Ein orthotopen Mausmodell der menschlichen Prostatakrebs-Metastasen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Größe des Primärtumors, die Bildung von Lungenmetastasen und die Anzahl der zirkulierenden Tumorzellen in einem Mausmodell des menschlichen Prostatakarzinoms zu quantifizieren. Dies wird durch die direkte Implantation von humanen Prostatakrebszellen in den ventralen Lappen der Prostata einer babsi athymen Maus erreicht. Nachdem sich die Tumore entwickelt haben, werden dem Tier die Oberschenkelknochen und das Herzblut entnommen, wodurch die zirkulierenden Tumorzellen identifiziert werden können.

Schließlich werden Primärtumore und Lungen für die Analyse entfernt. Letztendlich können Veränderungen der Größe, des Gewichts und der molekularen Eigenschaften des Primärtumors sowie die Bildung von Lungenmetastasen gemessen werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Techniken, wie z. B. einer Schwanzvenen- oder interkardialen Injektion, besteht darin, dass mit dieser Technik das volle Ausmaß der Metastasierung von der Bildung des Primärtumors über die Extravasation und das Überleben im Blutkreislauf bis hin zum Eintreffen und der Bildung einer sekundären Metastasierung an einer neuen Stelle gemessen werden kann.

Die Auswirkungen dieser Technik beziehen sich auf die Behandlung von Metastasen von Prostatakrebs beim Menschen. Wir haben dieses Modell verwendet, um die Wirkung mehrerer niedermolekularer Therapeutika auf die Hemmung der Metastasierung von Prostatakrebs beim Menschen zu testen. Darüber hinaus kann das Modell verwendet werden, um potenzielle therapeutische Ziele für die Hemmung der Metastasierung von Prostatakrebs beim Menschen zu validieren. Beginnen Sie mit der Verwendung steriler Wattebäusche und Betadin, um die Unterbauchregion einer anästhesierten sechs bis acht Wochen alten athymischen Bopsy-Maus zu reinigen.

Tupfen Sie anschließend den Bereich mit einem Alkoholtupfer ab und wischen Sie das Tier dann mit einer Betadine-Lösung ab. Nachdem Sie den Bereich trocknen gelassen haben, verwenden Sie eine angespitzte, sterile chirurgische Schere, um einen drei bis vier Millimeter tiefen, mittleren Bauchschnitt zu machen. Heben Sie dann die Blase mit einer Pinzette sanft an, ohne andere Organe oder Muskeln zu bewegen, und identifizieren Sie den Bauchlappen der Prostata, der sich direkt unter der Blase befindet.

Injizieren Sie nun die interessierende Tumorzellpopulation mit einer 0,5-cm³-Spritze, die mit einer 28,5-Gauge-Nadel ausgestattet ist, in die ventrale Prostata, um Leckagen zu minimieren und sicherzustellen, dass eine kleine Blase im Gewebe beobachtet wird. Ersetzen Sie dann die Blase und verwenden Sie resorbierbare 4.0 Vicryl Monofilament-Nähte, um die Muskelschicht in einem einfachen, unterbrochenen Muster zu schließen. Verschließen Sie die Hautschicht mit sterilen Neun-Millimeter-Klammern.

Nach vier bis sechs Wochen sind Tumore visuell erkennbar oder können nach der Euthanasie ertastet werden. Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um horizontal direkt unter dem Brustkorb zu schneiden, dann vertikal zur Achselhöhle, um das Herz freizulegen, entfernen Sie Blut vom Tier mit einer terminalen Herzpunktion mit einer chirurgischen Schere, schneiden Sie die Luftröhre und entfernen Sie dann die Lunge und legen Sie die Lunge sofort in eine Gewebekassette und dann in einen Behälter mit 10% Formalin. Schneiden Sie anschließend einzeln alle Blutgefäße durch, die mit dem primären Prostatatumor verbunden sind, und achten Sie darauf, dass keine zusätzlichen Organe befestigt sind, und notieren Sie das Gewicht und die Größe des Tumors.

Dann sofort einrasten, das Gewebe in flüssigem Stickstoff einfrieren oder das Gewebe in eine Gewebekassette und dann in einen Behälter mit 10 % Formin geben. Verwenden Sie zum Schluss eine chirurgische Schere, um die Hüft- und Kniegelenke freizulegen. Trennen Sie dann die Beine und achten Sie darauf, dass der Oberschenkelknochen intakt bleibt, bevor Sie sie in sterile Kochsalzlösung legen.

In dieser ersten Abbildung sind die Veränderungen des Körpergewichts und der Nahrungsaufnahme von Mäusen sechs Wochen nach der Tumorimpfung dargestellt. Beachten Sie, dass es aufgrund der Anästhesie zu einem kleinen Rückgang des Körpergewichts und der Nahrungsaufnahme um den Tag der Operation herum kommt. Im Verlauf des Experiments nehmen das Körpergewicht und die Nahrungsaufnahme nach der Operation langsam zu und beginnen dann gegen Ende des Experiments zu sinken.

Da die Tumorlast in diesen Diagrammen ein kritisches Niveau erreicht, werden repräsentative Tumorgrößen dargestellt. Die einzelnen Tumorgrößen variieren, aber im Durchschnitt werden Tumoren mit einem Gewicht von etwa einem Gramm und einer Kubikgröße von einem Zentimeter erreicht, wie dargestellt. Hier ist es wichtig, die Veränderungen des Tumorgewichts und der Tumorgröße zu berücksichtigen, die zwischen vier und sechs Wochen auftreten.

Bei der Planung des Endpunkts des Experiments in diesem repräsentativen Experiment in den letzten zwei Wochen stieg das durchschnittliche Tumorgewicht um das 2,7-fache und die Tumorgröße um das 1,9-fache dramatisch an. Unter Berücksichtigung der experimentellen Ergebnisse können Veränderungen in der Gesamtzahl der metastasierten Zellen pro Lunge und bei der Autopsie von Mäusen nach vier gegenüber sechs Wochen beobachtet und in dieser Grafik dargestellt werden. Mäuse, die nach vier Wochen getötet wurden, zeigten keine Metastasierung, während Mäuse sechs Wochen nach der Tumorinokulation bei allen Mäusen metastasierende Zellen zeigten.

Die Evaluierung unterstreicht weiter, wie wichtig es ist, dass die Sektion von Mäusen in einem späten Stadium durchgeführt wird, um sicherzustellen, dass die Metastasierung stattgefunden hat. Diese Zeiten können je nach Zelllinie oder durch Genmodifikationen variieren. Die Anzahl der Metastasen kann auf drei verschiedene Arten quantifiziert werden.

Zum Beispiel kann die Gesamtzahl der GFP-positiven menschlichen Prostatakrebszellen einfach gezählt werden, entweder durch immunhistochemische Färbung für GFP oder durch h- und e-Färbung, wie in diesen Bildern, wo eine einzelne Zelle mit einem Pfeil hervorgehoben ist. Beachten Sie, dass die braune Färbung im GFP-gefärbten Lungenabschnitt und die großen, ausgeprägten Zellkerne vorhanden sind. Eine andere Möglichkeit, die Anzahl der Metastasen zu quantifizieren, besteht darin, die Anzahl der Orte zu berücksichtigen, an denen metastatische Ablagerungen vorhanden sind.

Zum Beispiel sind in diesem Bild bei 10 x Größe mehrere Loci mit unterschiedlichen Zellzahlen, die jeweils mit einem Pfeil hervorgehoben sind, zu sehen, in diesem Bild mit erhöhter Helligkeit ist auch ein Loci mit drei verschiedenen Zellen hervorgehoben. Schließlich kann auch die Anzahl der unterschiedlichen Metastasen, definiert durch eine klar gebundene Gruppe von Zellen, die fünf oder mehr GFP-positive menschliche Prostatakrebszellen aufweisen, quantifiziert werden, wie in diesem Bild, in dem eine metastasierende Ablagerung von 10 Zellen in den letzten drei Diagrammen gezeigt wird, repräsentative QR TPCR R-Experimente, die die Expression von drei Genen von Interesse in der metastasierten Progressionsmatrix-Metalloproteinase Typ zwei messen, Gezeigt werden die Matrix-Metalloproteinase Typ neun und das Hitzeschockprotein 27 in einzelnen Tumorproben, die nach sechs Wochen von Mäusen entnommen wurden. Bei der anfänglichen Entwicklung dieser Technik ist es wichtig, mit Ihrer Tiereinrichtung und dem tierärztlichen Personal zusammenzuarbeiten, um Anästhesie und Schmerzmittel richtig zu verabreichen und den chirurgischen Aufwand zu minimieren.