Name: RNA-Isolierung aus zellspezifische Subpopulationen Mit Laser-Mikrodissektion In Verbindung mit Rapid-Immunmarkierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Lernen Sie die RNA-Isolierung aus zellspezifischen Subpopulationen im Mäusehirn durch Laser-Mikrodissektion mit schneller Immunmarkierung. Diese Methode erhält die RNA-Integrität für Genexpressionsanalysen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Diese Arbeit wird durch einen Zuschuss des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: 418391-2012) unterstützt. AC erhält ein Stipendium des Centre thématique de recherche en Neurosciences (CTRN). HDB wird durch ein Stipendium des Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) finanziert und ML ist ein FRSQ Chercheur-Boursier.

HINWEIS: Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den kanadischen Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und wurden von der Université Laval Tierschutzkommission genehmigt. 1. Probenvorbereitung HINWEIS: In diesem Beispiel haben wir Mäusegehirnen bei postnatalen Tag 1. <ol><li> Verwenden Hypothermie Anästhesie in zerstoßenem Eis für 3 bis 4 Minuten für Welpen, dann zerlegen Gehirn so schnell wie möglich in eiskaltem L15 Medium. Führen Sie diesen Schritt innerhalb von 2 min. </li><li> Über seziert Gehirn in das Einbetten (Liste von Gütern vgl.) Form und füllen mit gefrorenen Gewebeeinbettungsmedien darauf achten, dass die Probe in der gewünschten Position zu orientieren. Frieren Proben sofort in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C. Führen Sie diesen Schritt innerhalb von 30 Sekunden. HINWEIS: Die Proben können einige Monate gelagert werden, ohne die RNA-Qualität. </li></ol> 2. Schnitte <ol><li> Treat Membran coated Glasobjektträger (vgl. Liste der Material) mit Oberflächen RNAse Dekontaminationslösung, um jede Spur von RNAsen zu beseitigen. Waschen Sie die Folien in DEPC-Wasser und trocknen lassen. Alternativ backen Plättchen über Nacht bei 200 ° C. </li><li> Übertragen Sie eingefrorenen Proben in einem Kryostaten zuvor mit einer Oberfläche RNAse Dekontaminationslösung gereinigt. Stellen Kryostatkammer Temperatur bei -20 ° C und in Scheiben schneiden Proben bei 10 &amp; mgr; m Dicke. Sammeln Gewebeschnitte auf die Membran beschichteten Objektträgern und trocknen lassen 10 Minuten vor der Färbung. Alternativ gleitet bei -80 ° C bis zur Färbung. </li></ol> 3. Herstellung von Färbelösungen <ol><li> Bereiten alle Lösungen unmittelbar vor dem Beginn des Experiments, und mit RNAse Inhibitor in allen Färbelösungen (außer Waschlösungen), um RNA-Abbau zu verhindern. </li><li> Bereiten Sie die Pufferlösung. Verwenden des gleichen Puffers in allen Lösungen (RNase-freies Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS besteht) von 1% BSA ergänzt war,0,2% Triton und 2% RNAse-Inhibitor). Für jede Folie, bereiten 400 ul Pufferlösung (200 ul für den primären und 200 ul für die Sekundärantikörper). </li><li> Bereiten Sie die Fixierungslösung: Verwenden Sie 70% Ethanol aufbewahrt bei -20 ° C. Halten der Gewebefixierung Verfahren minimal um eine drastische Verringerung der RNA Extraktionsausbeute zu vermeiden. HINWEIS: Alternativ können 95% Ethanol-Lösung von 5% Essigsäure ergänzt war, bei 20 ° C gehalten. </li><li> Bereiten Sie die primäre Antikörperlösung durch Verdünnen des primären Antikörpers in der Pufferlösung. Für dopaminergen Neuronen Kennzeichnung, verwenden Sie ein Antikörper, der auf die Tyrosin-Hydroxylase (TH, geschwindigkeitsbestimmende Enzym für Dopamin-Produktion). Mit einer hohen Konzentration des Antikörpers, um für die schnelle Inkubationszeit kompensieren. Verwenden TH-Antikörper in einer Verdünnung von 1:25. HINWEIS: Im normalen Immunfluoreszenz-Protokoll, diese Antikörper gibt ein starkes Signal, wenn über Nacht bei einer Verdünnung von 1: 1000. In diesem Protokoll wird es verwendet, 40x Konzentrataufgrund der kurzen Inkubationszeit ed. Aufgrund der hohen Konzentration des Antikörpers für dieses Verfahren verwendet, führen Sie eine Standard-Immunfärbung parallel, um jede Zunahme der nicht-spezifische Markierung überprüfen. </li><li> Vorbereiten des sekundären Antikörperlösung durch Verdünnung des sekundären Antikörpers in der Pufferlösung. Verwenden eines biotinylierten sekundären Antikörpers in einer Konzentration von 1: 100. HINWEIS: In diesem Beispiel wurde ein Anti-Kaninchen-Antikörper biotinyliert. </li><li> Vorbereiten des Avidin-Biotin-Komplex (ABC) Lösung zum Nachweis von biotinylierten sekundären Antikörper. Make ABC-Lösung durch Zugabe der Verbindung A und der Verbindung B in einer Konzentration von 1: 100 in DEPC PBS verdünnt, ergänzt mit 2% RNAse Inhibitor. Bereiten Sie die Avidin-Biotin-Komplex 30 Minuten, bevor Sie den Folien. </li></ol> 4. Die Färbung <ol><li> Tauen Sie ein oder zwei Folien zu der Zeit von -80 ° C nach schneller schnippte sie in der Luft (oder ein Luftgebläse). Surround Abschnitten mit einer hydrophobenBarriere Stift und lassen Sie für ein paar Sekunden trocknen. <ol><li> Die Objektträger in der kalten Fixierungslösung für nicht mehr als 5 min bei -20 ° C. Einmal schütteln, in der Luft, um mehr als Fixierungslösung anschließend in DEPC PBS 6-8 mal zum Waschen entfernen, schnell die Objektträger. </li><li> Streichen Sie die Folien, um überschüssige DEPC PBS zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass die Schieber Auftauen Schritt ist 5 Minuten nicht überschreiten. </li></ol></li><li> Objektträger auf eine saubere Schale (mit einer Oberfläche RNAse Dekontaminationslösung vorbehandelt, um jede Spur von RNAsen beseitigen) und setzte 200 ul des primären Antikörperlösung auf jeder Folie (Kaninchen-Anti-TH) für 10 min bei Raumtemperatur. Dip gleitet schnell in DEPC PBS 3 mal zum Waschen und Flick die Folien einmal, um den Überschuss an DEPC PBS zu entfernen. </li><li> Setzen 200 ul des sekundären Antikörperlösung auf jedem Objektträger 6 Minuten lang bei Raumtemperatur. Dip gleitet schnell 3 mal in DEPC PBS zum Waschen und Flick die Folien, um das überschüssige DEPC PBS zu entfernen. </li><li> Setzen Sie 200 ul der ABC Lösungention auf jedem Objektträger für 4 min bei Raumtemperatur. Dip gleitet schnell in DEPC PBS 3 mal für das Waschen und die Folien blättern, um das überschüssige DEPC PBS zu entfernen. </li><li> Bereiten Sie die DAB (3,3 &#39;Diaminobenzidin) Lösung während der 4 min Inkubation in der ABC-Lösung. Verwenden Sie die Reagenzien im Kit (DAB Peroxidasesubstrat Kit) zur Verfügung gestellt. Mix 1 Tropfen vorgesehen Puffer, 1 Tropfen DAB-Lösung und 1 Tropfen 30% H 2 O 2 in 2,5 ml DEPC-Wasser. Mischen Sie die Lösung durch Umdrehen. </li><li> Nehmen Sie 196 ul der DAB-Lösung und fügen Sie 4 ul (2%) von RNAse Inhibitor-Lösung kurz vor Aufbringen auf Objektträger. Die Objektträger auf einer sauberen Schale (mit einer Fläche RNAse Dekontaminationslösung vorbehandelt) und legte die 200 ul der DAB-Lösung auf den Objektträgern. HINWEIS: DAB-Lösung sollte within1 oder 2 min reagieren. </li><li> Dip gleitet schnell in DEPC PBS 3 mal zum Waschen und legte Folien für einige Sekunden in absolutem Ethanol. Trocknen Sie die Folien durch flicking sie in der Luft (oder ein Luftgebläse). &lt;br /&gt; Hinweis: Folien können bei -80 ° C für eine spätere Verwendung gelagert oder für LCM verarbeitet werden. </li></ol> 5. Laser Capture Mikrodissektion <ol><li> Tauen Sie gleitet schnell durch flicking sie in der Luft (oder ein Luftgebläse). Stellen Sie sicher, dass die Schieber Auftauen Schritt ist 5 Minuten nicht überschreiten. </li><li> Fahren Sie mit LCM. Den Objektträger unter dem Mikroskop mit Blick auf das Sammelrohr Kappe der Probenseite. Wählen die beste Vergrößerung für die Probe. Stellen Sie den Fokus, um die Zellen von Interesse zu sehen. <ol><li> Legen Sie den Schnittbereich und fang an zu schneiden mit dem Laser. Sammeln seziert Zellen oder Gewebestück in der Sammelrohrkappe mit 50 ul Lysepuffer (von RNA-Extraktions-Kits) gefüllt. Sicherzustellen, dass der Schritt des LCM ist 30 min nicht übersteigt. </li></ol></li><li> Auszug Gesamt-RNA aus Zellen isoliert unter Verwendung einer RNA-Extraktions-Kits (vgl. Liste der Materialien). Folgen Sie dem Protokoll des Herstellers. <ol><li> Inkubieren gesammelten Zellen für 30 min bei 42 ° C zuLyse der Zellen. Voraussetzung der RNA Reinigungskolonne durch Zugabe von 250 ul der Konditionierungspuffer. Last 50 ul Ethanol zu lysierten Zellen. Laden Sie die 100 ul der lysierten Zellen auf eine vorkonditionierte Reinigungssäule. </li><li> Zentrifugieren Sie die Spalte bei 16.000 g für 2 Minuten bei Raumtemperatur. Zweimal Die Säule wird mit Waschpuffer. Eluieren in der minimal empfohlenen Volumen (11 ul) von RNase-freies Wasser (nicht behandelt DEPC wie es mit dem Bioanalyzer stören). Halten Sie 2 ul Testqualität. HINWEIS: Alle Lösungen und Reagenzien sind im Kit enthalten. </li></ol></li></ol> 6. cDNA Synthese und Quantitative RT-PCR <ol><li> Reverse Transkription und RNA-Proben aus dem Laser eingefangen dopaminergen Zellen in komplementäre DNA mittels reverser Transkriptase und Oligo (dT). Folgen Sie dem Protokoll des Herstellers (vgl. Liste von Material). </li><li> Verwenden 1 ul cDNA für qRT-PCR-Amplifikation mit genspezifischen Primern. Richten PCR reactions in 20 ul Volumen mit einer einkomponentigen Heißstartreaktionsmischung für quantitative PCR, wie vom Hersteller empfohlen. Führen Sie jede Reaktion in dreifacher Ausfertigung. <ol><li> Für die hier beschriebenen Experimente, die folgenden Primerpaare: GAPDH-F (5&#39;-CCA CCC AGA AGA CTG TGG AT-3 &#39;) / GAPDH-R (5&#39;-GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT-3&#39;); Rpl13a-F (5&#39;-ACA GCC ACT CTG GAG GAG AA-3 &#39;) / Rpl13a-R (5&#39;-CTG CCT GTT TCC GTA ACC TC-3&#39;); Th-F (5&#39;-CAG TGG AGG ATG TGT CTC -3 &#39;) / Th-R (5&#39;-GAA AAT GGG CAG ACA CAC G-3&#39;); AADC-F (5&#39;-CAT AGC GAG TTC TGC CCT TC-3 &#39;) / AADC-R (5&#39;-GGA TGT GGT CCC TGT CAG AG-3&#39;). </li></ol></li><li> Führen quantitative RT-PCR-Amplifikation unter Verwendung der folgenden Rapid Cycling-Parameter: 95 ° C für 5 min, gefolgt von 45 Zyklen von 10 sec 95 ° C, 10 sec bei 60 ° C und 10 sec bei 72 ° C. Führen Schmelzkurvenanalyse mit dem Standard-Einstellung des Instruments auf Bestimne homogene Produktbildung. </li><li> Analysieren Sie die Daten mit Hilfe der integrierten Software. <ol><li> Normalisierung der Expressionswerte DA Marker Gene Th und AADC mit der Expression der beiden Referenzgenen GAPDH und Rpl13a um relative Expressionsniveaus zu erhalten, wie zuvor beschrieben 14. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Chung, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+orthodenticle+homeobox+2+influences+axonal+projections+and+vulnerability+of+midbrain+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+%3A+a+journal+of+neurology%22%5BJournal%5D)">The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons.</a> Brain : a journal of neurology. 133 (Pt 7), 2022-2031 (2010).</li>
<li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+microdissection+in+translational+research%3A+theory%2C+technical+considerations%2C+and+future+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+immunohistochemistry+%26+molecular+morphology+%3A+AIMM+%2F+official+publication+of+the+Society+for+Applied+Immunohistochemistry%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications.</a> Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 21 (1), 31-47 (2013).</li>
<li>Decarlo, K., Emley, A., Dadzie, O. E., Mahalingam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%3A+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection: methods and applications.</a> Methods in molecular biology. 755, 1-15 (2011).</li>
<li>Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+review+of+molecular+diagnostics%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection technology.</a> Expert review of molecular diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).</li>
<li>Fend, F., Raffeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+in+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+pathology%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection in pathology.</a> Journal of clinical pathology. 53 (9), 666-672 (2000).</li>
<li>Chadi, G., Maximino, J. R., de Oliveira, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+molecular+histology+to+study+glial+influence+on+neurodegenerative+disorders.+Focus+on+recent+developed+single+cell+laser+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+histology%22%5BJournal%5D)">The importance of molecular histology to study glial influence on neurodegenerative disorders. Focus on recent developed single cell laser microdissection.</a> Journal of molecular histology. 40 (4), 241-250 (2009).</li>
<li>Liu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+in+the+tissue+biorepository%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomolecular+techniques+%3A+JBT%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection in the tissue biorepository.</a> Journal of biomolecular techniques : JBT. 21 (3), 120-125 (2010).</li>
<li>Baskin, D. G., Bastian, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-laser+capture+microdissection+of+rat+brain+neurons+for+real+time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Immuno-laser capture microdissection of rat brain neurons for real time quantitative PCR.</a> Methods in molecular biology. 588, 219-230 (2010).</li>
<li>Brown, A. L., Smith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+RNA+preservation+for+immunolabeling+and+laser+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Improved RNA preservation for immunolabeling and laser microdissection.</a> RNA. 15 (12), 2364-2374 (2009).</li>
<li>Brown, A. L., Brown, A. L., Day, T. A., Dayas, C. V., Smith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purity+and+enrichment+of+laser-microdissected+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+research+international%22%5BJournal%5D)">Purity and enrichment of laser-microdissected midbrain dopamine neurons.</a> BioMed research international. 2013, 747938(2013).</li>
<li>Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IF-LCM%3A+laser+capture+microdissection+of+immunofluorescently+defined+cells+for+mRNA+analysis+rapid+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+international%22%5BJournal%5D)">IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication.</a> Kidney international. 58 (3), 1346-1353 (2000).</li>
<li>Greene, J. G., Dingledine, R., Greenamyre, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+rat+midbrain+dopamine+neurons%3A+implications+for+selective+vulnerability+in+parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+disease%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of rat midbrain dopamine neurons: implications for selective vulnerability in parkinsonism.</a> Neurobiology of disease. 18 (1), 19-31 (2005).</li>
<li>Chung, C. Y., Koprich, J. B., Endo, S., Isacson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Endogenous+Serine%2FThreonine+Protein+Phosphatase+Inhibitor%2C+G-Substrate%2C+Reduces+Vulnerability+in+Models+of+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An Endogenous Serine/Threonine Protein Phosphatase Inhibitor, G-Substrate, Reduces Vulnerability in Models of Parkinson's Disease.</a> Journal of Neuroscience. 27 (31), 8314-8323 (2007).</li>
<li>Pfaffl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+3%2C+Quantification+strategies+in+real-time%5BTitle%5D)+AND+%22AZ+of+quantitative+PCR%22%5BJournal%5D)">Chapter 3, Quantification strategies in real-time.</a> AZ of quantitative PCR. , International University Line (IUL). La Jolla, CA. (2004).</li>
<li>Smolinski, D., Blessenohl, M., Neubauer, C., Kalies, K., Gebert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+novel+ultra-short+immunolabeling+method+for+high-quality+mRNA+preservation+in+laser+microdissection+and+real-time+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+MolecularDiagnostics%22%5BJournal%5D)">Validation of a novel ultra-short immunolabeling method for high-quality mRNA preservation in laser microdissection and real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction).</a> The Journal of MolecularDiagnostics. 8 (2), 246-253 (2006).</li>
<li>Podgornyĭ, O. V., Lazarev, V. N., Govorun, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microdissection+for+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Tsitologiia%22%5BJournal%5D)">Laser microdissection for biology and medicine.</a> Tsitologiia. 54 (5), 381-389 (2012).</li>
<li>Vandewoestyne, M., ewoestyne & Deforce, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+in+forensic+research%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+legal+medicine%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection in forensic research: a review.</a> International journal of legal medicine. 124 (6), 513-521 (2010).</li>
<li>Shapiro, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+proteomic+workflow+for+characterization+of+frozen+clinical+biopsies%3A+laser+capture+microdissection+coupled+with+label-free+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of%22%5BJournal%5D)">A quantitative proteomic workflow for characterization of frozen clinical biopsies: laser capture microdissection coupled with label-free mass spectrometry.</a> Journal of. 77, 433-4340 (2012).</li>
<li>Domazet, B., Maclennan, G. T., Lopez-Beltran, A., Montironi, R., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+in+the+genomic+and+proteomic+era%3A+targeting+the+genetic+basis+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+clinical+and+experimental+pathology%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection in the genomic and proteomic era: targeting the genetic basis of cancer.</a> International journal of clinical and experimental pathology. 1 (6), 475-488 (2008).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Der kritischste Punkt dieses Verfahrens besteht darin, die Markierung von Zellen von Interesse, während verhindert RNA-Abbau. Wie RNAsen in wässrigen Lösungen aktiv sind, abnehm Inkubationszeiten verbessert RNA Erhaltung 11,15. Alle verwendeten Lösungen müssen mit DEPC, um RNasen zu inaktivieren behandelt werden. Alle Materialien und Oberflächen benötigen, um mit einer Oberfläche RNAse Dekontaminationslösung zu RNAsen Kontamination zu verhindern behandelt werden. Schließlich wird in diesen Bedingungen ist der...

Das Gehirn ist von einer großen Vielfalt von verschiedenen Neuronentypen Bilden komplexer Netzwerke zusammen. Diese Neuronen sind in verschiedene Gruppen und Untergruppen nach ihrer Morphologie, Konnektivität und Genexpressionsmuster 1 organisiert. Die Entwicklung von Mikroarrays, der nächsten Generation Sequenzierung und qRT-PCR bot die Möglichkeit, Genexpressionsprofile von neuronaler Populationen in verschiedenen biologischen Kontexten 1,2 zu vergleichen. Diese empfindlichen Analysen erfordern die präzise Identifizierung und Isolierung von Zelltypen von Interesse während RNA Integrität 2-4. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) Technik wurde allgemein verwendet, um spezifische Zelltypen, basierend auf Zelloberflächen-Marker und / oder Morphologie zu isolieren. FACS benötigt eine Zellabtrennungsschritt vor der Sortierung, die in einem vollständigen Verlust der räumlichen Auflösung 5 führt. Viele neuronalen Subpopulationen voneinander unterschieden entsprechend ihrer anatomischen Verteilung in the Gehirn. Laser Mikrodissektion auf dünnen Gehirnschnitte angewendet bietet eine geeignete Option für spezifische Isolierung von Zellen mit hoher räumlicher Auflösung 6-8. Eine Hauptbeschränkung von LCM wurde die Notwendigkeit, Zellen von Interesse, basierend auf morphologischen Kriterien oder fluoreszierenden Reporterproteine ​​genetisch in Tiermodellen entwickelt identifizieren. Die Entwicklung neuer Techniken, um schnell Immunomarkierung Methoden, die RNA-Integrität bewahrt, in Kombination mit LCM durchzuführen, erlaubt nun die Isolierung von Zellpopulationen mit Gen-Profiling-Experimente fort. Dieser Ansatz wurde bereits durchgeführt wurden und kurz in einigen Publikationen 1,9-13 beschrieben. Hier zeigen wir ein detailliertes Verfahren zu hochwertigen RNA von einer bestimmten Untergruppe von Zellen in einer komplexen Gewebestruktur durch Kombinieren schnellen Immunmarkierung mit LCM erhalten. Wir zeigen, wie die wichtigsten kritischen Schritte durchführen, um eine maximale RNA-Gewinnung zu erhalten und zu vermeiden RNA-Abbau wie es siglich Auswirkungen Genexpressionsanalysen. Zur Demonstration dieses Protokoll wurden dopaminergen Neuronen von einem Tag alten Maushirn abgezielt. Dopaminergen Neuronen kann mit Hilfe eines gegen Tyrosinhydroxylase (TH) gerichteten Antikörpers, des geschwindigkeitsbestimmenden Enzyms für Dopaminsynthese immunolabeled werden. Nach TH Immunfärbung können einzelne oder Gruppen von dopaminergen Neuronen dann mit LCM isoliert werden. Mikrodissezierten Zellen werden in Lysepuffer gesammelt und RNA wird mit Hilfe eines RNA-Extraktions-Kit extrahiert. Qualität und Quantität der RNA extrahiert werden mit einem Bioanalyzer 5 gemessen. Die weitere Analyse der Genexpression mit: RNA-Sequenzierung, Microarray oder qRT-PCR kann anschließend durchgeführt 2,4,6 werden. Als ein Beispiel wird ein zweistufiger qRT-PCR von den Laser erfassten isolierten dopaminergen Domänen gezeigt. Die relative Quantifizierung der Expressionsniveaus von zwei dopaminergen Neurons Markergene zeigt die Selektivität dieses Protokolls.

<table><tbody><tr><td>Membranbeschichtete Objektträger&nbsp;</td><td>Leica Biosystems</td><td>11505158</td><td>MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 &micro; m; 50 Stück</td></tr><tr><td>Oberflächen-RNAse-Dekontaminationslösung</td><td>Life Technologies</td><td>AM9780</td><td>RNaseZap</td></tr><tr><td>Fixativ</td><td></td><td></td><td>70% Ethanol bei -20 & Grad gehalten; C</td></tr><tr><td>Anti-TH&nbsp;</td><td>Pel-Freez</td><td>P40101</td><td>&nbsp; 1:25</td></tr><tr><td>RNAse freier Puffer</td><td></td><td></td><td>DEPC PBS + 1% BSA+0,02% Triton</td></tr><tr><td>RNAse Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2615</td><td>Rnasin Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (Lager)</td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen biotinyliert</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC Kit Standard</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100 8</td><td>&micro; l/ml</td></tr><tr><td>DAB-Peroxidase-Substrat-Kit&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>RNA-Isolationskit</td><td>Life Technologies</td><td>KIT0204</td><td>Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit</td></tr><tr><td>H2O2 30%</td><td>Sigma</td><td>HC4060</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolutes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser-Mikrodissektionssystem</td><td>Leica microsystems</td><td></td><td>Modell AS-LMD</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22753-14</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalysator</td><td>Agilent</td><td></td><td>Agilent 2100 Bioanalysator</td></tr><tr><td>Einbettung von Form&nbsp;</td><td>Leica Biosystems</td><td>14702218311</td><td>6 x 8 mm</td></tr><tr><td>Hydrophober Barrierestift</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Einbettungsmedium für gefrorenes Gewebe</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer-Chip</td><td>Aligent Technologies</td><td>5067-1513</td><td>RNA 6000 Pico LabChip zur Verwendung mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer</td></tr><tr><td>Heißstart-Reaktionsmischung für quantitative PCR</td><td>Roche</td><td>6402712001</td><td>Fast Start Essential DNA Green Master</td></tr><tr><td>Reverse Transkriptase</td><td>Leben technologies</td><td>11752-050</td><td>SuperScript III Erststrangsynthese SuperMix für qRT-PCR</td></tr></tbody></table>

rna-isolierung aus zellspezifische subpopulationen mit laser-mikrodissektion in verbindung mit rapid-immunmarkierung

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) ermöglicht die Isolierung von spezifischen Zellen von Gewebedünnschnitten mit hoher räumlicher Auflösung. Effektive LCM erfordert eine genaue Identifizierung von Zellen-Subpopulationen aus einer heterogenen Gewebe. Identifizierung von Zellen von Interesse hinsichtlich LCM wird normalerweise auf morphologischen Kriterien oder fluoreszierendes Protein Reporter basiert. Die Kombination von LCM und schnelle Immunomarkierung bietet eine Alternative und effizientes Mittel, um spezifische Zelltypen zu visualisieren und um sie vom umgebenden Gewebe zu isolieren. Hochwertige RNA kann dann von einer reinen Zellpopulation extrahiert werden und für nachgelagerte Anwendungen, einschließlich RNA-Sequenzierung, Microarray oder qRT-PCR weiterverarbeitet werden. Dieser Ansatz wurde bereits durchgeführt wurden und kurz in einigen Veröffentlichungen beschrieben. Das Ziel dieses Artikels ist es zu zeigen, wie eine schnelle Immunmarkierung einer Zellpopulation durchzuführen und dabei RNA Integrität, und wie man diese spezifischen Zellen mit LCM isolieren. Hierin zeigen wird dieses mehrstufigen Verfahrens durch Immunmarkierung und die Erfassung dopaminergen Zellen im Hirngewebe von einem Tage alten Mäusen. Wir heben Taste kritischen Schritte, die besondere Beachtung verdienen. Dieses Protokoll kann auf eine Vielzahl von Geweben und Zellen von Interesse angepasst werden. Forscher aus verschiedenen Bereichen wird wahrscheinlich von der Demonstration dieses Ansatzes profitieren.

Diese schnelle Immunomarkierung Verfahren ermöglicht die Visualisierung von Zellen von Interesse während RNA Integrität. 1 veranschaulicht die Schritte der Gewebeaufbereitung vor RNA-Extraktion. Nach Kryoschneiden werden dopaminergen Neuronen mit einem gegen die Tyrosin-Hydroxylase gerichteten Antikörper (markierten Neuronen in braun angezeigt) gekennzeichnet. Je nach der experimentellen Frage, können einzelne Zellen oder größere Region von Interesse mit LCM isoliert werden (1D - <stron...

Genexpressionsanalyse einer Untergruppe von Zellen in einem spezifischen Gewebe stellt eine große Herausforderung. Dieser Artikel beschreibt, wie man qualitativ hochwertige Gesamt-RNA aus einer bestimmten Zellpopulation durch die Kombination einer schnellen Immunomarkierung Verfahren mit Laser Mikrodissektion zu isolieren.

RNA-Isolierung aus zellspezifische Subpopulationen Mit Laser-Mikrodissektion In Verbindung mit Rapid-Immunmarkierung

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zu demonstrieren, wie eine schnelle Immunfärbung einer Maushirnzellpopulation durchgeführt wird, die mittels Laser-Mikrodissektion (Laser Capture Microdissection, LCM) isoliert wurde, wobei die RNA-Integrität der Proben erhalten bleibt. Dies wird erreicht, indem das dissektierte Hirngewebe zunächst schnell eingefroren wird. Anschließend wird das Gehirn in dünne Schnitte geschnitten, die auf RNA-freien Glasobjektträgern aufgebracht und einer schnellen Immunfärbung unterzogen werden.Schließlich wird die gewünschte Zellpopulation mittels LCM isoliert. Letztendlich ermöglicht die schnelle Färbung in Kombination mit der Laser-Mikrodissektion die Identifizierung von Veränderungen in der Expression des Zielgens in der experimentellen Zellprobe. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung besteht darin, dass mit unserer Methode die räumliche Auflösung erhalten bleibt, wodurch die gezielte Isolierung von ES-Zellen aus dem umgebenden Gewebe möglich ist.Im Allgemeinen drehen sich Personen, die neu in dieser Smith-Zelle sind, im Kreis, da dieses Verfahren mehrere kritische S

rna-isolation-from-cell-specific-subpopulations-using-laser-capture

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Laser Capture Mikrodissektion von Säugetiergewebe

In diesem Video-Artikel präsentieren wir eine Methode zur Isolierung von einzelnen oder...

Laser Capture Mikrodissektion von Drosophila Peripheren Neuronen

Dieses Video beschreibt die Technik zur Gewinnung einer einzelnen Zelle aus einer heterogenen Zellpopulation mittels Laser-Capture-Mikrodissektion. Die einzelne isolierte Zelle kann für weitere genomische Studien oder die Krebsforschung verwendet werden.

Einzelzellprobenahme mittels Laser-Capture-Mikrodissektion: Eine Technik zur Gewinnung von Zielzellen aus einer heterogenen Zellpopulation

Wir beschreiben, wie der Laser-Mikrodissektion (LCM) verwenden, um angereichert Populationen von Neuronen im Hippocampus oder einzelne Neuronen aus Gefrierschnitten der Verletzten Rattenhirn für nachfolgende Genexpressionsanalyse mittels quantitativer real-time PCR und / oder des gesamten Genoms Microarrays erhalten.

Laser Capture Mikrodissektion von Angereichert Populationen von Neuronen oder Single Neurons zur Genexpressionsanalyse Nach Traumatic Brain Injury

Menschen neuroprogenitor Zellen (NPCs) wurden unter proliferierenden Bedingungen erweitert. NSC wurden in Neuron-reiche Kulturen in der Gegenwart einer Kombination von Neurotrophinen unterscheiden. Neuronale Marker wurden durch Immunfluoreszenz-Färbung nachgewiesen. Um eine reine Population von Nervenzellen zu isolieren, wurden NPCs auf PEN-Membran-Folien differenziert und Laser-Mikrodissektion durchgeführt wurde.

Laser Capture Mikrodissektion von Neuronen aus Differenzierte Menschen Neuroprogenitor Zellen in Kultur

Die Isolierung der einzelnen Dopamin-Neuronen oder der ventralen Haubengebiet mit direkter oder indirekter Immunhistochemie nutzt Laser Mikrodissektion demonstriert. Parameter für die Isolierung von Gewebe aus einem Glasobjektträger unter Verwendung eines Infrarotlasers und aus Membran Folien unter Verwendung der Kombination eines Infrarot und Ultraviolett-Lasers diskutiert.

Laser Mikrodissektion - Eine Demonstration der Isolation der einzelnen Dopamin-Neuronen und die gesamte ventrale Tegmentum

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Expression einer großen Reihe von Genen auf der klonalen Ebene zu bewerten. Einzellige RT-qPCR produziert höchst zuverlässige Ergebnisse mit einer starken Empfindlichkeit für Hunderte von Proben und Gene.

Einzellige Gene Expression Mit Multiplex-RT-qPCR zum Charakterisieren Heterogene Rare Lymphatische Populations

Laser werden häufig in Untersuchungen der zellulären Antwort auf DNA-Schädigung verwendet. Jedoch erzeugen sie Läsionen, deren Abstand, Frequenz und Kollisionen mit Replikationsgabeln werden selten charakterisiert. Hier beschreiben wir einen Ansatz, der die Bestimmung dieser Parameter mit Laser lokalisiert Interstrang- Vernetzungen ermöglicht.

Einzelmolekülanalyse von Laser Lokalisierte Psoralen Addukten

Es wird ein Protokoll beschrieben, das Laser-Mikrodissektion verwendet, um einzelne Nematodengewebe für die RNA-Sequenzierung zu isolieren. Das Protokoll erfordert keine artspezifischen genetischen Toolkits, so dass Genexpressionsprofile zwischen verschiedenen Spezies auf der Ebene von Einzelgewebeproben verglichen werden können.

Laser-Mikrodissektion für speziesunabhängige Einzelgewebeanwendungen

Die Laser-Capture-Mikrodissektion von oralem submukösem Fibrosegewebe ermöglicht die präzise Extraktion von Zellen aus histologischen Regionen von Interesse für die Analyse von Multi-Omics-Daten mit morphologischen und räumlichen Informationen.

Isolierung von Zellen mit morphologischen und räumlichen Informationen aus oralen submukösen Fibroseproben mittels Laser-Capture-Mikrodissektion

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von microMS für die fluoreszenzgesteuerte Einzelzell-MALDI-2-Massenspektrometrie, die ein verbessertes molekulares Profiling von primären neuronalen Zellen der Ratte ermöglicht.

Fluoreszenzgesteuerte matrixgestützte Laserdesorption/Ionisation mit laserinduzierter Postionisations-Massenspektrometrie einzelner Nervenzellen von Ratten

Lernen Sie die RNA-Isolierung aus zellspezifischen Subpopulationen im Mäusehirn durch Laser-Mikrodissektion mit schneller Immunmarkierung. Diese Methode erhält die RNA-Integrität für Genexpressionsanalysen.

RNA-Isolierung aus zellspezifische Subpopulationen Mit Laser-Mikrodissektion In Verbindung mit Rapid-Immunmarkierung

Weitere Videos entdecken