Vaccinia-Viren Reporter zur Quantifizierung von Viral-Funktion auf allen Stufen der Genexpression

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Stadien zu identifizieren, in denen die virale Genexpression durch eine chemische Behandlung beeinflusst wird. Dazu werden Zellkulturzellen ausgesät und bis zur Konfluenz inkubiert. Anschließend werden die Zellen entweder mit einem dreifachen Reportervirus der Vaccinia-Virusart oder mit einem Kontrollvirus ohne Promotor infiziert.

Anschließend werden die Behandlungsverbindungen zugegeben, und die Zellen werden 18 Stunden inkubiert, um den Abschluss aller Stadien der viralen Genexpression zu ermöglichen. Die resultierende Fluoreszenz wird anschließend mit einem Plattenreader bestimmt. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die die relativen Änderungen der Expression zeigen, die durch die experimentellen Verbindungen verursacht wurden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber einer Infektion mit einem Virus, das ein einzelnes fluoreszierendes Fusionsprotein exprimiert, liegt darin, dass dieses Virensystem mehr Informationen darüber liefert, an welcher Stelle des viralen Lebenszyklus ein bestimmtes therapeutisches Medikament wirkt, und somit Einblicke in seinen Wirkmechanismus ermöglicht. Obwohl diese Methode zur Identifizierung von Inhibitoren der Virusinfektion verwendet werden kann, eignet sie sich auch dazu, den Fortschritt der viralen Replikation in nicht permissiven Zelllinien oder in RNAi-Screens zu erfassen und zelluläre Faktoren zu identifizieren, die für die Infektion notwendig sind. Dieses Protokoll nutzt das Triple-Virus oder TrpV-Multistufen-Reporter-Virus, bei dem drei spektral unterscheidbare Fluoreszenzfarbstoffe in das doppelsträngige Genom eines einzelnen Vaccinia-Virus eingebaut sind.

Jeder dieser Fluorophore wird durch einen gut definierten, auf ein bestimmtes Stadium spezifischen Promotor gesteuert: Der C 11 R-Promotor für die frühe Expression von Venus, der G eight R-Zwischenpromotor für die Expression von m-Cherry und der F 17 R-Promotor für die späte Expression von tag BFP. Daher werden Venus, m-Cherry und tag BFP während der Infektion nacheinander exprimiert.

Als Kontrolle wird ein promotorloses Virus verwendet. Das PLV enthält einen ähnlichen Venus-Konstrukt wie das TrpV, besitzt jedoch keinen funktionellen Transkriptionspromotor.

Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie HeLa-Zellen, die auf einer 10 cm-Dish kultiviert wurden, ablösen. Verdünnen Sie die Zellen in Wachstumsmedium auf etwa 2,0 × 10⁵ Zellen pro Milliliter. Geben Sie anschließend 100 µL in jedes Loch einer schwarzen, klaren, flachen 96-Loch-Platte mit klarem Boden. Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang in einem Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO₂, bis sie konfluent sind. Zum Verdünnen der Viren tauen Sie TrpV und PLV in einem 37 °C warmen Wasserbad auf und sonizieren sie fünf Minuten lang, um Aggregationen aufzulösen. Verdünnen Sie anschließend den Virusstamm auf 1,0 × 10⁷ PFU pro Milliliter in Infektionsmedium, das zuvor auf 37 °C vorgewärmt wurde.

Um die Zellen zu infizieren, ersetzen Sie das Wachstumsmedium durch jeweils 50 Mikroliter des verdünnten Virus pro Vertiefung. Infizieren Sie für jede Behandlung drei Verdoppelungen mit TrpV und weitere drei mit PLV, um die hintergrundspezifische Fluoreszenz jeder Behandlung zu berücksichtigen. Dieser Zeitpunkt wird als null Stunden post-Infektion definiert. Beispiel: Bereiten Sie 350 Mikroliter für 6 Vertiefungen einer 96-Loch-Platte mit jeweils 50 Mikrolitern vor. Jede Verbindung sollte auf die doppelte Endkonzentration verdünnt werden, da sie zur bereits in der Vertiefung befindlichen Inokulummenge hinzugegeben wird. Danach stellen Sie für jede Behandlungsbedingung eine 2x-Master-Mischung her, indem Sie die experimentellen Verbindungen oder Kontrolllösungen wie PBS oder DMSO in ausreichend Infektionsmedium für alle Replikate plus eines verdünnen. Beachten Sie, dass die Konzentration des Lösungsmittels sowohl in den experimentellen als auch in den Vektor-kontrollierten Proben gleich sein sollte. Beispiel: Wenn Sie IBT bei einem Mikroliter pro Milliliter in DMSO verwenden, sollten Sie auch DMSO allein bei einem Mikroliter pro mL als Vektor-Kontrolle verwenden. Unmittelbar nach Zugabe des Virus geben Sie 50 Mikroliter Infektionsmedium, das die gewünschten Behandlungs- und Kontrollsubstanzen enthält, in jede Vertiefung, wie in dieser Abbildung dargestellt.

Beachten Sie, dass jede Verbindung in dreifacher Ausführung mit TrpV und PLV getestet wird und eine Fahrzeugkontrolle für jeden Virus in dreifacher Ausführung durchgeführt wird.

Inkubieren Sie 18 Stunden lang in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius mit zusätzlich 5 % Kohlendioxid. Am nächsten Tag fixieren Sie die Zellen, indem Sie 100 Mikroliter 8 % Paraformaldehyd zum Infektionsmedium hinzufügen, das sich bereits in jedem Brunnen befindet. Inkubieren Sie die Platte 15 Minuten bei Raumtemperatur, geschützt vor Licht.

Das Hinzufügen von zwei x oder 8 % Paraformaldehyd direkt zum Infektionsmedium verhindert die Aerosolbildung des Virus, die andernfalls auftreten könnte, wenn das nicht fixierte Virus direkt in die Abfallwanne gegeben wird. Nach Ablauf von 15 Minuten entfernen Sie das Fixativ, indem Sie die Platte in die Abfallwanne umdrehen. Anschließend geben Sie 100 Mikroliter PBS bei Raumtemperatur hinzu und versiegeln die Platte mit einer optisch klaren Klebefolie.

Falls die Platte nicht sofort ausgelesen wird, lagern Sie sie bei vier Grad Celsius. Stellen Sie sicher, dass die versiegelten Platten vor dem Auslesen auf Raumtemperatur zurückgebracht werden, um Kondensation zu vermeiden, die die Spektrophotometer-Messungen verfälschen könnte.

Um das Viruswachstum zu quantifizieren, verwenden Sie ein Spektrophotometer, um die Endpunkt-Fluoreszenz zu messen. Nehmen Sie vier Messungen pro Vertiefung mit optimierten Verstärkungseinstellungen für jeden Kanal vor. Der in diesem Video verwendete Plattenreader TECAN Infinite M 1000 Pro exportiert die rohen Fluoreszenzdaten in eine Microsoft Excel-Datei. Nachdem die Messwerte erfasst wurden, öffnen Sie die Rohdaten in Microsoft Excel.

Kopieren Sie die Daten anschließend und fügen Sie sie in ein Ergebnisblatt von GraphPad Prism ein. Bestimmen Sie in Prism den Mittelwert der replizierten TrpV- und PLV-Vertiefungen. Subtrahieren Sie dann für jede Behandlung den mittleren PLV-Wert vom mittleren TrpV-Wert. Um den Vergleich mit Experimenten mit Wiederholungen zu erleichtern, normalisieren Sie die Daten, indem Sie die hintergrundsubtrahierten Daten durch die Werte der ausschließlich mit Fahrzeug behandelten TrpV-Vertiefungen dividieren. Sobald ein Experiment mehrfach wiederholt wurde, führen Sie eine einfaktorielle Varianzanalyse (einfaktorielle ANOVA) und einen Post-hoc-Test für multiple Vergleiche durch, um zu ermitteln, ob sich eine der Behandlungen signifikant von der DMSO-Behandlung für jeden Kanal unterscheidet. Für kinetische Assays infizieren Sie die Zellen und geben Testsubstanzen wie zuvor hinzu; dabei ist es besonders wichtig, ein gepuffertes Medium zu verwenden, um den richtigen pH-Wert ohne Zusatz von 5 % Kohlendioxid aufrechtzuerhalten.

Nachdem die Platte mit Klebefolie verschlossen wurde, stellen Sie sie in die auf 37 Grad Celsius temperierte Kammer des Plattenlesegeräts. Es ist besondere Sorgfalt darauf zu verwenden, die Platten konstant bei 37 Grad Celsius zu halten. Dies verhindert unnötigen Zellstress und Kondensation.

Stellen Sie die Verstärkung des Plattenlesegeräts manuell ein, um eine Sättigung bei späteren Zeitpunkten zu vermeiden. Nehmen Sie stündliche Messungen über einen Zeitraum von acht bis 24 Stunden nach der Infektion vor und normalisieren Sie diese wie bei dem Endpunkt-Assay beschrieben. Einzelne Zeitpunkte können mittels ähnlicher Methoden wie beim zuvor beschriebenen Endpunkt-Assay auf statistische Signifikanz analysiert werden.

Um Hemmungspunkte zu vergleichen, wurden mit TrpV- oder PLV-Vaccinia infizierte HeLa-Zellen in Gegenwart der Pockenvirus-Inhibitoren AraC, IBT, Rifampicin und ST 246 kultiviert. Dieser Zeitrafferfilm zeigt die schrittweise Expression der grünen, roten und blauen Fluoreszenzfarbstoffe während des Viruswachstums in Kontrollzellen. Bei Infektion in Gegenwart des DNA-Replikationsblockers AraC wird der frühe grüne Fluoreszenzfarbstoff wie zuvor produziert, die intermediäre und späte Produktion der roten und blauen Fluoreszenz bleibt jedoch aus.

Die quantitative Analyse mittels Spektrometrie zeigte eine Zunahme der frühen Genexpression um 210 %, jedoch fehlte die intermediäre und späte Expression in mit araC behandelten Zellen. Zellen, die in Gegenwart von IBT infiziert wurden, das vermutlich die Durchleitung der Transkription fördert, wiesen intermediäre und späte Expressionsspiegel auf, die 24,7 % bzw. 2,9 % der Kontrollwerte betrugen. Zellen, die in Gegenwart von ST246 und Rifampicin infiziert wurden, die die Expression nach der späten Phase während der Virionen-Assembly und -Reifung hemmen, unterschieden sich nicht signifikant von den Kontrollen. Diese Ergebnisse stimmen mit dem bekannten Wirkmechanismus dieser Verbindungen überein und legen nahe, dass das TrpV-Reportervirus verwendet werden kann, um den spezifischen Hemmstadium von unbekannten Substanzen zu identifizieren.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, geeignete Kontrollen einzubeziehen. Dies ermöglicht nicht nur die korrekte Normalisierung der Ergebnisse, sondern auch die Aufklärung eines möglichen Wirkmechanismus Ihrer experimentellen Substanz. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Vaccinia-Virus äußerst gefährlich sein kann; tragen Sie stets die vorgeschriebene persönliche Schutzausrüstung und befolgen Sie die empfohlenen BSL-2-Containment-Techniken.