Split-grün fluoreszierendes Protein System Effektoren geliefert von Bakterien während der Infektion zu visualisieren

Fluoreszierende Protein-basierte Ansätze, Effektoren abgesondert von Bakterien in Wirtszellen zu überwachen sind anspruchsvoll. Dies ist aufgrund der Inkompatibilität zwischen fluoreszierende Proteine und die Typ-III-Sekretion-System. Hier wird eine optimierte Split Superfolder GLP-System zur Visualisierung von Effektoren abgesondert von Bakterien in die Wirtszelle Pflanze verwendet.

Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Pflanzen-Mikroben-Interaktion zu beantworten, z. B. wie pathogene Bakterien den optimalen Zustand ihrer Wirtspflanzenzellen stören können, indem sie Proteine, sogenannte Effektoren, verwenden, die in Pflanzenzellen sezerniert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das bakterielle Effektorprotein in der Bakterienzelle unter Verwendung ihres nativen Expressionssystems exprimiert und dann über das bakterielle Typ-III-Sekretionssystem an die Pflanzenzelle abgegeben wird. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, bereiten Sie die Pflanzen Nicotiana benthamiana und Arabidopsis thaliana vor, wie im Textprotokoll beschrieben.

Als nächstes wird die Standard-Elektroporation verwendet, um das mit dem sfGFP11-Tag fusionierte Plasmidträger und Effektorgen in Pseudomonas syringae Pathovar Tomate CUCPB5500 Stamm zu transformieren. Der optimale Zeitpunkt und das optimale Expressionsniveau oder die Rekonstitution von sfGFP hängen wirklich von Ihrem Effektorprotein ab. Wir empfehlen, die Impf- oder Beobachtungsbedingungen zu optimieren.

Verteilen Sie die transformierten Bakterienzellen vorsichtig auf der Oberfläche der King's B Agar Platten. Dann inkubieren Sie die Platten zwei Tage lang bei 28 Grad Celsius. Danach inokulieren Sie eine Bakterienkolonie in King's B Flüssigmedium mit einem für den Vektor geeigneten Antibiotikum.

Über Nacht bei 28 Grad Celsius mit Schütteln bei 200 U/min inkubieren. Am nächsten Tag autoklaviertes Glycerin in das inokulierte Medium bis zu einer Endkonzentration von 50% geben, bei minus 80 Grad Celsius lagern. Wandeln Sie zunächst das Plasmid in Zellen des Agrobacterium tumefaciens-Stamms GV3101 um, wie im Textprotokoll beschrieben.

Züchten Sie die Zellen auf supplementiertem LB-Agar-Medium bei 28 Grad Celsius für zwei Tage. Beimpfen Sie mit einer einzigen Kolonie aus dem LB-Agar-Medium 5 Milliliter ergänztes flüssiges LB-Medium. Dann züchten Sie die Zellen über Nacht bei 28 Grad Celsius und schütteln bei 200 U/min.

Danach zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 3000 g, um die Zellen zu ernten. Gießen Sie den Überstand ab und suspendieren Sie das Pellet wieder in 1 Milliliter frisch hergestelltem Infiltrationspuffer. Bestimmen Sie mit einem Spektralphotometer die Anzahl der Agrobacterium-Zellen, indem Sie den optischen Dichtewert bei einer Extinktion von 600 Nanometern messen.

Verwenden Sie dann einen Infiltrationspuffer, um den OD 600 der Bakterienzellen auf 0,5 einzustellen. Lassen Sie die Kultur ein bis fünf Stunden lang auf einer sanften Wippe bei Raumtemperatur stehen. Um die Blätter zu infiltrieren, verwenden Sie eine 10-Mikroliter-Pipettenspitze, um ein Loch in die Mitte jedes Blattes zu stechen.

Verwenden Sie eine nadellose 1-Milliliter-Spritze, um vorsichtig 500 Mikroliter der Agrobacterium-Suspension in die adaxiale Seite des Blattes zu injizieren. Wischen Sie die restliche Bakteriensuspension von den Blättern ab und markieren Sie die Grenze des infiltrierten Bereichs. Bewahren Sie die infiltrierten Pflanzen zwei Tage lang in einer Wachstumskammer bei 25 Grad Celsius und 60% Luftfeuchtigkeit auf.

Streichen Sie den transformierten Pseudomonas-Stamm aus dem Glycerinstamm mit dem entsprechenden Antibiotikum auf das King's B-Agar-Medium. Inkubieren Sie zwei Tage lang bei 28 Grad Celsius. Beimpfen Sie eine Schleife von Pseudomonas-Zellen in einem flüssigen Mannitol-Glutamat-Medium.

Inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 28 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 200 U/min. Danach zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 3000 g, um die Zellen zu ernten. Gießen Sie den Überstand ab und suspendieren Sie das Pellet wieder in 10-millimolarer Magnesiumchloridlösung.

Stellen Sie dann die optische Dichte auf 0,02 für Nicotiana benthamiana-Blätter und auf 0,002 für Arabidopsis-Blätter ein. Für die Blätter von Nicotiana benthamiana infiltrieren Sie die Pseudomonas-Suspension in den gleichen Bereich, in den das Agrobacterium zwei Tage zuvor infiltriert wurde. Für die transgene Arabidopsis infiltrieren Sie die Pseudomonas-Suspension in zwei vier Wochen alte, kurze, taggewachsene Blätter.

Zum Schluss schneidest du eine Blattscheibe für die mit Pseudomonas beimpften Blätter aus. Zu bestimmten Zeitpunkten nach der Infiltration von Pseudomonas können Sie mit einem konfokalen Laserscanning-System zwei bis zwei Quadratzentimeter große Blattscheiben der einzelnen Pflanze abbilden. Beobachten Sie die Zellen außerhalb des Infiltrationslochs, um zu vermeiden, dass tote Zellen durch Verwundung getötet werden.

Translozierte Effektoren aus den Bakterien sind nur in sehr geringen Mengen vorhanden. Daher können Sie die Laserleistung erhöhen und eine Fluoreszenzemission erhalten, um ein Fluoreszenzsignal zu detektieren. Übertreiben Sie es jedoch nicht, um ein falsches Signal der Autofluoreszenz von den Pflanzenzellen zu vermeiden.

In dieser Studie wird ein fluoreszierender Protein-basierter Ansatz verwendet, um Effektoren zu überwachen, die von Bakterien in Wirtszellen sezerniert werden. Hier ist ein konfokaler Laserscan eines Blattes von Nicotiana benthamiana drei Stunden nach der Infektion zu sehen. Zellen, die optimiertes sfGFP nur mit AvrB exprimieren, zeigen kein Fluoreszenzsignal.

GFP-Signale werden jedoch von den infizierten Zellen gesehen, die AvrB, sfGFP11 enthalten. Dies bestätigt, dass der AvrB sfGFP11-Komplex mit optimiertem sfGFP im Zytosol rekonstituiert und dann zur Plasmamembran transloziert wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, das Pflanzenmaterial gesund zu halten und frische Bakterienkulturen für aktive Zellen vorzubereiten.

Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Harzblutanalyse vorangetrieben werden, um die falsche Translationsmodifikation von bakteriellen Effektorproteinen in Pflanzenzellen während der pflanzlichen Immunantwort zu verstehen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Abgabe von Typ-III-Effektoren in infizierten Pflanzenzellen visualisieren können. Pflanzenmaterialien und Bakterienkulturen sollten gemäß den Kriterien Ihres Labors für biologisch gefährliche Abfälle entsorgt werden und vergessen Sie nicht, Ihre PSA zu tragen.