Dot-Blot-Assay zur Quantifizierung des viralen Genoms

Um die virale DNA mit dem Dot-Blot-Assay zu quantifizieren, beginnen Sie mit einer isolierten viralen DNA-Suspension. Mit einer alkalischen Lösung behandeln, um die doppelsträngige DNA für die anschließende Hybridisierung in Einzelstränge zu denaturieren.

Bauen Sie das Dot-Blot-Gerät mit einer vorbenetzten Nylonmembran zusammen. Laden Sie denaturierte virale DNA und linearisierte Standard-Plasmid-DNA-Lösungen in die Vertiefungen. Wenden Sie ein geeignetes Vakuum an, das den effektiven Transfer negativ geladener viraler einzelsträngiger DNA und die Bindung an die positiv geladene Membranoberfläche durch elektrostatische Wechselwirkungen erleichtert, wodurch Punktmuster gebildet werden.

Waschen Sie die Membran nach dem Lauf mit Natriumcitratpuffer, um die Empfindlichkeit des Assays zu verbessern. Setzen Sie die Membran nach dem Trocknen ultraviolettem Licht aus und vernetzen Sie die getleckte DNA mit der Membran.

Geben Sie der Membran ein hitzedenaturiertes, nicht-heterologes DNA-Fragment und eine virale genomspezifische radioaktive, mit Phosphor markierte DNA-Sondensuspension in Hybridisierungspuffer zu. Inkubieren, um die Hybridisierung zu erleichtern.

Die DNA-Fragmente wirken als Blockiermittel, binden an die verbleibenden Membranregionen, wodurch die unspezifische Sondenbindung minimiert wird. Die radioaktive Sonde hybridisiert mit der komplementären Sequenz auf der einzelsträngigen DNA des Virus.

Waschen Sie mit Waschpuffer, um nicht hybridisierte Sonden zu entfernen. Quantifizieren Sie mit dem Phosphor-Bildscanning-System die radioaktiven Signale, die von den radioaktiven Sonden emittiert werden, die mit dem viralen Genom auf der Membran hybridisiert sind, um Dot-Blot-Signale zu erhalten.

Aus der Standardkurve kann die Signalintensität jedes Punktes auf der Membran verwendet werden, um die Menge an viraler DNA in der Probe zu berechnen.

Um den Dot-Blot-Assay durchzuführen, bereiten Sie Plasmid-DNA-Standards vor, indem Sie die Plasmid-DNA des AAV-Vektorgenoms auf 10 Nanogramm pro Mikroliter in Wasser oder Tris-HCl-Puffer verdünnen. Übertragen Sie ein 25-Mikroliter-Aliquot der verdünnten Plasmid-DNA in ein frisches Röhrchen und linearisieren Sie es mit einem geeigneten Restriktionsenzym in einem Reaktionsvolumen von 50 Mikrolitern für eine Stunde.

Geben Sie 450 Mikroliter Wasser oder TE in das Röhrchen mit dem verdauten Plasmid-DNA-Standard und mischen Sie es gründlich. Übertragen Sie dann 70 Mikroliter dieser Mischung in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 1.330 Mikrolitern Wasser oder TE, um einen verdünnten Plasmidstandard herzustellen.

Um das Dot-Blot-Gerät einzurichten, schneiden Sie die Blotting-Membran mit einer Schere auf eine für die Anzahl der Proben und Standards geeignete Größe zu. Weichen Sie die Membran 10 Minuten lang mit Wasser ein, bevor Sie sie auf das Dot-Blot-Gerät legen. Decken Sie dann die ungenutzten Vertiefungen ab. Geben Sie Wasser in die Brunnen, in die die Proben geladen werden. Legen Sie ein Vakuum an, ziehen Sie das Wasser durch die Brunnen, prüfen Sie, ob Fehler vorhanden sind, und ziehen Sie dann die Schrauben wieder fest. Wiederholen Sie den Test, falls erforderlich.

Tragen Sie 400 Mikroliter jedes verdünnten Plasmid-DNA-Standards auf jede Vertiefung auf und führen Sie vier Spuren mit Standardverdünnungen durch. Verwenden Sie zwei separate Aliquots des Standarddigests, und laden Sie jedes in doppelter Ausführung. Tragen Sie dann 200 Mikroliter pro Vertiefung jeder viralen DNA-Probe auf. Wenden Sie ein sanftes Vakuum an, um die DNA-Lösungen durch die Vertiefungen zu poolen. Sobald alle Vertiefungen geleert sind, lassen Sie das Vakuum ab, indem Sie das Dreiwegeventil einstellen.

Geben Sie 400 Mikroliter 1X alkalische Lösung in jede Vertiefung. Warten Sie dann fünf Minuten, bevor Sie erneut ein Vakuum anwenden, um die Vertiefungen zu leeren. Wenden Sie das Vakuum erneut an und zerlegen Sie das Dot-Blot-Gerät. Entfernen Sie dann die Membran und spülen Sie sie mit 2X SSC aus.

Legen Sie die Membran mit der DNA-gebundenen Seite nach oben auf ein sauberes Papiertuch, um überschüssigen Puffer zu entfernen. Verwenden Sie einen geeigneten UV-Vernetzer, um die gefleckte DNA mit der Membran zu vernetzen. Die Membran ist nun bereit für die Hybridisierung.

Legen Sie die Membran mit der DNA-gebundenen Seite nach oben in eine Hybridisierungsflasche. Spülen Sie die Membran mit 5 bis 10 Millilitern vorgewärmtem Hybridisierungspuffer und entsorgen Sie den Puffer. Fügen Sie dann 10 Milliliter vorgewärmten Hybridisierungspuffer hinzu und stellen Sie die Flasche in einen rotierenden Hybridisierungsofen, der auf 65 Grad Celsius eingestellt ist. Drehen Sie die Flasche mindestens fünf Minuten lang.

Geben Sie schnell die denaturierte Spermien-DNA und die radioaktive Sonde in den Hybridisierungspuffer in der Flasche und schütteln Sie ihn 10 Sekunden lang, um ihn zu mischen. Stellen Sie die Flasche wieder in den 65 Grad Celsius heißen Ofen und inkubieren Sie sie mit einer Rotation bei 65 Grad Celsius für mindestens vier Stunden.

Sobald die Hybridisierung abgeschlossen ist, stoppen Sie die Rotation, entfernen Sie die Hybridisierungsflasche und gießen Sie dann die radioaktive Sondenlösung in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit einer auslaufsicheren Verschlusskappe. Um die Membran zu waschen, geben Sie 20 bis 30 Mikroliter vorgewärmten Waschpuffer in die Hybridisierungsflasche und drehen Sie sie fünf Minuten lang. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male.

Entfernen Sie nach dem dritten Waschen die Membran aus der Hybridisierungsflasche und entfernen Sie mit Küchenpapier den überschüssigen Puffer von der Membran. Legen Sie dann die Membran in einen durchsichtigen Papierhalter aus Kunststoff. Überprüfen Sie mit einem Geigerzähler die radioaktiven Signale auf der Membran.

[TRILLERN]

Nachdem Sie den gelöschten Phosphor-Imaging-Bildschirm der Membran ausgesetzt haben, scannen Sie den Bildschirm mit einem Phosphor-Bild-Scansystem und erhalten Sie die Daten zur Signalintensität jedes Punktes.