RNA-Isolierung aus zellspezifische Subpopulationen Mit Laser-Mikrodissektion In Verbindung mit Rapid-Immunmarkierung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu demonstrieren, wie eine schnelle Immunmarkierung einer Maus-Gehirnzellpopulation, die durch Laser-Capture-Mikrodissektion oder LCM isoliert wurde, durchgeführt werden kann, während die RNA-Integrität der Proben erhalten bleibt. Dies wird erreicht, indem das präparierte Hirngewebe zunächst schnell eingefroren wird. Das Gehirn wird dann in dünne Schnitte auf RNA-freie Glasobjektträger geschnitten und mit einer schnellen Immunfärbung behandelt.

Schließlich wird die interessierende Zellpopulation mittels LCM isoliert. Letztendlich ermöglicht die schnelle Färbung mit anschließender Laser-Capture-Mikrodissektion die Identifizierung von Veränderungen in der Expression des interessierenden Gens in der experimentellen Zellprobe. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung besteht darin, dass bei unserer Technik die räumliche Auflösung beibehalten wird, was die Lösung der spezifischen ES-Zelle aus dem umgebenden Gewebe ermöglicht.

Im Allgemeinen werden Menschen, die neu in dieser Smith-Zelle sind, kreisen, da dieses Verfahren mehrere kritische Schritte umfasst, die ein schnelles Arbeiten erfordern, um die RNA-Integrität in den Proben zu erhalten. Um die Proben für die Sektion vorzubereiten, sezieren Sie die Gehirne von postnatalen Mäusen am ersten Tag in eiskaltem L 15 Medium innerhalb von zwei Minuten nach der Tötung. Als nächstes legen Sie die Gehirne in Einbettungsformen in der entsprechenden Ausrichtung für das Schneiden und füllen Sie die Formen mit gefrorenem Gewebe und Einbettmedien.

Frieren Sie die Proben dann sofort in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie innerhalb von 30 Sekunden nach dem Schockfrosten bei minus 80 Grad Celsius. Behandeln Sie nun membranbeschichtete Objektträger mit Oberflächen-RNA-Dekontamination, um alle Spuren von RNA zu entfernen. Spülen Sie sie in DEPC-Wasser ab und lassen Sie sie an der Luft trocknen, wenn die Objektträger trocken sind.

Stellen Sie die Temperatur der Kryostatkammer auf minus 20 Grad Celsius ein und überführen Sie die gefrorene Probe in den Kryostaten. Montieren Sie für jede Probe den gefrorenen Block auf die Probenklemme und schneiden Sie die Proben mit einer Dicke von 10 Mikrometern, wobei Sie die Schnitte auf den membranbeschichteten Objektträgern sammeln. Nachdem Sie die Schnitte mindestens 10 Minuten trocknen gelassen haben, verwenden Sie einen hydrophoben Barrierestift, um das Gewebe zu umgeben.

Legen Sie die Objektträger nach etwa 10 Sekunden für nicht länger als fünf Minuten bei minus 20 Grad Celsius in frisch zubereitete kalte Fixierlösung. Übertragen Sie nun die Objektträger in ein sauberes Tablett, das mit Oberflächen-RNA-Dekontaminationslösung vorbehandelt ist. Schütteln Sie die Objektträger zuerst einmal, um überschüssiges Fixiermittel zu entfernen, und waschen Sie sie mit sechs bis acht schnellen Dips. In D-E-P-C-P-B-S schnippen Sie die Objektträger.

Um das überschüssige D-E-P-C-P-B-S zu entfernen, geben Sie 200 Mikroliter der primären Antikörperlösung in jeden Abschnitt. Waschen Sie die Objektträger nach 10 Minuten bei Raumtemperatur mit drei schnellen Bädern in D-E-P-C-P-B-S und schnippen Sie sie einmal, um die überschüssige Waschlösung zu entfernen. Anschließend inkubieren Sie die Proben nach sechs Minuten in 200 Mikrolitern der Sekundärantikörperlösung bei Raumtemperatur.

Waschen Sie die Objektträger wie gerade gezeigt in D-E-P-C-P-B-S und inkubieren Sie sie vier Minuten lang in frisch zubereiteter BC-Lösung, mischen Sie nach einem weiteren schnellen D-E-P-C-P-B-S-Waschen 196 Mikroliter frisch zubereitetes DAB mit vier Mikrolitern RNA-Inhibitor. Kurz bevor Sie die Lösung in den Schnitt geben, lassen Sie das DAB ein bis zwei Minuten lang entstehen, gefolgt von A-D-E-P-C-P-B-S Waschen. Dehydrieren Sie dann die Abschnitte mit einigen Sekunden Inkubation in absolutem Ethanol und schnippen Sie die Objektträger trocken, um mit LCM fortzufahren.

Anschließend werden 50 Mikroliter Lysepuffer aus einem RNA-Extraktionskit in den Deckel des Sammelröhrchens gegeben. Legen Sie dann einen Objektträger mit der Probenseite zur Kappe unter das Mikroskop. Wählen Sie die beste Vergrößerung für die Probe und passen Sie den Fokus an, um die interessierenden Zellen zu sehen.

Definieren Sie dann den Schnittbereich und beginnen Sie mit dem Schneiden mit dem Laser. Durch das Sammeln des präparierten Materials im Sammelröhrchen werden die gesammelten Zellen 30 Minuten lang bei 42 Grad Celsius verschlossen. Während dieser Zeit wird eine RNA-Aufreinigungssäule aus dem RNA-Extraktionskit mit 250 Mikrolitern Konditionierungspuffer vorkonditioniert.

Laden Sie dann 50 Mikroliter Ethanol in die lysierten Zellen auf der Säule und zentrifugieren Sie die Säule zwei Minuten lang bei 16.000 g und Raumtemperatur, gefolgt von zwei Spülgängen mit Waschpuffer. Zum Schluss eluieren Sie die RNA in dem empfohlenen Mindestvolumen von 11 Mikrolitern RNA-freiem Wasser und halten Sie zwei Mikroliter beiseite, um die Qualität der RNA zu testen. Dieses schnelle Immunmarkierungsverfahren ermöglicht die Visualisierung von Zellen von Interesse unter Beibehaltung der experimentellen RNA-Integrität.

Je nach Experiment kann LCM wie nur demonstriert verwendet werden, um einzelne Zellen oder größere Regionen von Interesse zu isolieren. Degradierte RNA hat einen erheblichen Einfluss auf die Qualität der Downstream-Analyse. Jede Probe wird somit auf einem Mikrofluid-X-basierten Plattform-Bioanalysator weiterverarbeitet, um die Quantifizierung und Überprüfung der Integrität der isolierten RNA zu ermöglichen, wie gerade demonstriert.

Hier zum Beispiel typische Bioanalysator-Ergebnisse sowohl von verschlechterter als auch von guter Qualität. RNA-Proben werden gezeigt. In der Tat zeigen digitale Gel- und Elektropherogramme, wie wichtig es ist, in jeder Lösung einen Rase-Inhibitor zu verwenden, um die RNA zu schützen. Nach diesem Verfahren kann hochwertige RNA für nachgelagerte Anwendungen weiterverarbeitet werden, einschließlich RNA-Sequenzierungs-MICROARRAY oder Q-R-D-P-C-R, zum Beispiel wurde in diesen Diagrammen die durchschnittliche Anreicherung für TH und A A A DC-Genexpression in der mikropräparierten Probe relativ zu den Mittelhirnschnitten mit mehr als dem 170-fachen bestimmt.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass sehr schnell und mit RNA-freiem Material gearbeitet wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine bestimmte Zellpopulation aus jedem Gewebe isoliert