Dunkelfeldmikroskopie zur Visualisierung der Diffusionsdynamik von Nanostäbchen auf Zellmembran

Um die Diffusionsdynamik von Gold-Nanostäbchen auf einer lebenden Zellmembran mit Hilfe der Dunkelfeldmikroskopie (DFM) in Kombination mit Einzelpartikel-Tracking zu untersuchen, beginnen Sie mit einem sterilisierten Deckglas in einer Kulturschale mit geeignetem Medium. Geben Sie die Zellsuspension auf das Deckglas. Das Medium erleichtert das Zellwachstum.

Inkubieren Sie mit positiv geladenen Gold-Nanostäbchen, die über elektrostatische Wechselwirkungen an der negativ geladenen Zellmembran adsorbieren. Pipettieren Sie das Medium aus der Schale in die Rille eines Objektträgers. Legen Sie das Deckglas mit der Zellseite nach unten auf die Nut und versiegeln Sie es.

Legen Sie den Objektträger auf den Dunkelfeld-Mikroskoptisch. Das Mikroskop beleuchtet die Probe mit einem schrägen Licht mit hohem Winkel, das durch einen speziellen Dunkelfeldkondensator fällt.

Bei der Beleuchtung der Nanostäbchen schwingen die freien Elektronen auf der Nanostäbchenoberfläche mit einer Frequenz, die mit dem einfallenden Licht resonant ist. Die oszillierenden Elektronen streuen Licht bei einer bestimmten Wellenlänge, die von der Objektivlinse erfasst wird, und ermöglichen so die Visualisierung von Nanostäbchen.

In ähnlicher Weise streut die Zellmembran – bestehend aus Lipiden und Proteinen – das einfallende Licht mit einem höheren Brechungsindex als das umgebende Medium, wodurch ein helles Bild vor dunklem Hintergrund entsteht. Erfassen Sie Zeitreihen-DFM-Bilder.

Führen Sie mit einer geeigneten Software eine Einzelpartikel-Tracking-Analyse der DFM-Bilder durch, um die Diffusion der Nanostäbchen durch die Zellmembran mit hoher raumzeitlicher Auflösung zu visualisieren.

Beginnen Sie damit, ein in Ethanol getauchtes Deckglas auf der Flamme zu brennen und das Deckglas in eine 35 x 10 Millimeter große Zellkulturschale mit 2 Millilitern Zellkulturmedium ohne Phenolrot zu legen. Geben Sie 50 Mikroliter der interessierenden Zellsuspension auf das Deckglas und schütteln Sie die Schale vorsichtig hin und her sowie nach links und rechts, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.

Stellen Sie die Schale für etwa 12 Stunden in den Zellkultur-Inkubator, bis die Zellen eine Konfluenz von 20 % bis 40 % erreichen, bevor Sie 20 Mikroliter CTAB-beschichtete Gold-Nanostäbchen in die Schale geben. Stellen Sie die Schale nach leichtem Schütteln, um die Nanostäbchen gleichmäßig über die Schale zu verteilen, 5 Minuten lang in eine befeuchtete Atmosphäre.

Am Ende der Inkubation werden langsam 100 Mikroliter Überstand aus der Schale in die Rille eines Objektträgers überführt und das Deckglas vorsichtig mit der Zellseite nach unten auf die Objektträgerrille gelegt. Versiegeln Sie dann den Rand des Deckglases mit Nagellack und lassen Sie den Nagellack trocknen, bevor Sie den Objektträger auf den Dunkelfeld-Mikroskoptisch legen.

Für die Einzelteilchenverfolgung mittels Dunkelfeldmikroskopie geben Sie einen Tropfen Öl auf den in Öl getauchten Dunkelfeldkondensator und drehen Sie den Knopf, bis der Kondensator den Objektträger berührt. Geben Sie einen Tropfen Öl auf die Oberseite des Deckglases und drehen Sie den Fokussierknopf, bis das 60-fache Ölimmersionsobjektiv das Öl berührt.

Schalten Sie die Lichtquelle ein und drehen Sie den Fokussierknopf leicht, um die Bildebene zu fokussieren. Klicken Sie dann auf das Kamerasymbol in der Mikroskopsoftware, um eine Zeitreihe mit Streulicht mit der Farb-CMOS-Kamera aufzunehmen und das Bild im TIFF-Format zu speichern.

Um eine einzelne Langzeittrajektorie zu extrahieren, öffnen Sie das Bild in ImageJ und klicken Sie auf Bild | Typ | und 8-Bit, um das Bild vom RGB-Modus in den 8-Bit-Modus zu konvertieren. Um den Kontrast anzupassen, klicken Sie auf Bild | Anpassen | Helligkeit | Kontrast und legen Sie die Parameter fest. Wählen Sie ein Zielpartikel aus und verwenden Sie "Strg + X", um den Hintergrund der Zeitreihe abzuschneiden.

Klicken Sie auf Plug-Ins | Partikeltracker Classic | und Partikeltracker, um das Fenster für die Partikelerkennung und Partikelverknüpfung zu öffnen, und legen Sie den Radius auf 6, den Grenzwert auf 0 und das Perzentil auf 0,01 % fest. Stellen Sie den Verknüpfungsbereich auf 10 und die Verschiebung auf 10 ein und klicken Sie auf "OK", um das Ergebnisfenster des Partikeltrackers zu öffnen und die Ergebnisse anzuzeigen.

Klicken Sie auf "Alle Trajektorien visualisieren", um die generierten Trajektorien zu überprüfen. Wenn die softwaregenerierte Flugbahn und die Bewegungsbahn der Gold-Nanostäbchen übereinstimmen, klicken Sie auf "Vollständigen Bericht speichern", um die Ergebnisse zu speichern. Wenn die softwaregenerierte Trajektorie nicht mit der Bewegungsbahn der Gold-Nanostäbchen übereinstimmt, klicken Sie auf "Partikel neu verknüpfen", um die erkannten Partikel mit unterschiedlichen Link-Range- und Perzentil-Parametern neu zu verknüpfen.