Ein Protokoll für mehrfache Gen-Knockout in Maus-Dünndarm-Organoiden mit einem CRISPR-Concatemer

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, mehrere Guide-RNAs in einen CRISPR-Verkettungsvektor zu klonen und eine hocheffiziente Elektroporation in Darmorganoiden der Maus zu erreichen, um einen gleichzeitigen Knockout mehrerer Gene zu erzielen. Diese Methode kann die Effizienz von Studien über Funktionsverluste erheblich verbessern, indem sie es ermöglicht, den potenziellen Effekt der parallelen Kompensation zu überwinden. Die Hauptvorteile unserer CRISPR-Verkettungsstrategie sind die Bequemlichkeit eines einzigen Klonierungsschritts und die Möglichkeit, bis zu vier verschiedene Gene gleichzeitig zu knockouten.

Die Demonstration des Verfahrens wird von Alessandra Merenda, einer Doktorandin aus meinem Labor, durchgeführt. Die Klonierung von Leit-RNAs oder gRNAs in den CRISPR-Verkettungsvektor beginnt mit einer einzigen Reaktion, um die oberen und unteren Stränge für jedes gRNA-Oligonukleotid zu annealen und ihre Enden zu phosphorylieren. Bereiten Sie das Reaktionsgemisch auf Eis vor, verwenden Sie für drei Verkettungsgeräte drei Mikroliter Oberstrang-gRNAs, drei Mikroliter Unterstrang-gRNAs, zwei Mikroliter T4-DNA-Ligase-Puffer, einen Mikroliter T4-Polynukleotidkinase und Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 20 Mikrolitern.

Mischen Sie gut, indem Sie den Thermocycler mit den folgenden Einstellungen pipettieren und laufen lassen: 37 Grad Celsius für 30 Minuten, 95 Grad Celsius für fünf Minuten, herunterfahren auf 25 Grad Celsius bei 0,3 Grad Celsius pro Minute und halten Sie ihn bei vier Grad Celsius. Der nächste Schritt ist die Bbs1-Shuffling-Reaktion, bei der die vorgeglühten gRNA-Oligonukleotide in die entsprechende Position des Verkettungsvektors eingebaut werden. Verdünnen Sie das Reaktionsgemisch eins bis 100 in DNA, RNA-freiem Wasser, um drei und vier gRNA-Verkettungsvektoren zu erzeugen.

Setze die Bbs1-Mischreaktionen auf Eis zusammen. Verwenden Sie 100 Nanogramm CRISPR-Verkettungsvektor, 10 Mikroliter Oligogemisch, einen Mikroliter Restriktionsenzympuffer, einen Mikroliter DTT, einen Mikroliter ATP, einen Mikroliter Bbs1-Enzym, einen Mikroliter T7-Ligase und Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 20 Mikrolitern. Durch Pipettieren gut mischen, fügen Sie eine Negativkontrolle hinzu, die den Vektor enthält.

Führen Sie die Reaktionen in einem Thermocycler unter Verwendung der folgenden Einstellungen für die Klonierung von drei und vier gRNA-Verkettungssystemen durch, führen Sie 50 Zyklen bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten und 21 Grad Celsius für fünf Minuten durch, halten Sie sie 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und halten Sie sie dann auf unbestimmte Zeit bei vier Grad Celsius. Führen Sie für zwei gRNA-Verkettungssysteme die gleichen Einstellungen mit 25 Zyklen des ersten Schritts aus. Wenn die Bbs1-Mischreaktion abgeschlossen ist, nehmen Sie 11 Mikroliter jeder Ligationsmischung und fügen Sie 1,5 Mikroliter Exonuklease-Puffer, 1,5 Mikroliter ATP, einen Mikroliter DNA-Exonuklease und Wasser zu einem Gesamtvolumen von 15 Mikrolitern hinzu.

Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, gefolgt von 30 Minuten lang bei 70 Grad Celsius. Anschließend wird das Reaktionsgemisch verwendet, um chemisch kompetente E.Coli-Bakterien nach einem Standardprotokoll zu transformieren. Um das Vorhandensein von gRNA-Inserts im CRISPR-Verkettungsvektor zu bestätigen, wählen Sie Bakterienkolonien mit einer Impfschlaufe aus und inokulieren Sie jede in vier Millilitern LB-Medium.

Züchten Sie die Klone über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Orbitalschüttler. Am nächsten Tag wird die DNA mit einem Plasmid-Miniprep-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Mischen Sie etwa 200 Nanogramm jeder DNA-Probe mit 10 Einheiten EcoR1 und fünf Einheiten BglII in einer 10-Mikroliter-Reaktion.

Fügen Sie ein separates Reaktionsgemisch mit dem entsprechenden Originalvektor als Positivkontrolle für den Größenvergleich hinzu. Inkubieren Sie die Reaktionen drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Führen Sie die Aufschlussreaktionen an einem 1%igen Agarosegel bei 90 Volt für etwa 20 Minuten durch.

Visualisieren Sie das Gel mit einem UV-Transilluminator, um die Klone mit der richtigen Einsatzgröße zu identifizieren. Um zu bestätigen, dass die gRNAs in die richtige Position kloniert wurden und folglich alle Bbs1-Erkennungsstellen verloren gegangen sind, verdauen Sie die ausgewählten Klone mit fünf Einheiten Bbs1. Fügen Sie einen separaten Reaktionsmix mit dem entsprechenden Originalvektor als Kontrolle hinzu.

Drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren, die Verdauungsreaktionen auf einem 1%igen Agarosegel bei 90 Volt für etwa 20 Minuten ablaufen lassen. Visualisieren Sie das Gel mit einem UV-Transilluminator, um die Vektoren zu identifizieren, die nicht von Bbs1 geschnitten werden. Bei der Spaltung von Organoiden für die Elektroporation sollten mindestens sechs Vertiefungen einer 48-Well-Platte pro Transvektion ausgesät werden.

Säen Sie die Organoide in 20 Mikroliter Basalmatrixtropfen und züchten Sie sie in 250 Mikrolitern WENR plus Nicotinamidmedium pro Vertiefung bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in einem befeuchteten Inkubator. Ersetzen Sie am zweiten Tag das WENR plus Nicotinamid-Medium durch 250 Mikroliter EGF plus Noggin, GSK3-Hemmer und Rock-Inhibitor-Medium ohne Antibiotika. Am dritten Tag wechseln Sie das Organoidmedium auf EGF plus Noggin, GSK3-Hemmer, Gesteinsinhibitor und 1,25 % Dimethylsulfoxid ohne Antibiotika.

Am vierten Tag brechen Sie die Matrixkuppeln des Untergeschosses mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze auf und übertragen Sie die Organoide in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Ziehen Sie den Inhalt von vier Vertiefungen einer 48-Well-Platte in ein Rohr. Zerlegen Sie die Organoide mechanisch in kleine Fragmente, indem Sie mit der P200-Pipette etwa 200 Mal auf und ab pipettieren.

Zentrifugieren Sie bei 600-facher G für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie nach der Zentrifugation das Medium aus allen Röhrchen und suspendieren Sie die Paletten erneut in einem Milliliter einer rekombinanten Protease in Zellkulturqualität. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für maximal fünf Minuten.

Es ist wichtig, die Proteasebehandlung sorgfältig zu überwachen, da der Erfolg der Elektroporation davon abhängt, eine Zellsuspension zu erhalten, die Zellcluster anstelle von Einzelzellen enthält. Überprüfen Sie einen 50-Mikroliter-Tropfen Probe unter einem inversen Lichtmikroskop mit einem vierfachen Objektiv. Cluster von 10 bis 15 Zellen sind wünschenswert, da dies das Überleben der Zellen nach der Elektroporation erhöht.

Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit geringer Bindung und verhindern Sie die Dissoziation, indem Sie neun Milliliter Basalmedium ohne Antibiotika hinzufügen. Zentrifugieren Sie es bei 600 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Palette in einem Milliliter reduziertem Serummedium.

Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einer Burkes-Kammer, mindestens eins mal 10 bis zur fünften Zelle wird pro Elektroporationsreaktion benötigt. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie neun Milliliter reduziertes Serummedium in das 15-Milliliter-Röhrchen mit der Zellsuspension geben und drei Minuten lang bei Raumtemperatur bei 400-fachem G zentrifugieren. Entfernen Sie den gesamten Überstand und suspendieren Sie die Palette wieder in einer Elektroporationslösung.

Geben Sie eine Gesamtmenge von 10 Mikrogramm DNA in zwei neue Röhrchen. Geben Sie dann Elektroporationslösung zu einem Endvolumen von 100 Mikrolitern hinzu und halten Sie die Zell-DNA-Mischung auf Eis. Übertragen Sie das Zell-DNA-Gemisch in die Elektroporationsküvette und legen Sie die Küvette in die Elektroporatorkammer.

Messen Sie die Impedanz, indem Sie den entsprechenden Knopf am Elektroporator drücken, und stellen Sie sicher, dass sie 0,030 bis 0,055 Ohm beträgt. Führen Sie die Elektroporation gemäß den im Textprotokoll angegebenen Einstellungen durch. Geben Sie 400 Mikroliter Elektroporationspuffer plus Gesteinsinhibitor in die Küvette und geben Sie dann den gesamten Inhalt in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen.

30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, damit sich die Zellen erholen können. Nach 30 Minuten bei 400 mal G für drei Minuten bei Raumtemperatur drehen. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Palette wieder in 20 Mikrolitern pro Vertiefung der Kellermatrix.

Säen Sie etwa eins mal 10 bis einmal 10 bis 10 bis fünfte Zellen pro Well in einer 48-Well-Platte aus und fügen Sie EGF plus Noggin, GSK3-Inhibitor, Gesteinsinhibitor und 1,25 % Dimethylsulfoxid-Medium hinzu. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag wird das Medium auf EGF plus Noggin, GSK3-Inhibitor und Rock-Inhibitor umgestellt und die Transvektionseffizienz durch Beobachtung der GFP-Expression überprüft.

Halten Sie Organoide bei 37 Grad Celsius. Ersetzen Sie zwei Tage später das Medium durch frisches Medium. Vier Tage nach der Elektroporation wechseln Sie das Medium auf WENR plus Nicotinamid und Rockinhibitor-Medium und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius weiter.

Das Vorhandensein der korrekten Anzahl von gRNA-Insertionen im Verkettungsvektor wird durch doppelten Restriktionsverdau mit EcoR1 und BglII bestätigt. Die erwartete Größe der unteren Bande beträgt etwa 1,6 Kilobase für einen Vier-gRNA-Verkettungsvektor und 1,2 Kilobase für einen Drei-gRNA-Verkettungsvektor. Darüber hinaus bestätigt der Verdau mit Bbs1, dass die gRNAs in die richtige Position kloniert wurden und folglich alle Bbs1-Erkennungsstellen verloren gehen.

Bestätigte Konstrukte werden durch Elektroporation an Darmorganoide von Mäusen abgegeben, um eine Transvektionseffizienz von bis zu 70 % zu erreichen, wie die GFP-Expression zeigt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man gRNA-Verkettungsvektoren generiert und wie man sie mithilfe der Elektroporation effizient an 3D-Organoidkulturen liefert, um einen Knockout mehrerer Gene gleichzeitig zu erreichen.