Name: Einzelne Zelle Multiplex reversen Transkription Polymerase-Kettenreaktion nach Patch-clamp (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Erfahren Sie die Einzelzell-Multiplex-RT-PCR nach Patch-Clamp zur Analyse von Genexpressionsprofilen in Neuronen. Diese Methode ermöglicht Forschern, zelluläre Funktionen in der Neurowissenschaft präzise zu untersuchen.

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Wir danken Dr. Alexandre Mourot für seine Bemerkungen über das Manuskript. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse von der Agence Nationale De La Recherche (ANR 2011 MALZ 003 01; ANR-15-CE16-0010 und ANR-17-CE37-0010-03), BLG wird von der Fondation Pour la Recherche Sur Alzheimer-Stipendium unterstützt. Wir danken der Tierstation IBPS (Paris, Frankreich).

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Einzelne Zelle Multiplex-RT-PCR nach Patch-Clamp zuverlässig und gleichzeitig die Expression von mehr als 30 Genen Elektrophysiologisch identifizierten Zellen5Sonde kann. Analyse der Genexpression auf der Ebene der einzelnen Zelle erfordert hocheffiziente PCR-Primer. Eine der am meisten einschränkenden Maßnahmen ist Sammlung des Zellinhalts. Seine Wirksamkeit hängt vom Durchmesser des Patch-PIPETTENSPITZE, die so groß wie möglich sein muss, während die passende Größe der Zellen. Pipetten mit einem...

Die Großhirnrinde besteht aus zahlreichen Zelltypen in verschiedenen physiologischen Prozessen beteiligt. Ihre Identifizierung und Charakterisierung, eine Voraussetzung für das Verständnis ihrer spezifischen Funktionen können sehr anspruchsvoll sein angesichts der großen morphologische, physiologische und molekulare Vielfalt, die kortikale Zelle Arten1 charakterisiert ,2,3,4.
Einzellige Multiplex-RT-PCR basiert auf der Kombination von Patch-Clamp und RT-PCR-Techniken. Es kann gleichzeitig die Expression von mehr als 30 vordefinierte Genen Elektrophysiologisch identifizierten Zellen5Sonde. Die Einbeziehung eines neuronalen Tracers in der Aufnahme-Pipette weiter ermöglicht die Morphologische Charakterisierung der aufgezeichneten Zellen nach histochemische Offenbarung6,7,8,9, 10. es ist eine sehr nützliche Technik für die Klassifizierung von neuronalen Arten anhand der multivariaten Analyse ihrer phänotypischen Merkmale5,9,10,11,12 ,13,14. Einzelne Zelle Multiplex-RT-PCR eignet sich auch zur Charakterisierung von nicht-neuronalen Zellen wie Astrozyten15,16,17und kann praktisch auf jedem Gehirn Struktur18angewendet werden, 19,20,21,22,23 und Zelle Art, vorausgesetzt, sie können in ganz-Zell Konfiguration aufgenommen werden.
Diese Technik ist sehr praktisch für die Identifizierung von zellulären Quellen bzw. Ziele der Übertragung Systeme7,8,15,16,20,21, 24,25,26,27,28, vor allem, wenn spezifische Antikörper fehlen. Es stützt sich auf Patch-Clamp-Aufnahmen von visuell identifizierte Zellen29und ermöglicht somit auch die Ausrichtung der Zellen in einem bestimmten zellulären Umgebung8,15,16. Außerdem da die Cytoarchitecture von Hirngewebe in Gehirnscheiben bewahrt wird, ermöglicht dieser Ansatz auch Studie über die anatomischen Verhältnisse der gekennzeichneten Zellen mit neuronalen und nicht-neuronale Elements7,8 , 18.
Da diese Technik durch die Menge des geernteten Zytoplasma und die Effizienz des RT begrenzt ist, kann der Nachweis von mRNA ausgedrückt bei geringen Kopienzahl schwierig sein. Obwohl andere Ansätze, basierend auf RNaseq-Technologie ermöglichen, um das ganze Transkriptom Einzelzellen3,4,30,31, zu analysieren, benötigen sie Hochdurchsatz-teure Sequenzer nicht unbedingt Jedes Labor zur Verfügung. Da die einzelne Zelle Multiplex-RT-PCR Technik Endpunkt PCR verwendet, erfordert es nur allgemein verfügbar Thermocycler. Es kann leicht in Laboratorien ausgestattet mit elektrophysiologischen Setups entwickelt werden und erfordert keine teure Ausrüstung. Es kann innerhalb eines Tages eine Qualitative Analyse des Ausdrucks einen vordefinierten Satz von Genen bereitstellen. So bietet dieser Ansatz eine gute Anbindung an die molekulare Charakterisierung einzelner Zellen in einer schnellen Weise.

<table><tbody><tr><td>MACAW v.2.0.5</td><td>NCBI</td><td></td><td>Mehrfachausrichtung für das Primer-Design</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>VWR</td><td>443852A</td><td>RT</td></tr><tr><td>Zufällige Primer</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>11034731001</td><td>RT</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-4065-52</td><td>RT und PCR</td></tr><tr><td>RNasin Ribonuklease-Inhibitoren</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td>RT</td></tr><tr><td>SuperScript II Reverse Transkriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18064014</td><td>RT</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase</td><td>Qiagen</td><td>201205</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>M5904-5ML</td><td>PCR</td></tr><tr><td>PCR Primer</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td></td><td>PCR / entsalzt und verdünnt bei 200 & Mikro; M</td></tr><tr><td>Röhrchen, 0,5 mL, flacher Verschluss</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AB0350</td><td>RT und PCR</td></tr><tr><td>BT10 Serie - 10 & Mikro; L Filterspitze</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT10</td><td>RT und PCR</td></tr><tr><td>BT20 Serie - 20 & Mikro; L Filterspitze</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT20</td><td>RT und PCR</td></tr><tr><td>BT200 Serie - 200 & Mikro; L Filterspitze</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT200</td><td>RT und PCR</td></tr><tr><td>BT1000 Serie - 1000 & Mikro; L Filterspitze</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT1000.96</td><td>RT und PCR</td></tr><tr><td>DNA Thermal Cylcer</td><td>Perkin Elmer Cetus</td><td></td><td>PCR</td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>E1510-10ML</td><td>Agarose-Gelelektrophorese</td></tr><tr><td>Tris-Borat-EDTA-Puffer</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>T4415-1L</td><td>Agarose-Gelelektrophorese</td></tr><tr><td>UltraPure</td><td>Agarose Life Technologies</td><td>16500-500</td><td>Agarose-Gelelektrophorese</td></tr> <tr><td>& Phi; X174 DNA-Hae III Digest</td><td>NEB (New England BioLabs)</td><td>N3026S</td><td>Agarose-Gelelektrophorese</td></tr><tr><td>EDA 290</td><td>Kodak</td><td></td><td>Agarose-Gelelektrophorese</td></tr><tr><td>Elektrophorese Stromversorgung EPS 3500</td><td>Pharmacia Biotech</td><td></td><td>Agarose-Gelelektrophorese</td></tr><tr><td>Midi Horizontale Elektrophoreseeinheit Modell SHU13</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td></td><td>Agarose-Gelelektrophorese</td></tr><tr><td>Glattes Papier mit satinierter Optik</td><td>Fisherbrand</td><td>1748B</td><td>Patchklemme innere Lösung</td></tr><tr><td>Kaliumhydroxyde</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>60377</td><td>Patchklemme innere Lösung</td></tr><tr><td>Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&prime;,N&prime;-tetraessigsäure</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>E3889</td><td>Patchklemme innere Lösung</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>H4034</td><td>Patch-Klemme innere Lösung</td></tr><tr><td>Kalium-D-gluconat</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>G4500</td><td>Patch-Klemme innere Lösung</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>M1028</td><td>Patch-Klemme innere Lösung</td></tr><tr><td>5500 Dampfdruckosmometer</td><td>Wescor</td><td></td><td>Patch-Klemme innere Lösung</td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>B4261</td><td>Patch-Klemme interne Lösung</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S5016</td><td>Schnittvorbereitung</td></tr><tr><td>D-(+)-Glukosemonohydrat</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>49159</td><td>Schnittvorbereitung</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S6191</td><td>Schnittvorbereitung</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>60128</td><td>Schnittvorbereitung</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>31437-M</td><td>Schnittvorbereitung</td></tr><tr><td>Natriumphosphat monobasisch</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S5011</td><td>Schnittvorbereitung</td></tr><tr><td>Magnesiumchloridlösung</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>63069</td><td>Schnittvorbereitung</td></tr><tr><td>Calciumchloridlösung</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>21115</td><td>Schnittvorbereitung</td></tr><tr><td>Kynurensäure</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>K3375</td><td>Schnittvorbereitung</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Piramal Healthcare UK</td><td></td><td>Schnittvorbereitung</td></tr><tr><td>VT 1000S</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047235613</td><td>Schnittvorbereitung</td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxidlösung</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>H1009</td><td>Patch Clamp Setup Reinigung</td></tr><tr><td>Dünnwandige Glaskapillaren mit Filament</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-4</td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>PP-83</td><td>Narishige</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>Eppendorf Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>BX51WI Upright</td><td>Mikroskop Olympus</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>XC-ST70/CE CCD S/W VIDEOKAMERA</td><td>Sony</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>Axopatch 200B Verstärker</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>Digidata 1440</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>pCLAMP 10 Software-Suite</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>10 mL Spritze</td><td>Terumo</td><td>SS-10ES</td><td>Austreiben</td>der</tr><tr><td>E-Serie mit geradem Körper (Halter)</td><td>Phymep</td><td>64-0997</td><td>Austreiben</td></tr> von <tr><td>Natriumphosphat zweibasisch</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S7907</td><td>Histochemische Offenbarung</td></tr><tr><td>Natriumphosphat monobasisch</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S8282</td><td>Histochemische Offenbarung</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>P6148</td><td>Histochemische Offenbarung</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>X100</td><td>Histochemische Offenbarung</td></tr><tr><td>Gelatine aus Kaltwasserfischhaut</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>G7041</td><td>Histochemische Offenbarung</td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 Konjugat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11223</td><td>Histochemische Offenbarung</td></tr><tr><td>24-Well-Platte</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td>Histochemische Offenbarung</td></tr></tbody></table>

einzelne zelle multiplex reversen transkription polymerase-kettenreaktion nach patch-clamp

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

Die Großhirnrinde besteht aus zahlreichen Zelltypen, die verschiedenen morphologische, physiologische und molekulare Eigenschaften ausstellen. Diese Vielfalt behindert einfache Identifizierung und Charakterisierung dieser Zelltypen, Voraussetzungen, um ihre spezifischen Funktionen zu studieren. Dieser Artikel beschreibt das Multiplex-Einzelzelle reversen Transkription Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) Protokoll, das, nach Patch-Clamp-Aufnahme in Scheiben schneiden, ermöglicht gleichzeitig die Expression von Zehntausenden Gene in einer einzelnen Zelle erkennen. Diese einfache Methode kann mit Morphologische Charakterisierung durchgeführt werden und gilt allgemein für die phänotypische Merkmale der verschiedenen Zelltypen und ihre bestimmten zellulären Umgebung, wie z. B. in der Nähe von Blutgefäßen zu bestimmen. Das Prinzip dieses Protokolls ist aufzeichnen eine Zelle mit der Patch-Clamp-Technik, zu ernten und umkehren transkribieren zytoplasmatischen inhaltlich und qualitativ zu erkennen der Ausdruck der einen vordefinierten Satz von Genen durch multiplex-PCR. Es erfordert eine sorgfältige Planung der PCR Zündkapseln und intrazellulären Patch-Clamp-Lösung kompatibel mit RT-PCR. Um eine selektive und zuverlässige Abschrift zu gewährleisten benötigt-Erkennung, diese Technik auch entsprechende Kontrollen von Zytoplasma Ernte zur Verstärkung Schritte. Obwohl hier beschriebenen Vorsichtsmaßnahmen strikt befolgt werden müssen, kann praktisch alle elektrophysiologischen Labor die Multiplex-einzelne Zelle RT-PCR-Technik verwenden.

Eine repräsentative Validierung der Multiplex-RT-PCR ist in Abbildung 3dargestellt. Das Protokoll wurde entwickelt, um gleichzeitig die Expression von 12 verschiedenen Genen Sonde. Die vesikuläre Glutamat Transporter vGluT1 wurde als Positivkontrolle für glutamatergen Neuronen42übernommen. Die GABA-Synthese von Enzymen (GAD65 und GAD-67), NEUROPEPTID Y (NPY) und Somatostatin (SOM) dienten als Marker der Gabaergen Interneuronen<sup clas...

Dieses Protokoll beschreibt die kritische Schritte und Vorsichtsmaßnahmen erforderlich, einzelne Zelle multiplex reversen Transkription Polymerase-Kettenreaktion nach Patch-Clamp durchzuführen. Diese Technik ist eine einfache und effektive Methode um das Expressionsprofil eines vorgegebenen Satzes Gene aus einer einzigen Zelle zeichnet sich durch Patch-Clamp-Aufnahmen zu analysieren.

Einzelne Zelle Multiplex reversen Transkription Polymerase-Kettenreaktion nach Patch-clamp

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der neurowissenschaftlichen Forschung zu beantworten, wie z. B. die Charakterisierung der Neuropopulation oder die Identifizierung von Quellen und Zielen von Übertragungssystemen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es ermöglicht, das Expressionsprofil eines vorselektierten Satzes von Genen aus einer einzelnen Zelle schnell und einfach zu bestimmen. Diese Methode kann also einen Einblick in die Random-Diversity-Maus geben.Es kann auch auf andere Zelltypen, wie z.B. Astrozyten und in vielen Tiermodellen angewendet werden. Diese Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Arrest- und Aspiring-Schritte schwer zu erlernen sein können, da die Daten eine Menge Zytoplasma benötigen, um analysiert zu werden. Bereiten Sie vor dem Schneiden ein Sezierset vor, das eine chirurgische Schere, eine feine Irisschere, zwei Spachtel, eine Pinzette, eine Scheibe Papierfilter und Cyanacrylatkleber enthält.Tränken Sie dann die eiskalte Schneidlösung mit Carbogyn und kühlen Sie die Schneidkammer auf minus 20 Grad Celsius ab. Entfernen Sie anschließend die Kopfhaut des Tieres und öffnen Sie den Schädel. En

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Optimierte Transfektion Strategie für Expression und elektrophysiologische Ableitung von rekombinantem Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T-Zellen

Neuronen sind zunächst geprägt elektrophysiologisch. Dann das Zytoplasma aus den aufgezeichneten Neuronen wird abgesaugt und einer Transkription-PCR-Analyse umzukehren, um die Expression von mRNAs für Neurotransmitter-Synthese-Enzyme, Ionenkanäle und Rezeptoren zu erkennen.

Profiling Voltage-gated Potassium Channel-mRNA Expression in nigralen Neuronen mit Einzel-Zell RT-PCR-Techniken

Einzel-Zell-Expression Profiling ermöglicht die detaillierte Genexpressionsanalyse einzelner Zellen. Wir beschreiben Methoden zur Isolierung von Kardiomyozyten, und die Vorbereitung der daraus resultierenden Lysate entweder für ganze Transkriptom-Mikroarray oder qPCR der spezifischen Ziele.

Single Cell Transcriptional Profiling der erwachsenen Maus Kardiomyozyten

Verfahren zur Isolierung von einzelnen Zellen der Netzhaut und anschließende Amplifikation der cDNA beschrieben. Einzelzell-Transcriptomics zeigt den Grad der zellulären Heterogenität in einem Gewebe und deckt neuen Markergene für seltene Zellpopulationen. Die beigefügten Protokoll kann eingestellt werden, um viele verschiedene Zelltypen zu entsprechen.

Einzel-Zell-Profiling der Entwicklung und Reife Netzhautneuronen

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik namens Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie, die eine Methode zur Untersuchung der elektrischen Eigenschaften von Mauthner-Neuronen und anderen retikulospinalen Zellen in Zebrafischembryonen ist.

Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie: Eine Methode zur Untersuchung der elektrischen Eigenschaften von Neuronen

Multi-Elektroden-Patch-Clamp-Aufnahmen bilden eine komplexe Aufgabe. Hier zeigen wir, wie durch die Automatisierung vieler Versuchsschritten ist es möglich, den Prozess zur qualitativen Verbesserung der Leistung und der Anzahl der Aufnahmen zu beschleunigen.

Eine EDV-gestützte Multi-Elektroden-Patch-Clamp-System

Beschrieben wird hier ein Verfahren zur Erlangung weite Strecken der aktuellen Aufnahme von einem Ionenkanal mit der Cell-Attached-Patch-Clamp-Technik. Diese Methode erlaubt die Beobachtung in Echtzeit, das Muster der Öffnungs-Schließ-Kanal-Konformationen, die die biologische Signal zugrunde liegen. Diese Daten informieren über Kanaleigenschaften in ungestörten biologischen Membranen.

Ein-Kanal-Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahme

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Expression einer großen Reihe von Genen auf der klonalen Ebene zu bewerten. Einzellige RT-qPCR produziert höchst zuverlässige Ergebnisse mit einer starken Empfindlichkeit für Hunderte von Proben und Gene.

Einzellige Gene Expression Mit Multiplex-RT-qPCR zum Charakterisieren Heterogene Rare Lymphatische Populations

Dieser Artikel beschreibt, wie die Ionenselektivität von Channelrhodopsin mit elektrophysiologischen Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen unter Verwendung von HEK293-Zellen bestimmt wird. Hier wird das experimentelle Verfahren zur Untersuchung der Chloridselektivität eines anionenselektiven Channelrhodopsins demonstriert. Das Verfahren ist jedoch auf andere Channelrhodopsine mit ausgeprägter Selektivität übertragbar.

Ganzzellige Patch-Clamp-Aufnahmen zur elektrophysiologischen Bestimmung der Ionenselektivität in Channelrhodopsinen

Hier präsentierten wir eine multiplexierte einzellige mRNA-Sequenzierungsmethode, um die Genexpression in embryonalen Geweben der Maus zu profilieren. Die tropfenbasierte einzelzellbasierte mRNA-Sequenzierung (scRNA-Seq) in Kombination mit Multiplexing-Strategien kann Einzelne Zellen aus mehreren Proben gleichzeitig profilieren, was die Reagenzkosten deutlich reduziert und experimentelle Chargeneffekte minimiert.

Multiplexed Single Cell mRNA Sequenzierungsanalyse von Mausembryonalzellen

Erfahren Sie die Einzelzell-Multiplex-RT-PCR nach Patch-Clamp zur Analyse von Genexpressionsprofilen in Neuronen. Diese Methode ermöglicht Forschern, zelluläre Funktionen in der Neurowissenschaft präzise zu untersuchen.

Einzelne Zelle Multiplex reversen Transkription Polymerase-Kettenreaktion nach Patch-clamp

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