO₂.Füttern Sie die Zellen am vierten Tag mit 80 Mikrolitern pro Vertiefung T-Zell-Wachstumsfaktor-Zwei-mal-Kulturmedium. Ernten Sie die Zellen am siebten Tag und setzen Sie sie dann dem Magneten aus, um die alten A A PC zu entfernen, sobald alle Kügelchen an der Wand des Gefäßes haften.Die Zellen gewinnen und in ein anderes 50-Milliliter-Konischgefäß überführen sowie die Zellzahl bestimmen. Die Antigen-Spezifität der A A PC mittels Tetramer-Färbung gemäß Herstellervorschrift ermitteln. Die gewonnenen Zellen erneut mit frischen A A PC unter denselben Bedingungen kultivieren, um die Zellzahl bei Erhalt der Antigen-Spezifität zu erhöhen.Hier ist ein repräsentatives Tetramer-Färbungsergebnis von CMV-spezifischen CTL, die nach einer Woche Kultur durch A-A-P-C generiert wurden. Dargestellt ist ein repräsentatives Ergebnis der intrazellulären Zytokinfärbung von CMV-spezifischen CTL, die durch A-A-P-C generiert wurden – die Spezifität für CMV betrug 61 % mittels Tetramer-Färbung. Diese Methode kann verwendet werden, um zentrale Fragen im Bereich der T-Zellen zu beantworten, beispielsweise, wie wir die optimalen Kulturbedingungen identifizieren können und welche Anforderungen an die funktionelle Modulation von T-Zellen bestehen.Die bescheidene Methode lieferte Erkenntnisse zur Behandlung von Viruserkrankungen. Sie kann auch auf andere Bereiche wie die Krebsforschung angewendet werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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