Modellierung von Prostatakrebs in gentechnisch veränderten Mausmodellen: Eine CRISPR/Cas9-vermittelte lokalisierte Gen-Editing-Technik in vorderen Prostatalappenzellen der Maus

Beginnen Sie mit einem anästhesierten und präparierten CRISPR/Cas9-Knock-in-Mausmodell mit einem Genom, das so verändert wurde, dass es Cas9-Endonukleasen und grün fluoreszierende Proteine (GFPs) durch einen starken vorgeschalteten Promotor exprimiert. Eine floxierte STOP-Kassette oder LSL, die unmittelbar stromabwärts des Promotors eingefügt wird, blockiert unter normalen Bedingungen die Cas9- und GFP-Transkription.

Schnitten Sie die Bauchdecke der Maus ein, um den vorderen Prostatalappen freizulegen, der mit der Samenblase verbunden ist. Injizieren Sie die gewünschte adenovirale Suspension in den Frontlappen, um die gezielte Verabreichung des viralen Genoms in die Zellen zu erleichtern. Legen Sie den Prostatalappen wieder in die Bauchhöhle und nähen Sie den Schnitt.

In virusinfizierten Zellen exprimiert das virale Genom Cre-Rekombinase-Enzyme und Guide-RNAs, die auf das zu mutierende Gen abzielen. Die Cre-Enzyme erkennen die LSL-Kassette und entfernen den gefloxten Transkriptionsblocker. Dieser Schritt ermöglicht es dem Promotor, die Expression von Cas9-Endonukleasen und GFPs zu steuern.

bilden Cas9-Endonukleasen Komplexe mit viruskodierten Guide-RNAs, die diese Komplexe an die Zielsequenz innerhalb des zu mutierenden Gens weiterleiten. Diese Lokalisation ermöglicht es der Cas9-Endonuklease, die genomische DNA innerhalb des Zielgens zu spalten, was zu einer genetischen Veränderung führt.

Eine onkogene Veränderung führt dazu, dass mutierte Zellen krebsartig werden. Die Co-Expression von GFP-Reporterproteinen in mutierten Zellen erleichtert die Identifizierung und Verfolgung des Fortschreitens von Krebs.

Um das Virus in die Prostata zu bringen, untersuchen Sie nach der Anästhesie einer 8 Wochen alten männlichen Maus gemäß dem Textprotokoll die Anästhesietiefe, indem Sie die Muskelentspannung, den Pedalzug und die Lidreflexe beurteilen. Wenn ein Verlust der Reflexe beobachtet wird, rasieren Sie den Unterbauch des Tieres. Bedecken Sie die Augen des Tieres mit einem sterilen Wattestäbchen vorsichtig mit tierärztlicher Augensalbe, um eine durch Xerophthalmie verursachte Erblindung zu verhindern. Verwenden Sie dann 70 % Ethanol und 10 % Povidon-Jod, um den rasierten Bauch abzuwischen und den Operationsbereich zu desinfizieren.

Führen Sie anschließend mit einer sterilen chirurgischen Schere einen etwa 1 Zentimeter langen vertikalen Hautschnitt an der unteren Bauchmittellinie durch. Heben Sie dann mit einer feinen Zange das Bauchfell an, um eine Beschädigung der darunter liegenden Organe zu vermeiden, und verwenden Sie eine chirurgische Schere, um vorsichtig einen 8 Millimeter oder kürzeren Schnitt durch das Bauchfell zu machen. Schieben Sie das Fettgewebe vorsichtig zur Seite, um die Samenblase freizulegen. Heben Sie dann mit einer Ringzange die Samenblase vorsichtig an, bis die vordere Prostata identifiziert werden kann.

Injizieren Sie nun mit einer 0,5-Milliliter-Insulinspritze und einer 30 G x 8 Millimeter großen Nadel ein Gesamtvolumen von 30 Mikrolitern Viruslösung in das vordere Prostataepithel. Minimieren Sie Leckagen und stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit im Gewebe absorbiert wird und eine kleine Blase bildet. Platzieren Sie dann die Samenblase wieder in der Bauchhöhle

Um sicherzustellen, dass die Flüssigkeit in einer kleinen Blase und ohne Leckage im Gewebe aufgenommen wird, stellen Sie sicher, dass die Injektion parallel zum Samenbläschen und der Form des vorderen Prostatalappens folgt.

Mit einer spitz zulaufenden Nadel und einem 13 Millimeter großen 3/8-Kreis vernähen Sie das Peritoneum mit zwei bis drei einfachen unterbrochenen Stichen aus 6-0 resorbierbarem Nahtmaterial. Heben Sie dann die Haut mit einer Pinzette an, um eine Beschädigung des Bauchfells zu vermeiden, und heften Sie die Haut mit drei sterilen 4,8 x 6,5 Millimeter großen Clips ab.

Für eine bessere Genesung nach der Operation verwenden Sie eine sterile 1-Milliliter-Spritze und eine 27 G x 1/2-Zoll-Nadel, um das Anästhesie-Gegenmittel in einer Dosis von 0,1 Millilitern pro Gramm Körpergewicht durch intraperitoneale Injektion zu verabreichen. Setzen Sie das Tier dann vorsichtig wieder in seinen Käfig ein.

• CRISPR/Cas9 knock-in mouse model - Genetically engineered rodent model used for research purposes involving the CRISPR/Cas9 genome editing system.
• Lsl cassette - A genetic construct used to block transcription under certain conditions.
• Cas9 endonucleases - Enzymes expressed by the Cas9 gene, used in CRISPR for cutting DNA at desired locations.
• Green Fluorescent Proteins (GFPs) - Proteins that glow green under specific light; used as a marker in biological research.
• Prostate Cancer Model - A mouse model designed for prostate cancer studies.

• Introduce CRISPR/Cas9 knock-in mouse model – Define and contextualize the genetically engineered rodent model utilized for genome editing research (e.g., mouse models of prostate cancer).
• Key Concepts – Summarize principles of genetic editing using concepts like lsl-cassette, Cas9 endonucleases, and GFPs (e.g., targeted viral genome delivery).
• Underlying Mechanisms – Briefly describe the process of creating a genetic mutation (e.g., Cre recombinase enzymes and guide-RNA).
• Connect to Experiment – Discuss the importance of these processes in creating prostate cancer mouse models, demonstrating genetic alteration and cancer progression.

• What is the CRISPR/Cas9 knock-in mouse model and how does it assist in genetic research?
• How does the incorporation of GFPs help in tracing cancer progression?
• What is the role of Cas9 endonucleases in the genetic mutation process?

• Practical Applications – Discuss real-world use cases of these techniques in genetic research and cancer study (e.g., prostate cancer research).
• Industry Impact – Identify research sectors benefiting from mouse models, including genome science, biotechnology, and healthcare (e.g., CRISPR technology).
• Societal Importance – Emphasize the wider benefits of this technology, in aiding our understanding of diseases and therapies (e.g., cancer research).
• Link to Scientific Advancements – Discuss the significant breakthroughs these models have led to in scientific research.