RNA-Isolierung aus zellspezifische Subpopulationen Mit Laser-Mikrodissektion In Verbindung mit Rapid-Immunmarkierung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zu demonstrieren, wie eine schnelle Immunfärbung einer Maushirnzellpopulation durchgeführt wird, die mittels Laser-Mikrodissektion (Laser Capture Microdissection, LCM) isoliert wurde, wobei die RNA-Integrität der Proben erhalten bleibt. Dies wird erreicht, indem das dissektierte Hirngewebe zunächst schnell eingefroren wird. Anschließend wird das Gehirn in dünne Schnitte geschnitten, die auf RNA-freien Glasobjektträgern aufgebracht und einer schnellen Immunfärbung unterzogen werden.

Schließlich wird die gewünschte Zellpopulation mittels LCM isoliert. Letztendlich ermöglicht die schnelle Färbung in Kombination mit der Laser-Mikrodissektion die Identifizierung von Veränderungen in der Expression des Zielgens in der experimentellen Zellprobe. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung besteht darin, dass mit unserer Methode die räumliche Auflösung erhalten bleibt, wodurch die gezielte Isolierung von ES-Zellen aus dem umgebenden Gewebe möglich ist.

Im Allgemeinen drehen sich Personen, die neu in dieser Smith-Zelle sind, im Kreis, da dieses Verfahren mehrere kritische Schritte umfasst, bei denen schnell gearbeitet werden muss, um die RNA-Integrität in den Proben zu bewahren. Um die Proben für das Schneiden vorzubereiten, dissezieren Sie die Gehirne von ein Tage alten postnatalen Mäusen innerhalb von zwei Minuten nach der Tötung in eiskaltem L 15 Medium. Anschließend bringen Sie die Gehirne in die Einbettformen in der geeigneten Orientierung für das Schneiden ein und füllen die Formen mit gefrorenem Gewebe-Einbettmedium.

Dann frieren Sie die Proben unverzüglich in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie innerhalb von 30 Sekunden nach dem Schnellschocken bei minus 80 Grad Celsius. Behandeln Sie nun membranbeschichtete Objektträger mit einer Oberflächen-RNA-Deskontamination, um geringste Restmengen von RNA zu entfernen. Spülen Sie sie mit DEPC-Wasser ab und lassen Sie sie trocknen, sobald die Objektträger trocken sind.

Stellen Sie die Kammertemperatur des Kryostaten auf minus 20 Grad Celsius ein und überführen Sie die gefrorene Probe in den Kryostaten. Befestigen Sie für jede Probe den gefrorenen Block in der Probenspannbacke und schneiden Sie die Proben mit einer Dicke von 10 Mikrometer, wobei die Schnitte auf membranbeschichtete Objektträger aufgefangen werden. Nachdem die Schnitte mindestens 10 Minuten lang getrocknet wurden, umranden Sie das Gewebe mit einem hydrophoben Barrierestift.

Nach etwa 10 Sekunden die Objektträger für nicht mehr als fünf Minuten bei minus 20 Grad Celsius in frisch zubereitete, kalte Fixierungslösung geben. Danach die Objektträger in ein sauberes, mit Oberflächen-RNA-Entkontaminierungslösung vorbehandeltes Tablett überführen. Zunächst die Objektträger einmal schütteln, um überschüssige Fixierungslösung zu entfernen, und sie mit sechs bis acht kurzen Eintauchungen in D-E-P-C-P-B-S spülen, wobei man die Objektträger abschüttelt.

Um das überschüssige D-E-P-C-P-B-S zu entfernen, geben Sie 200 Mikroliter der primären Antikörperlösung zu jedem Schnitt. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur waschen Sie die Objektträger mit drei kurzen Eintauchvorgängen in D-E-P-C-P-B-S und schütteln sie einmal, um die überschüssige Waschlösung zu entfernen. Anschließend inkubieren Sie die Proben in 200 Mikrolitern der sekundären Antikörperlösung bei Raumtemperatur nach sechs Minuten.

Spülen Sie die Objektträger wie gerade gezeigt in D-E-P-C-P-B-S und inkubieren Sie sie nach einem weiteren kurzen D-E-P-C-P-B-S-Waschschritt vier Minuten lang in einer frisch zubereiteten BC-Lösung. Mischen Sie 196 Mikroliter frisch zubereitetes DAB mit vier Mikrolitern RNA-Inhibitor. Kurz vor dem Auftragen der Lösung auf den Schnitt lassen Sie das DAB eine bis zwei Minuten entwickeln, gefolgt von einem A-D-E-P-C-P-B-S-Waschschritt. Anschließend dehydrieren Sie die Schnitte durch kurzzeitige Inkubation in absolutem Ethanol und schütteln Sie die Objektträger trocken, um mit der LCM fortzufahren.

Fügen Sie als Nächstes 50 Mikroliter Lysepuffer aus einem RNA-Extraktionskit in die Sammelgefäßkappe ein. Platzieren Sie dann einen Objektträger unter dem Mikroskop, wobei die Probenseite der Kappe zugewandt ist. Wählen Sie die geeignete Vergrößerung für die Probe und stellen Sie den Fokus so ein, dass die gewünschten Zellen sichtbar sind.

Definieren Sie dann den Schneidbereich und beginnen Sie mit dem Laserschnitt. Sammeln Sie das dissezierte Material in der Sammelgefäßkappe und inkubieren Sie die gesammelten Zellen 30 Minuten bei 42 Grad Celsius. In dieser Zeit konditionieren Sie eine RNA-Reinigungssäule aus dem RNA-Extraktionskit mit 250 Mikrolitern Konditionierungspuffer vor.

Geben Sie dann 50 Mikroliter Ethanol auf die lysierten Zellen auf der Säule und zentrifugieren Sie die Säule zwei Minuten bei 16.000 × g und Raumtemperatur, gefolgt von zwei Waschungen mit Waschpuffer. Schließlich eluieren Sie die RNA in dem minimal empfohlenen Volumen von 11 Mikrolitern RNA-freiem Wasser, wobei zwei Mikroliter beiseitegestellt werden, um die Qualität der RNA zu überprüfen. Dieses schnelle Immunmarkierungsverfahren ermöglicht die Visualisierung der Zellen von Interesse, während die Integrität der experimentellen RNA erhalten bleibt.

Abhängig vom Experiment kann die LCM wie gerade gezeigt verwendet werden, um einzelne Zellen oder größere Regionen von Interesse zu isolieren. Degradierte RNA hat einen erheblichen Einfluss auf die Qualität der nachgeschalteten Analyse. Jede Probe wird daher weiter auf einer mikrofluidischen X-basierten Plattform-Bioanalyzer verarbeitet, um die Quantifizierung und Überprüfung der Integrität der isolierten RNA wie gerade gezeigt zu ermöglichen.

Beispielsweise sind hier typische Bioanalyzer-Ergebnisse sowohl degradierter als auch hochwertiger RNA-Proben dargestellt. Tatsächlich zeigen digitales Gel und Elektropherogramme die Bedeutung der Verwendung eines Rase-Inhibitors in jeder Lösung zum Schutz der RNA auf. Nach diesem Verfahren kann hochwertige RNA für nachgeschaltete Anwendungen weiterverarbeitet werden, einschließlich RNA-Sequenzierung, MICROARRAY oder Q-R-D-P-C-R. Beispielsweise wurde in diesen Graphen die durchschnittliche Anreicherung der TH- und AADC-Genexpression in der mikrodissekierten Probe im Vergleich zu Mittelhirnschnitten auf über 170-fach bestimmt.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, sehr schnell und mit RNA-freiem Material zu arbeiten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine spezifische Zellpopulation aus einem beliebigen Gewebe isoliert.