Einzelzellprobenahme mittels Mikromanipulation: Eine Technik zur Isolierung einzelner Zellen aus Krebszellsuspension
JoVE Encyclopedia of Experiments
Krebsforschung
0 Ansichten • 2:10 Min. • April 30th, 2023
Die Einzelzellprobenahme ermöglicht die Isolierung einer einzelnen lebenden Zelle aus einer Suspension von Krebszellen für die nachgelagerte Analyse.
Beginnen Sie die Isolierung mit einer Krebszellsuspension. Übertragen Sie das gewünschte Volumen dieser Suspension auf einen Objektträger. Lassen Sie den Objektträger eine Weile ungestört, um die Bewegung der Partikel zu reduzieren und die Zellen absetzen zu lassen.
Übertragen Sie nun den Objektträger unter ein Mikroskop, das mit einem Mikromanipulator ausgestattet ist, der mit einer Mikrokapillarspitze verbunden ist. Dieses hochpräzise Instrument erleichtert die physikalische Interaktion mit Zellen in der Probe auf mikroskopischer Ebene.
Richten Sie die Mikrokapillarspitze in die Nähe einer einzelnen Zielzelle. Sammeln Sie die Zielzelle durch Saugen in die Mikrokapillare. Übertragen Sie nun die Mikrokapillare direkt in ein Röhrchen, das den gewünschten Sammelpuffer enthält.
Werfen Sie den Mikrokapillarinhalt aus, um die eingefangene Einzelzelle in den Puffer freizusetzen. Lagern Sie die isolierte lebende Einzelzelle bis zur weiteren Analyse auf Eis.
Für die Mikromanipulation übertragen Sie die gesamten 100 Mikroliter Zellsuspension auf einen Objektträger. Legen Sie dann den Objektträger auf ein Mikroskop, das mit einem Mikromanipulator ausgestattet ist, und lassen Sie die Zellen 5 Minuten lang ruhen. Anschließend werden 2 Mikroliter des Zelllyse-Mastermixes in 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen pipettiert und auf Eis übertragen. Verwenden Sie den Mikromanipulator, um eine einzelne Zelle in 1 Mikroliter 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung zu sammeln.
Übertragen Sie dann die Zelle direkt in 2 Mikroliter Zelllyse-Mastermix. Verwenden Sie eine Desktop-Mikrofuge, um die Proben schnell 3 Sekunden lang bei 2000 x g herunterzuschleudern, um die Flüssigkeit am Boden des Röhrchens zu sammeln.
Übersicht
In diesem Artikel wird eine präzise Methode zur Isolierung einzelner Zellen aus einer heterogenen Zellsuspension vorgestellt, die eine anschließende Einzelzellanalyse ermöglicht. Das Protokoll nutzt ein Mikromanipulationssystem mit Mikrokappillare, um lebende Einzelzellen gezielt auszuwählen und zu übertragen, um sie anschließend genomisch oder molekular zu charakterisieren.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Einzellanalyse
- Krebsforschung
Hintergrund
- Die Einzelzellanalyse erfordert die Isolierung einzelner Zellen aus komplexen Populationen.
- Die traditionelle Gesamtanalyse kann zelluläre Heterogenität verbergen.
- Die Mikromanipulation ermöglicht die hochpräzise Auswahl von Zielzellen.
- Isolierte Einzelzellen können für nachgeschaltete Anwendungen wie die gesamte Genomamplifikation verwendet werden.
Zweck der Studie
- Eine zuverlässige Methode zur Isolierung einzelner lebender Zellen aus einer Suspension vorstellen.
- Die molekulare Charakterisierung auf Einzelzell-Ebene für nachgeschaltete Analysen ermöglichen.
- Den Einsatz der Mikromanipulation zur Zellisolierung demonstrieren.
Verwendete Methoden
- Herstellung einer Krebszell-Suspension und Übertragung auf einen Objektträger.
- Absetzen der Zellen, um die Isolierung zu erleichtern.
- Verwendung eines Mikroskops mit Mikromanipulator und Mikrokapillspitze zur Einzelzell-Auswahl.
- Sammlung einer einzelnen Zelle durch Absaugen und Übertragung in einen Sammelpuffer oder Lysispuffer-Mastermix.
- Kurze Zentrifugation, um die Probe am Röhrchenboden zu sammeln.
Hauptergebnisse
- Effiziente Isolierung einzelner lebender Zellen aus einer heterogenen Suspension.
- Erfolgreicher Transfer einzelner Zellen in Puffer zur Zelllyse für nachgeschaltete Analysen.
- Minimierte Kontamination und hohe Präzision bei der Zellselektion.
- Das Protokoll ermöglicht anschließende genomische Einzelzell-Anwendungen.
Schlussfolgerungen
- Die beschriebene Mikromanipulationstechnik ermöglicht eine zuverlässige Einzelzell-Isolierung.
- Diese Methode eignet sich für nachgeschaltete genomische und molekulare Einzelzellanalysen.
- Die hochpräzise Isolierung verringert Kontaminationen und erhält die Zellintegrität.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Einzelzell-Mikromanipulation ermöglicht die gezielte Isolierung einzelner Krebszellen und unterstützt dadurch eine hochauflösende molekulare Analyse in nachfolgenden Schritten. Diese Fähigkeit ist entscheidend, um zelluläre Heterogenität aufzulösen und das Vorhersagevertrauen in der frühen Forschung und translationsmedizinischen Entwicklung zu erhöhen. Die Integration einer solchen präzisen Isolierung in die Entwicklungs- und Forschungsabläufe verbessert die Zielvalidierung sowie die risikoadjustierten Portfolioentscheidungen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung zellulärer Heterogenität auf Einzelzell-Ebene.
- Unterstützt die funktionelle Target-Validierung durch Isolierung spezifischer Zellphänotypen.
- Erleichtert die mechanistische Ent-Risikobewertung durch präzise Zellselektion.
- Verbessert die Vorhersagesicherheit für die nachgeschaltete molekulare Charakterisierung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet validierte Einzelzellproben für quantitative nachgeschaltete Assays vor.
- Unterstützt die Reproduzierbarkeit von Assays, indem Kontaminationen der Probe minimiert werden.
- Ermöglicht die Standardisierung des Eingabematerials für Screenings mit hohem Informationsgehalt.
- Erlaubt eine zuverlässige Bewertung der Wirkstoffeffekte auf einzelne Zellen.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Ausrichtung auf krankheitsrelevante Systeme durch die Isolierung seltener oder resistenter Teilpopulationen von Krebszellen.
- Unterstützt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung durch genomische Einzelzellanalyse.
- Ermöglicht die Identifizierung translationsrelevanter Biomarker auf Einzelzellebene.
- Reduziert biologische Unschärfen bei der Auswahl präklinischer Modelle.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Mikromanipulationstechnik ist an der Schnittstelle zwischen früher Entdeckungsforschung und präklinischer Forschung angesiedelt und ermöglicht die Einzelzellanalyse aus heterogenen Krebszell-Suspensionen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch die Isolierung definierter Zelltypen.
- Screening: Stellt reproduzierbare, kontaminationsminimierte Einzelzell-Eingaben für nachgeschaltete Analysen bereit.
- Analytik: Liefert quantitative Einzelzell-Ausgaben für den vergleichenden molekularen Nachweis.
- Translationale Forschung: Ermöglicht die Entdeckung von Biomarkern und die Abstimmung von Krankheitsmodellen auf Einzelzellebene.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für die Isolierung einzelner Zellen in verschiedenen Forschungs- und Entwicklungsprogrammen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der Target-Validierung.
- Operationaler Wert: Standardisiert die Einzelzell-Isolierung mit hoher Reproduzierbarkeit und minimaler Kontamination.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundiertere Go/No-Go-Entscheidungen durch die Bereitstellung hochauflösender zellulärer Daten.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Entdeckungsassets.
Durchführungsaspekte
- Erfordert technische Expertise in Mikromanipulation und Mikroskopie.
- Benötigt Zugang zu einem Mikroskop mit Mikromanipulator und Mikrokapiillarsystem.
- Erfordert strikte Standardisierung zwischen den Teams zur Reproduzierbarkeit.
- Kann Anpassungen für verschiedene Zelltypen oder Suspensionsbedingungen erfordern.
- Die Durchsatzrate ist durch die manuelle Bedienung und die Geschwindigkeit der Zellselektion begrenzt.
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Zuletzt aktualisiert: 22 August 2026