Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Kutane periphere Nervenfasern durch frei schwebenden Immunfluoreszenz-Assay

Die Diagnose der Parkinson-Krankheit beruht immer noch auf klinischen Anzeichen einer motorischen Beteiligung, die später im Verlauf der Krankheit auftreten, wenn die meisten Neuronen der Substantia nigra bereits verloren sind. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse der dermalen Nerven durch Hautbiopsie, die einen potenziellen neuen Biomarker der Krankheit darstellt, in klinischen Studien zu verwenden. Die Hautbiopsie ist ein leicht zu beurteilendes, nicht-invasives Verfahren, das die Analyse von peripherem Nervengewebe ermöglicht, das anfällig für die Pathologie ist.

Alpha-Synuclein-Aggregate Detektion durch Hautbiopsie kann für diagnostische Zwecke verwendet werden, möglicherweise in frühen Phasen, wenn mögliche Heilung am effektivsten ist. Nachbereitung der Hautbiopsien beim gleichen Patienten ermöglicht eine Zeit- und spezielle Kursanalyse der Verbreitung von Alpha-Synuclein-Aggregaten im menschlichen Hautnervensystem. Diese können Licht auf die Pathogenese von Krankheiten werfen.

Bereiten Sie zum Starten dieses Verfahrens eine neue PLP-Fixierungslösung vor, wie in Tabelle 1 des Textprotokolls beschrieben. Unmittelbar nach dem Sammeln der Hautbiopsie, tauchen Sie sie in eine Röhre mit 10 Milliliter der fixativen Lösung. Über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren.

Am nächsten Tag, in einer Dunstabzugshaube, entfernen Sie die PLP Fixativ sanft. In der gleichen Röhre, waschen Sie die Biopsie dreimal für jeweils fünf Minuten, mit fünf Milliliter 0,1 Molar Sorensen Lösung für jede Wäsche. Entsorgen Sie die Lösung des Sorensen, und fügen Sie fünf Milliliter Kryoprotektorlösung hinzu.

Über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag die Biopsie bei vier Grad Celsius aufbewahren, wenn der Schnitt mit einem Kryotom innerhalb einer Woche durchgeführt werden soll. Stellen Sie zunächst das Kryotome auf minus 20 Grad Celsius ein.

Nehmen Sie einen Kryomold und füllen Sie es mit Kryo-Einbettung Medium. Tauchen Sie die Biopsie mit einer Pinzette in das Kryo-Einbettungsmedium ein, wobei die Längsachse parallel zum Boden des Kryomolds verläuft. Fangen Sie die Probe mit flüssigem Stickstoff ein, um einen festen Würfel mit Kryo-Einbettungsmedium zu erhalten, das die Biopsie in der richtigen Ausrichtung enthält.

Legen Sie die Probe in den Kryostat, und warten Sie 30 Minuten, damit sich die Biopsie akklimatisiert. Fixieren Sie dann die Probe auf dem Kryostat und schneiden Sie sie in 50-Mikrometer-Abschnitte. Mit einer kleinen Bürste die Kryo-Sektionen auf eine 96-Well-Platte mit 200 MikroliterFrostlösung in jedem Brunnen übertragen.

Danach die Platte bei minus 20 Grad Celsius aufbewahren. Zu Beginn füllen Sie einige der Brunnen einer frischen 96-Well-Platte mit 100 Mikroliter Waschlösung. Übertragen Sie die zu analysierenden Abschnitte von der Lagerplatte auf die, die die Waschlösung enthält.

Lassen Sie die Abschnitte in der Waschlösung für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Dann übertragen Sie jeden Abschnitt in einen leeren Brunnen mit der gleichen Waschlösung, und wiederholen Sie die Wäsche. Als nächstes fügen Sie die Waschlösung zu den Abschnitten hinzu und übertragen Sie sie in neue Brunnen mit 100 Mikroliter blockender Lösung.

Bei Raumtemperatur mindestens 90 Minuten und maximal vier Stunden inkubieren. Verdünnen Sie die primären Antikörper, Anti-PGP9.5 und Anti-5G4, in der Arbeitslösung. Übertragen Sie die Abschnitte in neue Brunnen mit 100 Mikrolitern der Arbeitslösung der primären Antikörper und inkubieren Sie über Nacht bei Raumtemperatur.

Am nächsten Tag die Abschnitte in Brunnen mit Waschlösung waschen, wie zuvor beschrieben. Verdünnen Sie die sekundären Antikörper, Goat Anti-Rabbit, um PGP9.5 zu erkennen, und Goat Anti-Maus, um 5G4 zu erkennen, in der Arbeitslösung. Übertragen Sie die gewaschenen Abschnitte in neue Brunnen mit 100 Mikrolitern der Arbeitslösung der Sekundärantikörper.

Bedecken Sie die Platte mit Aluminiumfolie, um das Bleichen von Fluorophor konjugiert mit sekundären Antikörpern zu vermeiden, und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 90 Minuten. Danach die Abschnitte wie zuvor beschrieben zweimal in Waschlösung waschen. Übertragen Sie die gewaschenen Abschnitte für fünf Minuten bei Raumtemperatur in neue Brunnen mit 100 Mikroliter DAPI.

Waschen Sie die Abschnitte zweimal in Waschlösung wie zuvor beschrieben. Montieren Sie dann die Abschnitte auf einem Dia in der richtigen Position, um Fehlfalten zu vermeiden. Fügen Sie dem Schlitten ein paar Tropfen Montagemedium hinzu und bedecken Sie den Abschnitt mit einem Deckbeleg.

Lassen Sie die Rutschen über Nacht trocknen. Am nächsten Tag lagern Sie die Dias in einer entsprechenden Box bei vier Grad Celsius, um Lichteinwirkung zu vermeiden. Betrachten Sie die Abschnitte mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop oder einem konfokalen Mikroskop.

Erfassen Sie die Bilder mit einer Kamera, die mit dem Mikroskop verbunden ist. Verwenden Sie dann ein Fluoreszenzmikroskop oder ein konfokales Mikroskop, um positive Signale in Abschnitten in Bezug auf räumliche Verteilung und Intensität des Signals zu analysieren, wie im Textprotokoll beschrieben. Nach der beschriebenen Methode werden Alpha-Synuclein-Aggregate, die mit 5G4-Antikörpern gekennzeichnet sind, in dermalen Nervenfasziden nachgewiesen, die autonome Strukturen von PD-Patienten innervieren.

Die Morphologie der Alpha-Synuclein-Ablagerungen erscheint als gepunktetes Signal entlang der Axone derdermaler Nerven. Die repräsentative Anwendung dieses Protokolls bei 19 PD-Patienten und 17 Kontrollen in Hautbiopsien an drei anatomischen Stellen zeigt, dass 5G4 eine Empfindlichkeit von 81 % und eine Spezifität von 86 % im Vergleich zu gesunden Kontrollen hat. Phosphoryliertes Alphasynuclein hat eine Empfindlichkeit von 56% und eine Spezifität von 100%5G4 und phosphorylierte Alpha-Synuclein-positive Ablagerungen finden sich hauptsächlich um Schweißdrüsen, aber auch in Muskelarrector Pili, kleinen Gefäßen und subepidermalen und dermalen Plexus, aber nie in intraepidermalen Nervenfasern.

Im Allgemeinen ist es innerhalb der Schweißdrüsen Lumen möglich, ein unspezifisches Signal zu beobachten, das als 5G4 oder phosphorylierte Alpha-Synuclein-Positivität fehlinterpretiert werden könnte. Diese Art von Signal ist gepunktet, sphärisch, und es ist höchstwahrscheinlich auf intraluminal autofluoreszierendes Material zurückzuführen, wie in technischen Kontrollen ohne primäre und sekundäre Antikörper gezeigt. Die Kolokalisierung mit PGP9.5, die die Nervenfasern markiert, die morphologisch fadenförmig und länglich sind, hilft, das richtige Signal zu identifizieren.

Daher wird die Spezifität des 5G4-Signals durch eine doppelte Immunostainierung mit einem axonalen Marker stark erhöht. Eine genaue Fixierung der Biopsie ist notwendig, um eine hochwertige immunfluoreszierende Färbung zu erzeugen und die fluoreszierenden Signale zuverlässig zu interpretieren. Wenn das Fixativ nicht richtig vorbereitet ist, oder wenn eine Überfixierung aufgetreten ist, wird das Ergebnis eine hohe Autofluoreszenz sein, die das Signal von Nervenfasern maskiert, die die dermal-epidermale Kreuzung kreuzen, oder die hauptdermalen Strukturen innervierend verkörpern.

Der wichtigste Schritt dieses Verfahrens ist die Gewebefixierung. Achten Sie auf den pH-Wert der PLP-Fixierlösung und den Zeitpunkt der Inkubation, um Autofluoreszenz und ein bestimmtes Signal zu vermeiden.