Mapping hemmende neuronale Schaltungen durch Laser Scanning Photostimulation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die lokale funktionelle Organisation inhibitorischer neuronaler Schaltkreise zu untersuchen. Das Verfahren beginnt mit der Präparation von lebenden Hirnschnitten aus dem primären somatosensorischen Kortex von Mäusen. Der nächste Schritt besteht darin, GFP-exprimierende inhibitorische Zelltypen im Hirnschnitt sichtbar zu machen und gezielt aufzuzeichnen.

Im Anschluss an diese Laserscanning-Photostimulation mittels Glutamat wird das Uncaging verwendet, um kleine Cluster präsynaptischer Neuronen als exzitatorisch oder hemmend zu aktivieren. Postsynaptische Ströme werden in den GFP-exprimierenden Interneuronen aufgezeichnet. Der letzte Schritt besteht darin, die Photostimulation und die Datenanalyse durchzuführen und quantitative Karten des synaptischen Inputs für die aufgezeichneten Neuronen zu erstellen.

Letztendlich ermöglicht die Laserscanning-Photostimulation in Kombination mit Ganzzellaufzeichnungen die Erstellung detaillierter Karten von synaptischen Eingängen zu bestimmten Arten von inhibitorischen Neuronen, was es ermöglichen könnte, die Organisation und Funktion lokaler inhibitorischer kortikaler Schaltkreise zu bestimmen. Die auf Photostimulation basierende Technik wurde von Dr. Larry Katz und Ned Calloway entwickelt und von Dr. Carols Waboda, meinem Pi, weiterentwickelt. Dr. Xing Z wurde bei Dr. Dr. Calloway, dem Salk Institute, ausgebildet, wo er viele Studien zur Untersuchung interoraler Schaltkreise leitete. Unsere Gruppe erweitert und führt diese Studien derzeit fort und untersucht interorale Schaltkreise.

Um dieses Verfahren zu beginnen, töten Sie eine transgene Maus zwei bis drei Wochen nach der Geburt durch Enthauptung und entfernen Sie schnell das Gehirn, legen Sie das Gehirn in eine gefrorene und sauerstoffhaltige Schneidlösung. Verwenden Sie dann die GFP-Brille, um das Gehirn visuell zu untersuchen und die GFP-Expression zu überprüfen. Schneiden Sie als Nächstes den primären somatosensorischen Kortex mit einem Vibrator in Abschnitte von 400 Mikrometern Dicke.

Inkubieren Sie die Scheiben in der Saccharose, die A CSF enthält, das mit 95 % O2 und 5 % CO2 bei 32 Grad Celsius für 30 Minuten bis eine Stunde blasig ist. Übertragen Sie danach die Scheiben bei Raumtemperatur auf das reguläre A CSF, um den Laser für das Experiment vorzubereiten, schalten Sie das Laserkühlsystem und die Stromversorgung ein. Schalten Sie dann die gesamte Hardware für die Steuerung der Photostimulation ein, einschließlich des Scanning-Spiegelsystems, des optischen Modulators und des elektronischen Shutters sowie eines Fotodioden-Eingangsverstärkers.

Schalten Sie als Nächstes die elektrophysiologischen Geräte wie den Multi Clamp 700 B-Verstärker und die Mikromanipulatoren ein. Elektrophysiologische Aufzeichnungen, Photostimulation und Bildgebung werden in der Schichtperfusionskammer durchgeführt, die auf dem motorisierten Tisch des Mikroskops montiert ist. Schalten Sie danach die bildgebende Kamera ein, die Scheibe wird im aufrechten Mikroskop mit Infrarot-DIC und Epi-Fluoreszenzoptik durch das Bildgebungssystem visualisiert.

Öffnen Sie dann die MATLAB-basierte FS-Software und die Q-Capture-Kamerasoftware auf dem Monitor. Bevor Sie das Experiment durchführen, überprüfen Sie das Laser-Photostimulationssystem und stellen Sie sicher, dass es sich in einem funktionierenden Zustand befindet. Legen Sie ein Blatt Papier unter das vierfache Mikroskopobjektiv, um das Laserscanning-Muster zu beobachten, während das System läuft.

Um die Mikroelektrode mit einem Widerstand von vier bis sechs Mega OM herzustellen, ziehen Sie mit dem Pipettenabzieher an einer Glaselektrode. Füllen Sie dann die Elektrode mit einer internen Lösung mit 0,1 % Biotin zur Zellmarkierung und morphologischen Identifizierung. Schalten Sie als Nächstes das unter Druck stehende Perfusionssystem ein, um A CSF in die Kammer zu pumpen.

Sorgen Sie für einen konstanten Flüssigkeitsstand von 2,0 Millimetern über der Scheibe in der Kammer. Ein Aliquot der Stammlösung von MNI-Glutamat im Käfig wird zu 25 Millilitern zirkulierendem A-CSF für eine Konzentration von 0,2 Millimolar Glutamat im Käfig gegeben. Übertragen Sie dann eine Gehirnscheibe in die Aufnahmekammer.

Führen Sie das Bildgebungssystem aus, um die Schnittqualität zu überprüfen und den primären somatosensorischen Bereich anatomisch zu lokalisieren. Verankern Sie als Nächstes die Scheibe mit einem speziell angefertigten Saitenring aus Platin und achten Sie darauf, den Anker nicht über die Gehirnregion zu legen, die für die Aufnahme vorgesehen ist. Visualisieren Sie die Zellen mit einem 60-fach-Objektiv, basierend auf der Visualisierung der GFP-Expression unter einem DIC-Fluoreszenzmikroskop.

Identifizieren und wählen Sie die inhibitorischen Zelltypen aus. Bitte beachten Sie, dass die Aufzeichnung unter visueller Kontrolle mit Hilfe von Infrarot-DIC erfolgt. Eine Videoüberwachung und das Umschalten zwischen dem DIC- und dem Fluoreszenzmodus ist erforderlich, um die Position der GFP-Zelle zu bestätigen, während die Elektrode auf die Zielzelle abgesenkt wird.

Mit der herkömmlichen Patch-Spanntechnik. Üben Sie zunächst einen Überdruck auf die Elektrode aus. Bewegen Sie es nahe an die Zelloberfläche, um ein erkennbares Grübchen auf der Zielzellmembran zu bilden.

Üben Sie dann schnell Unterdruck aus, um eine Giga-Dichtung zu bilden und die Zelle zu brechen, während Sie die aktuellen Injektionsreaktionen auf dem Videomonitor überwachen. Nehmen Sie nach dem Einbruch die Bilder des aufgezeichneten GFP-Intraneurons bei 60-facher Vergrößerung unter den DIC- und Fluoreszenzmodi für die Online-Verifizierung auf. Bevor Sie die Photostimulationsdaten sammeln, injizieren Sie hyperpolarisierende und depolarisierende Stromimpulse, um die grundlegenden elektrophysiologischen Eigenschaften jeder Zelle zu untersuchen.

Sobald eine stabile Ganzzellaufzeichnung mit einem guten Zugangswiderstand von weniger als 20 Megaohm erreicht ist, schalten Sie das Mikroskopobjektiv für die Laserscanning-Photostimulation von 60-facher auf vierfacher Vergrößerung um, nehmen Sie ein Schnittbild mit vierfacher Vergrößerung auf und verwenden Sie es zum Führen und Registrieren der Photostimulationsstellen. Stellen Sie die Parameter für die Photostimulation und die Datenerfassung ein, indem Sie das Konfigurationsschaltermodul von phys aktivieren. Verwenden Sie einen Laserpuls von einer Millisekunde von etwa 20 Milliwatt mit einem Stimulusintervall von einer Sekunde.

Für die Kartierung der Photostimulation erfassen Sie Datenspuren von einer Sekunde, die bei 10 Kilohertz abgetastet wurden. Laden Sie als Nächstes das Bild mit den vier x Schichten in das Mapper-Modul von phys. Definieren Sie die Position des Somas und richten Sie die Photostimulationsstellen in einem 16 x 16 großen Muster mit 80 Mikrometer x 80 Mikrometer ein.

Abstand um die Zellposition, die alle kortikalen Schichten abdeckt. Kartieren Sie dann das Erregungsprofil des aufgezeichneten Neurons, indem Sie die Spike-Positionen als Reaktion auf die Photostimulation im aktuellen Clamp-Modus untersuchen. Unsere benutzerfreundliche Software mit den Online-Anzeigefunktionen erleichtert die Kartierungsexperimente.

Kartieren Sie danach die lokalen erregenden Schaltkreisverbindungen, indem Sie die exzitatorischen postsynaptischen Ströme aus der aufgezeichneten Zelle detektieren Halten Sie die Zelle mit Laserscanning an verschiedenen Stellen bei minus 70 Millivolt im Spannungsklemmmodus, um nach innen gerichtete erregende Ströme zu erkennen. Wiederholen Sie dann die exzitatorischen postsynaptischen Stromkarten zwei- bis dreimal, wobei das Photostimulationsmuster gedreht oder umgedreht wird. Um die lokalen Verbindungen der inhibitorischen Schaltkreise zu kartieren, detektieren Sie die inhibitorischen postsynaptischen Ströme aus der aufgezeichneten Zelle.

Halten Sie die Zelle in diesem Fall bei nahe null Millivolt, im Spannungsklemmmodus bei minus 15 Millivolt, um nach außen gerichtete Hemmströme zu erkennen. Nachdem Sie alle physiologischen Assays abgeschlossen haben, entfernen Sie die Elektrode vorsichtig aus der aufgezeichneten Zelle. Nehmen Sie die Gehirnscheibe aus der Kammer, fixieren Sie sie über Nacht in 4%para-Formaldehyd und färben Sie die aufgenommenen Zellen gegen Biotin.

In diesem Experiment wird die Kombination aus GFP-Expression, intrinsischer Elektrophysiologie und morphologischen Eigenschaften verwendet, um die inhibitorischen Neuronen zu klassifizieren. Gezeigt. Hier sind das Beispiel und eine Rohdatenkarte zur Veranschaulichung der Laserscanning-Photostimulation, die eine umfassende Kartierung der lokalen kortikalen Schaltkreisverbindungen zu dem aufgezeichneten inhibitorischen Neuron ermöglicht. Hier sind die Beispiele für die farbcodierten quantitativen Eingabekarten, die von den gerade in Abbildung D gezeigten Rohspuren abgeleitet wurden. Die Amplituden der synaptischen Ereignisse, die in dem aufgezeichneten Interneuron detektiert wurden, sind farbcodiert und topographisch über die Photostimulationsorte

Die Position des Zellkörpers wird durch den roten offenen Kreis in der Skalenleiste gekennzeichnet. Die warmen Farben deuten auf starke synaptische Eingänge und kühle Farben auf eine schwache oder keine Konnektivität zur Zielzelle hin. In ähnlicher Weise zeigt Abbildung E die Anzahl der synaptischen Ereignisse pro abgetasteter Entriegelungsstelle für das aufgezeichnete Neuron.

Abbildung F zeigt den Zeitpunkt des Beginns des ersten detektierten synaptischen Ereignisses bis zur aufgezeichneten Zelle nach der Photostimulation in der Skalenleiste. Die warmen Farben deuten auf kurze Eingaben und Latenzzeiten hin, während kühlere Farben auf längere synaptische Latenzen hinweisen. Auf diese Weise ermöglicht LSPS die Erstellung detaillierter Karten der Position, Stärke, Latenz und Anzahl der Eingaben, die auf bestimmte Arten von inhibitorischen Neuronen auftreffen.

Nun, bei diesem Verfahren ist es wichtig, geduldig zu sein, saubere Experimentbedingungen zu schaffen, aber das Neuron effektiv und sehr vorsichtig von einer hohen Vergrößerung des Objekts zu einer geringen Modifikation zu wechseln. Dann der letzte Einsatz von Landsoftware sehr gut.