Co Ausdruck von mehreren Chimären fluoreszierende Fusionsproteinen in effizienter Weise in Pflanzen

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Pflanzenmolekular- und Zellbiologie zu beantworten, z. B. wie können wir Proteine in der Zelle speichern. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die hohe Effizienz der Co-Expression von zellulären Fusionsproteinen in einem Expressionsvektor. Das Verfahren wird von Guitao Zhong, einem Doktoranden aus unserem Labor, demonstriert.

Entwerfen Sie zunächst die Primer für die molekulare Klonierung von DNA-Fragmenten, wie im Textprotokoll beschrieben. Amplifizieren Sie DNA-Fragmente, die für den Aufbau der semi-unabhängigen Proteinexpressionskassetten notwendig sind, durch Standard-PCR-Reaktionen mit ihren entsprechenden Primern und High-Fidelity-Polymerase. Dazu gehören der Promotor, der fluoreszierende Reporter, das Zielgen und der Terminator.

Untersuchen Sie die Qualität der PCR-Produkte der ersten Runde, indem Sie mit DNA-Elektrophorese unter Verwendung eines 1%-Agarosegels nach DNA-Abbau und Kontamination suchen. Quantifizieren Sie die PCR-Produkte mit einem Spektralphotometer. Das Verhältnis zwischen den Messwerten bei 260 und 280 Nanometern der PCR-Produkte sollte zwischen 1,6 und 1,8 liegen.

Mischen Sie die DNA-Fragmente, die für dieselbe Proteinexpressionskassette ausgelegt sind, in einem PCR-Röhrchen zu einem Endvolumen von fünf Mikrolitern. Über das Mischen von DNS aus verschiedenen Ausdruckskassettendaten. Da gleich die Effizienz des DNA-Assemblings verringert wird, da immer mehr DNA-Moleküle miteinander verknüpft werden müssen.

Gib nun 15 Mikroliter 2x Mastermischung zu der 5 Mikroliter DNA-Mischung und inkubiere bei 50 Grad Celsius für 60 Minuten. Amplifizieren Sie die gesamte semi-unabhängige Proteinexpressionskassette durch eine zweite PCR-Runde. Verwenden Sie 0,5 bis 1 Mikroliter des Produkts aus der ersten runden isothermen Assemblierungsreaktion als Vorlage in den äußersten Primern.

Verwenden Sie eine Einheit High-Fidelity-Polymerase in einem Reaktionsvolumen von 50 Mikrolitern für 30 Zyklen, gefolgt von einer abschließenden Verlängerung bei 68 Grad Celsius für fünf Minuten. Als nächstes linearisieren Sie den endgültigen Proteinexpressions-Rückgratvektor POC 18 und den Vektor CAMBIA 1300, indem Sie vier Einheiten der kleinen Eins in ein endgültiges Reaktionsvolumen von 10 Mikrolitern hinzufügen. Diese Vektoren sind für die transiente Expression von Proteinen und die genetische Transformation konzipiert.

Inkubieren Sie den Restriktionsverdau für ein bis zwei Stunden bei 25 Grad Celsius. Nach der Verdauung inaktivieren Sie das Restriktionsenzym, indem Sie es 20 Minuten lang bei 65 Grad Celsius inkubieren. Als nächstes mischen Sie äquimolare DNA-Moleküle von Proteinexpressionskassetten und linearisierten Endvektoren zu einem endgültigen Reaktionsvolumen von fünf Mikrolitern.

Führen Sie schließlich die zweite Runde der DNA-Rekombination durch, indem Sie die Reaktion mit 15 Mikrolitern 2x Masterpuffer mischen und 60 Minuten lang bei 50 Grad Celsius inkubieren. Um Tabak-BY-2-Suspensionszellen für das Bombardement vorzubereiten, werden 30 Milliliter 3-Tage-kultivierte BY-2-Zellen über eine Vakuumpumpe auf ein Stück 70 Milliliter autoklaviertes Filterpapier gefiltert, indem der Vakuumdruck auf 40 Millibar eingestellt wird. In der Zwischenzeit einige Tropfen BY-2 cell flüssiges Kulturmedium in eine Petrischale geben.

Übertragen Sie das Filterpapier mit den BY-2-Zellen darauf in die Petrischale. Um Arabidopsis-Jungpflanzen für den Beschuss vorzubereiten, bereiten Sie sieben Tage alte Probenpflanzen vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Übertragen Sie sie dann in ein Rechteck in der Mitte einer neuen halbstarken MS-Mediumplatte, um die Effizienz des Bombardements zu erhöhen.

Achten Sie darauf, dass die Pflanzen beim Umfüllen und Platzieren auf dem Teller nicht überlappen. Geben Sie einige Tropfen halbstarkes MS-Flüssigmedium auf die Oberfläche der Pflanzen oder des Gewebes, um die Feuchtigkeit zu bewahren und ein Austrocknen der Pflanzen während der verbleibenden Schritte zu verhindern. Um Goldpartikel mit Plasmid-DNA zu beschichten, wirbeln Sie die Gold-Microcarrier-Lösung zunächst drei Minuten lang gründlich ein.

Geben Sie nun 25 Mikroliter Goldpartikel in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen und wirbeln Sie es 10 Sekunden lang ein. Fügen Sie 10 Mikroliter mit 25,46 Milligramm pro Liter Spermidin hinzu und wirbeln Sie es 10 Sekunden lang ein. Fügen Sie als nächstes fünf Mikroliter von einem Mikrogramm pro Mikroliter Plasmid-DNA hinzu und wirbeln Sie es drei Minuten lang ein.

Fügen Sie zum Schluss 25 Mikroliter 277,5 Milligramm pro Liter Calciumchloridlösung hinzu und wirbeln Sie eine Minute lang. Schleudern Sie die Gold-Microcarrier mit einer Tischzentrifuge fünf Sekunden lang bei maximaler Geschwindigkeit herunter. Nach dem Zentrifugieren das Überkorn vorsichtig herausspritzen, ohne das Pellet zu stören.

Waschen Sie anschließend das Pellet mit 200 Mikrolitern absolutem Ethanol und suspendieren Sie das Pellet erneut, indem Sie es fünf bis 10 Sekunden lang vortexen. Sobald Sie gewonnen haben, drehen Sie die Gold-Microcarrier fünf Sekunden lang mit maximaler Geschwindigkeit herunter und entfernen Sie das Ethanol. Suspendieren Sie die Goldpartikel in 18 Mikrolitern absolutem Ethanol

Aliquotieren Sie dann sechs Mikroliter Partikelsuspension auf die Mitte von drei Mikrocarriern und lassen Sie sie an der Luft trocknen. Um die DNA per Partikelbeschuss in die Zellen und Pflanzen zu übertragen, muss zunächst das Partikelabgabesystem so eingestellt werden, wie es im Textprotokoll beschrieben ist. Bombardieren Sie dann die Zellen oder Pflanzen auf der Agromedium-Platte dreimal an drei verschiedenen Positionen.

Halten Sie die bombardierten Zellen und Pflanzen sechs bis 72 Stunden lang im Dunkeln in der Pflanzenwachstumskammer, bevor Sie die Fluoreszenzsignale beobachten. Stellen Sie die Pflanzenwachstumskammer auf 24 Stunden dunkel und 22 Grad Celsius ein. Übertragen Sie die juvenilen Pflanzen oder Suspensionszellen auf einen herkömmlichen Objektträger und legen Sie vorsichtig einen Deckschieber auf die Oberseite für die Bildgebung mit der üblichen konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie.

Mit den im Textprotokoll aufgeführten Einstellungen regen Sie GFP-markierte Proteine bei 485 Nanometern an und detektieren Fluoreszenz bei 525 Nanometern. Für RFP-markierte Proteine regen Sie bei 585 Nanometern an und detektieren bei 608 Nanometern. Berechnen Sie abschließend das Kollokalisationsverhältnis von Fluoreszenzsignalen, wie im Textprotokoll beschrieben.

Die Co-Expression von Arabidopsis VSR-2 und Arabidopsis SCAMP4 in Tabak-BY-2-Zellen wurde durch Partikelbeschuss erreicht und zeigt korrekte Lokalisationen. RFP arabidopsis VSR-2 zeigt ein punktförmiges Muster, das sich von der Plasmamembranlokalisation von Arabidopsis SCAMP4-GFP unterscheidet, mit einigen zytosolischen punktförmigen Punkten. Darüber hinaus wurden Arabidopsis-transgene Pflanzen, die Arabidopsis SCAMP4-GFP und RFP arabidopsis VSR-2 koexprimieren, durch Agrobakterien-vermittelte Transformation erzeugt.

Es werden die subzellulären Lokalisationen der Co-Expression der beiden chimären Proteine in Wurzel- und Wurzelhaarzellen gezeigt. In Übereinstimmung mit früheren Studien verursachte die Behandlung von transgenem Arabidopsis RFP arabidopsis VSR-2-markierten prävacualären Kompartimenten, die eine kleine ringförmige Struktur bildeten. Während die Behandlung mit Prefoldin A induzierte Arabidopsis SCAMP GFP eine transgold G-Netzwerk-Aggregation ermöglichte.

Als Negativkontrolle wird ein geringes autofluoreszierendes Signal in Tabak-BY-2-Zellen und Arabidopsis-Wurzel- und Wurzelhaarzellen beobachtet, wenn die gleichen Einstellungen der Bilderfassung angewendet werden. Diese Methode kann Aufschluss über die subzelluläre Lokalisation der Proteine geben. Es kann auch zur Untersuchung von Proteinen in Richtung angewendet werden.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der pflanzlichen Zellbiologie. Um die subzellulären Lokalisationen und die räumliche Interaktion von Proteinen in der lebenden Pflanzenzelle bequem zu exportieren. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie PET-vermittelte Transformation und genetische Kreuzung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Koexpression mehrerer Fusionsproteine in Pflanzen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Bombardements extrem gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie Augenschutz getroffen werden sollten.