Vaccinia-Viren Reporter zur Quantifizierung von Viral-Funktion auf allen Stufen der Genexpression

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Stadien zu identifizieren, in denen die virale Genexpression durch eine chemische Behandlung beeinflusst wird. Dazu werden Gewebekulturzellen plattiert und inkubiert. Bis zur Konfluation werden die Zellen dann entweder mit einem Triple-Reporter-Vaccinia-Virus oder einem Kontroll-Promotor-Listenvirus infiziert.

Als nächstes werden die Behandlungssubstanzen aufgetragen und die Zellen werden 18 Stunden lang inkubiert, um den Abschluss aller Stadien der viralen Genexpression zu ermöglichen. Die resultierende Fluoreszenz wird dann mit einem Platten-Reader bestimmt. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die relativen Veränderungen in der Expression zeigen, die durch die experimentellen Verbindungen verursacht werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber einer Infektion mit einem Virus, das ein einzelnes fluoreszierendes Fusionsprotein exprimiert, besteht darin, dass diese Gruppe von Viren mehr Informationen darüber liefert, wo im viralen Lebenszyklus ein bestimmtes therapeutisches Medikament wirkt, und einen Einblick in seinen Wirkmechanismus gibt. Obwohl diese Methode zur Identifizierung von Inhibitoren der Virusinfektion verwendet werden kann, kann sie auch verwendet werden, um das Stadium der Virusreplikation zu erkennen, das in nicht-permissiven Zelllinien oder in RNAi-Screenings abgeschlossen ist, wodurch zelluläre Faktoren identifiziert werden, die für die Infektion notwendig sind. Dieses Protokoll verwendet das Triple-Virus oder das mehrstufige Trip-V-Reportervirus, bei dem drei spektral unterschiedliche Fluor-Vierer in das Dublett-Strandgenom eines einzelnen Venia-Virus eingebaut sind.

Jedes dieser Fluor-Fours wird durch einen genau definierten stadienspezifischen Promotor gesteuert. Der C 11 R-Promotor für die frühe Expression von Venus, der G 8 R-Zwischenpromotor für die Expression von Mikrokirsche und der F 17 R-Promotor für die späte Expression von Tag-BFP. So werden Venus m Cherry und Tag BFP während der Infektion sequentiell exprimiert.

Als Kontrolle wird ein Promotorlistenvirus verwendet. PLV enthält ein ähnliches venöses Konstrukt wie das Trip V, hat jedoch keinen funktionellen Transkriptionspromotor. Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie dissoziieren.

Hela-Zellen, die auf einer 10-Zentimeter-Schale gezüchtet werden, verdünnen die Zellen in Wachstumsmedium auf etwa 2,0 mal 10 bis fünf Zellen pro Milliliter. Geben Sie dann 100 Mikroliter in jede Vertiefung einer schwarzwandigen, durchsichtigen 96-Well-Platte mit klarem Boden und inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang in einem 37-Grad-Inkubator mit 5 % Kohlendioxid, bis sie zusammenfließen, um die Viren zu verdünnen, Tauen Sie Tripp V und PLV in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad auf und beschallen Sie es dann fünf Minuten lang, um zu disaggregieren. Als nächstes verdünnen Sie den Virusbestand auf 1,0 mal 10 bis die siebte PFU pro Milliliter in Infektionsmedium, das auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde, um die Zellen zu infizieren.

Ersetzen Sie das Wachstumsmedium bei jeder Behandlung durch 50 Mikroliter des verdünnten Virus in jede Vertiefung. Infizieren Sie drei Replikationsvertiefungen mit Tripp V und drei weitere mit PLV, um die für jede Behandlung spezifische Hintergrundfluoreszenz zu berücksichtigen. Dies ist definiert als Zeit gleich null Stunden.

Nach der Infektion ergeben sich beispielsweise 350 Mikroliter für 6 96 Vertiefungen mit je 50 Mikrolitern. Jede Verbindung sollte auf das Doppelte der Endkonzentration verdünnt werden, da sie zu dem bereits in der Vertiefung befindlichen Inokulumvolumen hinzugefügt wird. Als nächstes wird für jede Behandlungsbedingung ein Zwei-x-Mastermix hergestellt, indem die experimentellen Verbindungen oder Vehikelkontrolllösungsmittel wie PBS oder DMSO in genügend Infektionsmedium für alle Replikate verdünnt werden.

Plus eins: Beachten Sie, dass die Konzentration des Lösungsmittels sowohl in der experimentellen als auch in der reinen Vektorkontrolle gleich sein sollte. Wenn Sie z. B. IBT mit einem Mikroliter pro Monat in DMSO verwenden, sollten Sie auch DMSL allein mit einem Mikroliter pro Monat als Vektorsteuerung verwenden. Unmittelbar nach der Zugabe des Virus 50 Mikroliter Infektionsmedium mit den gewünschten Behandlungs- und Kontrollstoffen in jede Vertiefung geben, wie in dieser Abbildung gezeigt.

Es ist zu beachten, dass jede Verbindung mit Tripp V und PLV in dreifacher Ausfertigung getestet wird und für jedes Virus eine Vehikelkontrolle in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wird. Inkubieren Sie 18 Stunden lang in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator plus 5 % Kohlendioxid. Fixieren Sie die Zellen am nächsten Tag, indem Sie dem Infektionsmedium bereits 100 Mikroliter 8%-Paraformaldehyd hinzufügen. Inkubieren Sie die Platte 15 Minuten lang bei Raumtemperatur lichtgeschützt.

Die direkte Zugabe von zwei x oder 8 %-Paraformaldehyd zum Infektionsmedium verhindert die Aerosolisierung des Virus, die sonst auftreten könnte, wenn das nicht fixierte Virus direkt in die Abfallschale invertiert wird. Entfernen Sie nach Ablauf von 15 Minuten das Fixiermittel, indem Sie die Platte in die Abfallschale umdrehen. Geben Sie dann 100 Mikroliter PBS bei Raumtemperatur hinzu und versiegeln Sie die Platte mit optisch klarer Klebefolie.

Wenn die Platte nicht sofort abgelesen wird, lagern Sie sie bei vier Grad Celsius. Stellen Sie sicher, dass Sie die versiegelten Platten vor dem Ablesen wieder auf Raumtemperatur bringen, um zu verhindern, dass Kondensation die Messungen des Spektralphotometers verfälscht. Um das Viruswachstum zu quantifizieren, verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die Endpunktfluoreszenz zu messen.

Führen Sie vier Messungen pro Well mit optimierten Verstärkungseinstellungen für jeden Kanal durch. Der in diesem Video verwendete TAN Infinite M 1000 Pro Plattenleser exportiert Rohfluoreszenzmessungen in eine Microsoft Excel-Datei. Nachdem die Messwerte erhalten wurden, öffnen Sie die Rohdaten in Microsoft Excel.

Kopieren Sie es dann und fügen Sie es in ein GraphPad-Prisma ein. Das Ergebnisblatt in Prism bestimmt den Mittelwert der replizierten Tripp v- und PLV-Wells. Subtrahieren Sie dann für jede Behandlung den mittleren PLV-Wert vom mittleren Tripp-V-Wert.

Um den Vergleich mit Replikationsexperimenten zu erleichtern, normalisieren Sie die Daten, indem Sie die subtrahierten Hintergrunddaten nur durch das Fahrzeug dividieren Tripp vs. Wells. Sobald ein Experiment mehrmals wiederholt wurde, führen Sie eine unidirektionale Varianzanalyse oder einen unidirektionalen NOVA-Test und einen mehrfachen Vergleich nach dem Test durch, um festzustellen, ob sich eine der Behandlungen signifikant von der DMSO-Behandlung unterscheidet. Für jeden Kanal zur Durchführung kinetischer Assays, zur Infektion der Zellen und zur Anwendung von Testverbindungen wie zuvor ist es besonders wichtig, ein gepuffertes Medium zu verwenden, um den richtigen pH-Wert ohne Zugabe von 5 % Kohlendioxid aufrechtzuerhalten.

Nachdem Sie die Platte mit Klebefolie versiegelt haben, legen Sie sie in die auf 37 Grad Celsius äquilibrierte Plattenleserkammer. Es muss besonders darauf geachtet werden, dass die Platten konstant bei 37 Grad Celsius bleiben. Dies verhindert übermäßigen Zellstress und Kondensation.

Stellen Sie die Verstärkung des Plattenlesers manuell ein, um eine Sättigung späterer Zeitpunkte zu verhindern. Erfassen Sie stündliche Messwerte für acht bis 24 Stunden nach der Infektion und normalisieren Sie sie. Was den Endpunkt-Assay betrifft, so können einzelne Zeitpunkte mit ähnlichen Methoden wie dem zuvor beschriebenen Endpunkt-Assay auf statistische Signifikanz analysiert werden.

Um die Hemmpunkte zu vergleichen, wurden mit TPV oder PLV vaccinia infizierte Ferazellen in Gegenwart der Pockenvirushemmer Aris, CIBT, Rifampicin und ST 2 46 gezüchtet. Dieses Mal zeigt der Zeitrafferfilm die sequentielle Expression von grünen, roten und blauen Fluorvier während des Viruswachstums in Kontrollzellen, wenn sie in Gegenwart des DNA-Replikations-blockierenden Medikaments aee infiziert wurden. Das frühe grüne Fluorvier wird wie bisher produziert, aber die Zwischen- und Spätproduktion von roter und blauer Fluoreszenz findet nicht statt.

Quantitative Analysen durch Spektrometrie zeigten eine 210%ige Zunahme der frühen Genexpression, aber einen Mangel an intermediärer und später Expression in Zellen, die mit C-Zellen behandelt wurden, die in Gegenwart von IBT infiziert waren, von der angenommen wird, dass sie dies fördert. Die Read-through-Transkription hatte intermediäre und späte Expressionswerte, die 24,7 % bzw. 2,9 % der Kontrollwerte betrugen. Zellen, die in Gegenwart von ST 2, 46 und Rifampicin infiziert waren, die nach später Genexpression während der Virionenassemblierung und -reifung hemmten, unterschieden sich nicht signifikant von Kontrollen. Diese Ergebnisse stimmen mit dem verstandenen Wirkmechanismus dieser Verbindungen überein und deuten darauf hin, dass das Trip-V-Reportervirus verwendet werden kann, um das spezifische Stadium der Virushemmung für unbekannte Verbindungen zu identifizieren.

Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, geeignete Steuerelemente einzuschließen. Dies ermöglicht nicht nur die korrekte Normalisierung der Ergebnisse, sondern auch die Bestimmung eines möglichen Mechanismus für Ihre experimentelle Verbindung. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit dem Vaccinia-Virus extrem gefährlich sein kann, tragen Sie immer die richtige persönliche Schutzausrüstung und befolgen Sie die empfohlenen BSL.

Zwei Eindämmungstechniken.