Einzelzellprobenahme mittels Laser-Capture-Mikrodissektion: Eine Technik zur Gewinnung von Zielzellen aus einer heterogenen Zellpopulation

Die Laser-Capture-Mikrodissektion hilft bei der Gewinnung einer einzelnen Zielzelle aus einer Zellmischung, die auf einem Objektträger vorbereitet wurde. Beginnen Sie damit, einen geeigneten Objektträger auf seiner Oberfläche zu nehmen, der mit einer UV-durchlässigen, biochemisch inerten Membran beschichtet ist. Setzen Sie den Objektträger UV-Licht aus, um ihn hydrophiler zu machen und die Zellhaftung zu verbessern.

Bauen Sie den Objektträger in ein Zytozentrifugengerät ein und geben Sie die Zellsuspension auf den Trichteranschluss des Geräts. Zytozentrifuge, damit die Zentrifugalkraft eine Monoschicht von Zellen auf einer kleinen Fläche auf dem Objektträger konzentrieren und abscheiden kann. Lassen Sie die Folie an der Luft trocknen.

Legen Sie den Objektträger mit der Probenseite nach oben unter ein Laser-Mikrodissektionsmikroskop. Definieren Sie den Bereich, der die interessierende Zelle umgibt. Fokussieren Sie nun den Laserstrahl, um die Zielzelle-haltige Region zusammen mit der Membranbeschichtung zu zerlegen. Defokussieren Sie anschließend den Laserstrahl und pulsieren ihn, um Druck zu erzeugen. Diese Energie katapultiert den mikropräparierten Bereich in den umgekehrten Deckel eines vormontierten Sammelröhrchens, das einen Puffer enthält, der über dem Objektträger platziert ist.

Nehmen Sie das Röhrchen heraus und schließen Sie die Kappe. Drehen Sie das Röhrchen, um den Puffer mit der einzelnen Zielzelle zum Röhrchenboden zu bringen. Kühlen Sie das Röhrchen bis zur weiteren Analyse.

Für die Laser-Mikrodissektion werden die gesamten 300 Mikroliter Zellsuspension 5 Minuten lang bei 300 x g auf einen membranbeschichteten Objektträger zyzentrifugiert. Legen Sie dann den membranbeschichteten Objektträger auf ein Mikroskop, das in der Lage ist, die Mikrodissektion zu lasern. Pipettieren Sie anschließend 4,5 Mikroliter des Zelllyse-Mastermixes in den Deckel des 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchens.

Setzen Sie die Kappe über die Probe und entnehmen Sie eine einzelne Zelle durch Lasermikrodissektion. Prüfen Sie direkt danach, ob sich in der PCR-Kappe isolierte Zellen befinden. Nehmen Sie das PCR-Röhrchen aus dem Laser-Mikrodissektionsmikroskop und schließen Sie das Röhrchen. Sammle die gesamte Flüssigkeit am Boden des Röhrchens mit einer kurzen Drehung.