Nested-PCR zum Nachweis einer spezifischen viralen Genomsequenz

Die verschachtelte Polymerase-Kettenreaktion, die verschachtelte PCR, kann spezifische Gensequenzen selektiv amplifizieren.

Um eine virale Zielsequenz nachzuweisen, beginnen Sie mit einem Mastermix, der äußere Primer enthält, die zu einer größeren DNA-Region komplementär sind, die die Zielvirussequenz, dNTPs und thermostabile DNA-Polymerase in einem geeigneten Puffer enthält.

Fügen Sie dieser Mischung doppelsträngige virale DNA hinzu, die aus den virusinfizierten Zellen extrahiert wurde. Übertragen Sie das Rohr in einen Thermocycler; Führen Sie den ersten PCR-Zyklus durch.

Bei der Denaturierung produziert die doppelsträngige DNA zwei einzelsträngige Matrizen. Bei einer geeigneten Glühtemperatur binden die äußeren Primer an die entsprechenden Zielsequenzen. Später verlängert die DNA-Polymerase die Primer mit dNTPs und erzeugt große Amplicons, die die spezifische Sequenz innerhalb der amplifizierten DNA enthalten.

Übertragen Sie diese Amplikons in eine neue Röhre. Ergänzen Sie mit einem frischen Mastermix, der innere oder verschachtelte Primer enthält, die auf eine kleinere, spezifischere Sequenz innerhalb der größeren amplifizierten DNA abzielen. Führen Sie die zweite PCR durch.

Während der zweiten PCR denaturiert der DNA-Strang. Nach der Denaturierung binden die verschachtelten Primer die Zielstellen auf dem einzelsträngigen Template, gefolgt von einer Polymerase-vermittelten Primerverlängerung.

Wiederholen Sie den zweiten PCR-Zyklus mehrmals, um ausschließlich die Zielvirussequenz zu amplifizieren.

Analysieren Sie das PCR-Produkt, um die kleineren Amplikons zu visualisieren und das Vorhandensein der spezifischen Virussequenz zu bestätigen.

Holen Sie sich die notwendigen Reagenzien und bewahren Sie sie bis zur Verwendung in einem Reinraum auf Eis auf. Wenn Sie fertig sind, tauen Sie die Reagenzien auf und wirbeln Sie sie ein. Bereiten Sie als Nächstes 48 Mikroliter der PCR-Mischung der ersten Runde für jede Probe in einem 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen vor, wie in Tabelle 2 des Textprotokolls beschrieben, und teilen Sie die Reaktionsmischung in 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen auf.

Geben Sie in einer PCR-Workstation in einem Vorlagenraum eine 2-Mikroliter-Probe der cDNA in den PCR-Mix der ersten Runde. Nehmen Sie zwei Mikroliter CVS-11 cDNA als Positivkontrolle und zwei Mikroliter doppelt destilliertes Wasser als Negativkontrolle auf. Übertragen Sie dann die versiegelten Röhrchen in einen PCR-Thermocycler und führen Sie den Zyklus unter Verwendung der in Tabelle 3 des Textprotokolls aufgeführten Parameter durch.

Bereiten Sie zunächst 48 Mikroliter PCR-Mix der zweiten Runde für jede Probe in einem 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen vor, wie in Tabelle 4 des Textprotokolls beschrieben, und teilen Sie die Reaktionsmischung in 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen auf. Geben Sie zwei Mikroliter des PCR-Produkts der ersten Runde in die PCR-Mischung der zweiten Runde. Fügen Sie doppelt destilliertes Wasser als Negativkontrolle für diese PCR-Runde hinzu. Führen Sie dann das PCR-Thermocycling mit den in Tabelle 3 des Textprotokolls aufgeführten Parametern durch.