Magnetofektion-basierte Transfektion in vitro: Eine magnetfeldgestützte Technik zur Verabreichung von Plasmiden in primäre neuronale Zellen der Maus mit magnetischen Nanopartikeln

Beginnen Sie mit fluoreszierender Protein-kodierender Plasmid-DNA oder pDNA-Suspension in Medien. Biokompatible, mit kationischen Polymeren beschichtete magnetische Nanopartikel zur pDNA-Suspension hinzufügen und inkubieren.

Die positiv geladenen kationischen Polymere interagieren und konjugieren elektrostatisch mit negativ geladener pDNA, was zu einer pDNA-Kondensation und der Bildung von "magnetischen Polyplexen" mit einer insgesamt positiven Ladung führt.

Übertragen Sie nun die Polyplex-Mischung in eine Multi-Well-Platte, die adhärente primäre neuronale Mauszellkultur enthält. Montieren Sie die Multiwell-Platte über einer Magnetplatte und inkubieren Sie.

Das von der Magnetplatte erzeugte Magnetfeld bewirkt, dass die Polyplexe sedimentieren und sich auf der neuronalen Zelloberfläche ansammeln. Dieser enge Kontakt mit der Zelloberfläche erleichtert die unspezifische Bindung von positiv geladenen Polyplexen an negativ geladene Zellmembran-assoziierte Proteoglykane.

Anschließend werden die Polyplexe durch Endozytose internalisiert - ein Prozess, bei dem die lokalen Regionen der Zellmembran einstülpen und abklemmen, um membrangebundene Vesikel, sogenannte Endosomen, zu bilden.

Im Inneren des Zytoplasmas induzieren die kationischen Polymere des Polyplexes die Protonenakkumulation im Endosom. Der gleichzeitige Einstrom von Chloridionen zur Aufrechterhaltung der Ladungsneutralität erhöht die endosomale Ionenstärke, was zum Wassereinstrom führt.

Schließlich schwellen die Endosomen aufgrund des osmotischen Drucks an und reißen auf, wodurch Polyplexe in das Zytoplasma freigesetzt werden. Die kondensierte pDNA in den Polyplexen ermöglicht eine erhöhte zytosolische Motilität, während die kationischen Polymere die pDNA vor dem Abbau der zytoplasmatischen Nuklease schützen.

Nach der Dissoziation der Polyplexe wird die freigesetzte pDNA - während der entsprechenden Zellzyklusphase, in der sich die Kernmembran vorübergehend zersetzt - in den Zellkern transloziert. Zellen, die erfolgreich mit pDNA transfiziert wurden, exprimieren fluoreszierende Proteine.

Um Motoneuronen zu kultivieren, verdünnen Sie sie auf 5.000 bis 10.000 Zellen in 500 Mikrolitern Kulturmedium pro Vertiefung in einer 24-Well-Platte. Entfernen Sie dann die Laminatlösung mit einer P1000-Pipettenspitze. Übertragen Sie die in Kulturmedium verdünnten Motoneuronen sofort auf die Beschichtungsplatten, um ein Austrocknen zu vermeiden.

Um die DNA vorzubereiten, resuspendieren Sie 1 Mikrogramm DNA in 50 Mikrolitern neuronalem Kulturmedium und wirbeln Sie es 5 Sekunden lang vortexen. Um das Kügelchenröhrchen vorzubereiten, resuspendieren Sie 1,5 Mikroliter Kügelchen in 50 Mikrolitern neuronalem Nährmedium. Geben Sie 50 Mikroliter Bead-Lösung zu 50 Mikrolitern DNA-Lösung und inkubieren Sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Während dieser Inkubation werden 100 Mikroliter Kulturmedium aus der Vertiefung entnommen, die transfiziert werden soll. Übertragen Sie anschließend 100 Mikroliter der DNA-Bead-Mischung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die 24-Well-Platte 20 bis 30 Minuten auf der Magnetplatte bei 37 Grad Celsius.