Einzelne Zelle Multiplex reversen Transkription Polymerase-Kettenreaktion nach Patch-clamp

Dieses Protokoll beschreibt die kritische Schritte und Vorsichtsmaßnahmen erforderlich, einzelne Zelle multiplex reversen Transkription Polymerase-Kettenreaktion nach Patch-Clamp durchzuführen. Diese Technik ist eine einfache und effektive Methode um das Expressionsprofil eines vorgegebenen Satzes Gene aus einer einzigen Zelle zeichnet sich durch Patch-Clamp-Aufnahmen zu analysieren.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der neurowissenschaftlichen Forschung zu beantworten, wie z. B. die Charakterisierung der Neuropopulation oder die Identifizierung von Quellen und Zielen von Übertragungssystemen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es ermöglicht, das Expressionsprofil eines vorselektierten Satzes von Genen aus einer einzelnen Zelle schnell und einfach zu bestimmen. Diese Methode kann also einen Einblick in die Random-Diversity-Maus geben.

Es kann auch auf andere Zelltypen, wie z.B. Astrozyten und in vielen Tiermodellen angewendet werden. Diese Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Arrest- und Aspiring-Schritte schwer zu erlernen sein können, da die Daten eine Menge Zytoplasma benötigen, um analysiert zu werden. Bereiten Sie vor dem Schneiden ein Sezierset vor, das eine chirurgische Schere, eine feine Irisschere, zwei Spachtel, eine Pinzette, eine Scheibe Papierfilter und Cyanacrylatkleber enthält.

Tränken Sie dann die eiskalte Schneidlösung mit Carbogyn und kühlen Sie die Schneidkammer auf minus 20 Grad Celsius ab. Entfernen Sie anschließend die Kopfhaut des Tieres und öffnen Sie den Schädel. Entnehmen Sie das Gehirn vorsichtig und geben Sie es in ein kleines Becherglas, das mit karbogenisierter, eiskalter Schneidlösung gefüllt ist.

Entfernen Sie anschließend die Schneidkammer von minus 20 Grad Celsius und entfernen Sie die Feuchtigkeit mit einem Papiertuch. Präparieren Sie das Gehirn vorsichtig, um die interessierende Region zu isolieren. Kleben Sie es auf die Schneidkammer und fügen Sie die boginierte, eiskalte Schneidlösung hinzu.

Mit einem Vibraton 300 Mikrometer dicke Scheiben schneiden. Bringen Sie die Scheiben in eine Ruhekammer, die mit sauerstoffhaltiger Schneidlösung bei Raumtemperatur gefüllt ist, und lassen Sie sie mindestens 30 Minuten lang ruhen. Für die Einzelzell-RT-PCR und die gezielte Zellcharakterisierung ist die Ganzzellaufzeichnung auf nicht länger als 20 Minuten zu begrenzen, um die mRNAse zu erhalten.

Bereiten Sie am Ende der Aufzeichnung ein 500-Mikroliter-PCR-Röhrchen vor, das mit zwei Mikrolitern 5xRT-Mix und 0,5 Mikrolitern 20xDTT gefüllt ist. Schleudern Sie es und bewahren Sie es auf Eis auf. Ernten Sie dann das Zytoplasma der Zelle, indem Sie einen sanften Unterdruck ausüben.

Überwachen und kontrollieren Sie den Zellinhalt, bevor er in die Pipette gelangt, während Sie einen dichten Verschluss halten und eine Ansammlung des Zellkerns vermeiden, wenn einige Gene berücksichtigt werden. Im Falle von Genen ist es wichtig, die Ansammlung des Zellkerns zu vermeiden und einen Satz Primer zur Amplifikation der gDNA zur Vorbereitung auf eine allgemeine Kontamination einzuschließen. Wenn sich der Zellkern der Spitze der Pipette nähert, lassen Sie den Unterdruck ab und bewegen Sie die Pipette weg.

Stellen Sie sicher, dass die dichte Versiegelung erhalten bleibt, und starten Sie die Entnahme des Zytoplasmas an der neuen Pipettenposition erneut. Ziehen Sie anschließend die Pipette vorsichtig zurück, um ein Pflaster nach außen zu bilden, um die Kontamination durch die extrazellulären Trümmer zu begrenzen und den Verschluss der Zellmembran für die anschließende histochemische Analyse zu begünstigen. Denken Sie daran, dass Noppen, Mikromanipulatoren, Computertastaturen oder Computermaus protonengeladene Quellen für die Kontamination von RNASE sind.

Wenn sie während der Aufnahme berührt wurden, wechseln Sie die Handschuhe. Befestigen Sie anschließend die Pipette am Expeller und geben Sie den Inhalt durch Anlegen von Überdruck in das PCR-Röhrchen ab. Brechen Sie die Spitze der Pipette in das PCR-Röhrchen, um die Sammlung des Inhalts zu erleichtern.

Zentrifugieren Sie dann das Röhrchen kurz und fügen Sie 0,5 Mikroliter RNAse Inhibitor und 0,5 Mikroliter RTAse hinzu. Vorsichtig mischen, erneut zentrifugieren und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag drehen Sie die Tube und lagern Sie sie bis zu mehreren Monaten bei minus 80 Grad Celsius.

Bis zur PCR-Analyse und Durchführung des ersten Amplikationsschritts. Um die PCR zu validieren, mischen und verdünnen Sie ein Primerpaar, fügen Sie ein Mikromolar mit der Pipette hinzu, die für die Einzelzell-RTPCR bestimmt ist. Stellen Sie den Thermocycler drei Minuten lang auf 95 Grad Celsius ein, führen Sie 40 Zyklen durch, gefolgt von einem letzten Dehnungsschritt bei 72 Grad Celsius für fünf Minuten.

Um die Bildung von Primer-Dimeren zu minimieren, führen Sie einen Heißstart durch, indem Sie die PCR-Röhrchen in den auf 95 Grad Celsius vorgeheizten Thermocycler legen. Nach 30 Sekunden schnell 20 Mikroliter der Primermischung auf dem Öl ausstoßen. Sobald das Primerpaar validiert wurde, testen Sie es mit dem Multiplex-Protokoll.

Mischen und verdünnen Sie die äußere Grundierung zusammen bei einem Mikromolaren. Lagern Sie die Multiplex-Primermischung bis zu mehreren Wochen bei minus 20 Grad Celsius. Als nächstes bereitest du eine Vormischung vor und legst sie auf Eis.

Schnippen Sie das PCR-Röhrchen, drehen Sie es und fügen Sie zwei Tropfen Mineralöl hinzu. Führen Sie nach drei Minuten bei 95 Grad Celsius 20 PCR-Zyklen durch. Führen Sie einen Heißstart wie beschrieben mit 20 Mikrolitern Multiplex-Primermischung durch.

Bereiten Sie dann eine Anzahl von PCR-Röhrchen vor, die mit der Anzahl der zu analysierenden Gene identisch ist. Bereiten Sie eine Vormischung mit einem Mikroliter des ersten PCR-Produkts pro Gen als Template vor. Passen Sie alle Volumina entsprechend der Anzahl der zu analysierenden Gene an und erwägen Sie, 10 % des zusätzlichen Volumens zu verwenden, um Pipettierfehler auszugleichen.

Schütteln Sie vorsichtig, drehen Sie das Röhrchen und geben Sie 80 Mikroliter Vormischung in jedes PCR-Röhrchen. Geben Sie zwei Tropfen Mineralöl pro Tube hinzu, ohne die Wand oder den Deckel der Tuben zu berühren. Führen Sie 35 PCR-Zyklen durch und führen Sie dann einen Heißstart durch, indem Sie 20 Mikroliter der internen Primermischung ausstoßen.

Analysieren Sie die zweiten PCR-Projekte mittels Aragose-Gelelektrophorese. Ein pyramidenförmiges Neuron der fünften Schicht wurde visuell durch sein großes Soma und einen markanten apikalen Dendriten identifiziert. Die Aufzeichnung von Pull-Zellen zeigte typische elektrophysiologische Eigenschaften von regulären Spike-Neuronen der fünften Schicht mit einem niedrigen Eingangswiderstand, lang anhaltenden Aktionspotentialen und einer ausgeprägten Spike-Frequenz-Anpassung.

Die molekulare Analyse dieses Neurons ergab die Expression von vGluT1, was seinen glutamitergen Phänotyp bestätigt. Dieses Neuron exprimierte auch Somatostatin und das ATP1-alpha-1 sowie drei Untereinheiten der Natrium-Kalium-ATPAs. Die Biocytin-Markierung der aufgezeichneten Neuronen bestätigte eine pyramidale Morphologie.

Wie von den glutamitergen Neuronen erwartet, zeigte die molekulare Analyse von 26 Pyramidenzellen der fünften Schicht die Expression von vGluT1, aber keines der beiden GADs. Einmal kann die Technik innerhalb von zwei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig vorgeformt ist. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, sehr vorsichtig zu sein, um Kontaminationen zu vermeiden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Expression von 10 Genen gleichzeitig aus einzelnen Zellen untersuchen können, die durch Patch-Klumpen gemäß Hirnschnitten gekennzeichnet sind, nach Zytoplasma-Entnahme, reverser Transkription und Hot-Start-PCRs. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Ethidiumbromid extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und Laborkitteln immer getroffen werden sollten, während Sie dieses Verfahren durchführen.