Funktionalisierte drahtbasierte Zielzellisolierung: Eine ex vivo Technik zur Isolierung von Krebszellen aus gespicktem peripherem Blut

Epithelzelladhäsionsmoleküle (EpCAMs) sind Oberflächentransmembran-Glykoproteine, die in schnell proliferierenden Epithelzellen bei Prostatakrebs überexprimiert werden. Um EpCAM-exprimierende Zellen zu isolieren, beginnen Sie mit einem medizinischen Draht mit einer funktionalisierten, goldbeschichteten Spitze. Funktionalisierungsschichten: ein polymeres Gel, das kovalent gebundene EpCAM-spezifische Antikörper enthält.

Tauchen Sie den Draht in eine periphere Blutsuspension, die fluoreszenzmarkierte Krebszellen enthält. Stellen Sie sicher, dass der funktionalisierte Teil in der Blutsuspension getaucht bleibt. Die EpCAMs auf den Krebszellen erkennen und binden an ihre spezifischen Antikörper, die auf dem Draht funktionalisiert sind.

Mit einem Puffer waschen, um ungebundene Zellen von der Drahtoberfläche zu entfernen. Biegen Sie den Draht und montieren Sie ihn auf einen pufferhaltigen Glasschieber, wobei der funktionalisierte Teil in den Puffer eingetaucht ist. Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um die helle Fluoreszenz aus dem Zytoplasma und den Zellkernen zu überprüfen und das Vorhandensein von eingefangenen Zellen auf dem Draht zu bestätigen.

Behandeln Sie den Draht mit einem Trennpuffer. Die proteolytischen Enzyme im Puffer spalten das polymere Gel und geben die Antikörper-Krebs-Zellkomplexe in den Puffer ab. Zentrifugieren Sie die Drahtbaugruppe, um die freigesetzten Antikörper-Zell-Komplexe im Pellet zu sammeln. Entfernen Sie den Draht und den enzymhaltigen Überstand. Resuspendieren Sie das mit der Zielzelle enthaltende Pellet in einem geeigneten Medium.

In 5 Milliliter peripheres Blut etwa 500 bis 500.000 Zellen geben und dann durch Umdrehen des Röhrchens mischen. Nachdem Sie den Draht aus dem Aufbewahrungsfach genommen haben, entfernen Sie die Gummikappe, die den Draht hält, und waschen Sie den Draht in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung und montieren Sie ihn in die Kappe des Schlauches. Inkubieren Sie dann das Röhrchen auf einem gekippten Walzenmischer bei 5 Umdrehungen pro Minute für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Spülen Sie den Draht nach der Inkubation dreimal in einer 1x phosphatgepufferten Kochsalzlösung. Lagern Sie den Draht dann in einem 15-Milliliter-Röhrchen mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung im Dunkeln.

Zeichnen Sie mit einem Fettstift eine rechteckige Fläche auf einen Objektträger und geben Sie 500 Mikroliter 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung darauf. Um den Funktionsteil des Drahtes in 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung zu tauchen, biegen Sie den nicht funktionsfähigen Teil des Drahtes und legen Sie ihn auf den Objektträger. Um die Anzahl der erfassten Zellen zu zählen, überprüfen Sie beide Seiten des Drahtes visuell. Übertragen Sie den Draht nach der Inspektion zurück in das 15-Milliliter-Rohr mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung und bewahren Sie ihn im Dunkeln auf.

In 1 Milliliter 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung werden 4 Milligramm der Freisetzungspufferkomponente gelöst. Filtrieren Sie dann die Lösung durch einen 0,2-Mikrometer-Sterilfilter, um den gebrauchsfertigen Puffer zu erhalten. Erwärmen Sie anschließend den Freisetzungspuffer 5 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach dem Erwärmen werden 1,6 Milliliter Freisetzungspuffer überführt, um ein 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen vollständig zu füllen. Als nächstes inkubieren Sie den Funktionsteil des Drahtes im Freisetzungspuffer bei 37 Grad Celsius in einem Wasserbad für 20 Minuten.

Legen Sie den Draht nach der Inkubation 15 Minuten lang bei 500 Umdrehungen pro Minute auf einen Schüttler. Dann zentrifugieren Sie den Draht bei 300 x g für 10 Minuten. Sobald die Zentrifugation beendet ist, lösen Sie den Draht aus dem Röhrchen, schließen Sie die Kappe und zentrifugieren Sie das Röhrchen erneut bei 300 x g für 10 Minuten.