H&E-Färbung von paraffineingebetteten Gewebeschnitten: Eine differentielle Färbetechnik zur Visualisierung von Lebergewebeschnitten unter Verwendung einer Kombination von Hämatoxylin- und Eosin-Farbstoffen

Beginnen Sie mit der Hämatoxylin- und Eosin-Färbung, indem Sie einen Objektträger mit dem in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitt entnehmen. Tauchen Sie den Objektträger in eine Entparaffinierungslösung, die Xylol enthält - ein organisches Lösungsmittel, das die Paraffinschicht um das Gewebe herum auflöst und sie in den nachfolgenden Schritten für Flecken zugänglich macht.

Behandeln Sie den Gewebeschnitt mit absolutem Alkohol, um das Xylol zu entfernen. Tauchen Sie das Gewebe in abnehmende Alkoholkonzentrationen. Dieser Schritt rehydriert das Gewebe, indem der Alkohol durch Wasser ersetzt wird, um eine bessere Verträglichkeit mit wasserlöslichen Farbstoffen zu gewährleisten.

Färben Sie das Gewebe mit basischem Hämatoxylin, das in seiner oxidierten Form an ein Beizmittel - ein Metallkation - bindet. Dieser Komplex bindet elektrostatisch an die Nukleinsäuren im Genom und färbt den Zellkern violett.

Tauchen Sie den gefärbten Abschnitt in eine saure Differenzierungslösung, um überschüssiges Hämatoxylin aus dem Zytoplasma zu entfernen, wodurch der Farbstoff-erhaltende Kern deutlich erscheint. Behandeln Sie das Gewebe mit einem alkalischen Bläuungsmittel, um die freien Säuren zu neutralisieren. Dadurch wird die violette Farbstofffarbe zu Blau zurückgebildet, wodurch die nuklearen Details verbessert werden.

Tauchen Sie den Objektträger in saure Eosinlösung, um die basischen Proteinkomponenten im Zytoplasma und die Bindegewebsfasern in Rot- bis Rosatönen zu färben. Behandeln Sie das Gewebe mit Alkohol, um überschüssiges Eosin auszuscheiden. Verwenden Sie steigende Konzentrationen von Ethanol, um das Gewebe zu dehydrieren. Tauchen Sie den Objektträger in Xylol, um alle verbleibenden Reagenzien zu entfernen.

In der Bildgebung zeigen die Zellen im Gewebeschnitt klare blaue Zellkerne und rosa zytoplasmatische Regionen.

Entparaffinieren Sie die Objektträger, indem Sie sie zweimal für jeweils 15 Minuten in 100% Xylol tauchen. Rehydrieren Sie dann die Objektträger durch einen Ethanolgradienten. Tauchen Sie für jede Lösung 8 bis 10 Mal ein, zwei Sekunden pro Tauchgang, bis die Flüssigkeit sauber von den Objektträgern abläuft. Legen Sie die Objektträger vier Minuten lang in 100% gefiltertes Harris-Hämatoxylin.

Setzen Sie sie nach vier Minuten schnell wieder in den Behälter mit entionisiertem Wasser um. Lassen Sie entionisiertes Wasser in die hintere Ecke des Behälters laufen, die am weitesten von den Abschnitten entfernt ist. Leeren Sie den Behälter regelmäßig, bis das Wasser nicht mehr violett ist.

Überprüfen Sie schnell die Hämatoxylinintensität an einem Präpariermikroskop mit Schwanenhalslichtern. Setzen Sie die Objektträger eine Minute lang wieder auf 100 % Hämatoxylin ein, wenn eine weitere Färbung erforderlich ist.

Sobald die gewünschte Hämatoxylin-Färbung erreicht wurde, tauchen Sie die Objektträger zweimal in 0,05%ige Salzsäure und geben Sie sie dann sofort wieder in den Behälter mit sauberem, entionisiertem Wasser. Leeren Sie den Behälter und füllen Sie ihn zweimal mit Wasser.

Übertragen Sie die Objektträger für jeweils 30 Sekunden in zwei Behälter mit 95% Ethanol. Legen Sie die Objektträger für zwei Minuten in die Eosin-Y-Phloxin-B-Lösung.

Übertragen Sie die Objektträger nach den zwei Minuten zurück in den vorherigen 95%igen Ethanolbehälter und überprüfen Sie dann die Intensität der Farbe unter dem Präpariermikroskop. Wenn die Färbung nicht ausreicht, kehren Sie für 30 Sekunden zur Eosinlösung zurück. Wiederholen Sie den Vorgang bei Bedarf.

Wenn die Färbung mit der gewünschten Intensität erreicht wurde, übertragen Sie die Objektträger für 15 Sekunden auf 100 % Isopropanol. Ersetzen Sie es durch frisches 100% Isopropanol und legen Sie die Objektträger für weitere 15 Sekunden wieder in das Isopropanol. Wiederholen Sie diesen Vorgang für insgesamt sechs Isopropanol-Wäschen.

Nachdem Sie drei Minuten lang in 100 % Xylol getaucht haben, entfernen Sie einen Objektträger, fügen Sie ausreichend Einbettmedium hinzu, um die Abschnitte abzudecken, und tauchen Sie dann den Objektträger in 100 % Xylol.

Kleben Sie ein Deckglas auf die Folie und tupfen Sie überschüssiges Montagemedium auf ein Papiertuch, bis nur noch eine dünne Linie zu sehen ist. Tauchen Sie dann ein Taschentuch in das Xylol und wischen Sie die Rückseite des Objektträgers ab, um das abgetropfte Medium zu entfernen.

Legen Sie die Rutsche flach auf eine stabile, aber bewegliche Oberfläche, z. B. ein Stück Pappe, und lassen Sie das Xylol 10 Minuten lang in der Haube verdampfen. Lassen Sie die Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur, damit das Eindeckmedium vor der Bildgebung aushärten kann.