Spotvariations-Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie zur Analyse der molekularen Diffusion an der Plasmamembran lebender Zellen
12. November 2020
Dieser Artikel zielt darauf ab, ein Protokoll zum Aufbau eines Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie-Mikroskops (svFCS) zur Messung der molekularen Diffusion an der Plasmamembran lebender Zellen vorzustellen.
Die derzeitige Ansicht der lateralen Organisation der Plasmamembran ist noch unvollständig. Aus diesem Grund ist es wichtig, einige neue innovative Techniken wie die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie mit Punktvariation zu implementieren. Dies ist eine sehr leistungsfähige Technik, die sich durch eine hervorragende zeitliche und räumliche Auflösung auszeichnet.
Darüber hinaus ist es nicht-invasiv und ermöglicht es, Zellmembranen unter physiologischen Bedingungen zu untersuchen. Öffnen Sie jeden Tag, bevor Sie ein Experiment durchführen, alle Irisblenden und verwenden Sie ein Leistungsmesser, um die Laserleistung zu messen, wobei die erste Iris vollständig geöffnet ist. Drehen Sie die halbe Platte, um die maximale Leistung zu ermitteln.
Wenn die Laserleistung geringer als üblich ist, verwenden Sie die Blende, um die Ausrichtung zu überprüfen, und bewegen Sie L1 und M1 abwechselnd, wenn nötig. Notieren Sie sich dann den Energiewert in einem Labornotizbuch. Um den Nachweispfad zu überprüfen, geben Sie Wasser, ein Deckglas und einen Tropfen mit zwei nanomolaren Rhodamin-6G-Lösungen auf das Objektiv.
Starten Sie dann die Korrelatorsoftware und zeichnen Sie die Daten auf. Die Autokorrelationsfunktion sollte ein geringes Rauschen, eine geringe Abfallgröße und eine hohe Zählrate pro Molekül und Sekunde anzeigen. Um die Spotgröße zu kalibrieren, legen Sie ein zellkulturcodiertes Deckglas auf das Wasserimmersionsobjektiv und geben Sie 200 Mikroliter zweier nanomolare Rhodamin-6G-Lösung auf das Deckglas.
Stellen Sie die Leistung des Laserstrahls von 488 Nanometern auf 300 Mikrowatt ein und wählen Sie in der Software den Anschluss des Mikroskops für die Beleuchtungserkennung svFCS aus. Schalten Sie den APD ein und öffnen Sie die Blende, bis ein Signal ertönt, um die minimale Abfallgröße zu erhalten, oder schließen Sie sie für eine größere Abfallgröße. Zeichnen Sie etwa 10 bis 20 Sekunden lange Autokorrelationsfunktionen auf, um die statistische Reproduzierbarkeit zu verbessern und die APD auszuschalten.
In einem geeigneten Datenanalyseprogramm werden die Läufe mit starken Fluktuationen aufgrund molekularer Aggregate überprüft und verworfen, dann der Durchschnitt der beibehaltenen Autokorrelationsfunktion mit einem 3D-Diffusionsmodell angepasst, die durchschnittliche Diffusionszeit aus den Anpassungsparametern extrahiert und die Daten als TXT-Datei gespeichert. Für die svFCS-Analyse stellen Sie den 488-Nanometer-Strahl auf zwei bis vier Mikrowatt ein und äquilibrieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Wählen Sie den Anschluss für das svFCS-Beleuchtungserkennungsmikroskop und auf dem APD aus.
Führen Sie anschließend einen XY-Scan und einen Z-Scan der ausgewählten Zelle durch. Wählen Sie die Plasmamembran am oberen Rand der Zelle aus, um den konfokalen Punkt mit der maximalen Fluoreszenzintensität zu lokalisieren und die Datenerfassung zu starten. Nehmen Sie in der Korrelator-Software eine Serie von 20 Läufen mit fünf Sekunden auf.
Schalten Sie nach der letzten Ausführung den APD aus, und verwerfen Sie alle unerwarteten Ausführungen, wie gezeigt. Passen Sie die Autokorrelationsfunktion "Mittelwert" an ein 2D-Diffusionsmodell mit zwei Spezies an und speichern Sie die Anpassungsparameter in der zuvor gespeicherten TXT-Datei. Wenn alle interessierenden Zellen aufgezeichnet wurden, analysieren Sie mindestens vier Abfallgrößen zwischen 200 und 400 Nanometern, um ein einziges Diffusionsgesetz zu ermitteln.
Wählen Sie dann in MATLAB einen Ordner aus, der alle TXT-Dateien enthält, die mindestens vier Abfallgrößenexperimenten entsprechen, und stellen Sie die Diffusionszeit im Vergleich zum quadratischen Abfall dar. In dieser Abbildung ist ein Diffusionsgesetz für Thy1-GFP zu beobachten, das in Cos7-Zellen exprimiert wird. Das Diffusionsgesetz hat einen positiven Zeit-Null-Wert, was darauf hinweist, dass das Thy1-GFP in Nanodomänenstrukturen der Plasmamembran eingeschlossen ist.
In dieser Analyse führte die Cholesterinoxidase-Behandlung der Zellen, die Thy1-GFP exprimieren, zu einer Verschiebung des Zeit-Null-Wertes des Diffusionsgesetzes auf 7,36 plus oder minus 1,34 Millisekunden. Dies bestätigt, dass die Art des Thy1-GFP-Einschlusses vom Cholesteringehalt abhängt und mit Lipid-Raft-Nanodomänen assoziiert ist. Eine kleine, aber signifikante Abnahme des Gesamtcholesteringehalts wurde auch bei der Behandlung mit Cholesterinoxidase beobachtet.
Da dieses Enzym nur auf den Cholesterinpool wirkt, der an der äußeren Falte der Plasmamembran zugänglich ist, deuten diese Daten darauf hin, dass die beobachtete Abnahme des Cholesterins nur mit der Plasmamembran verbunden ist und eine Destabilisierung der Lipid-Raft-Nanodomänen verursacht. Das Wichtigste bei diesem Verfahren ist die korrekte Kalibrierung des svFCS-Systems und die Vorbereitung der Zellen für die Analyse. svFCS ist ein hervorragendes Werkzeug, um die Organisation der Zellmembran zu untersuchen.
Es kann aber auch verwendet werden, um die Diffusion intrazellulärer Moleküle zu analysieren. Diese Technik kann erfolgreich in der Biomedizin eingesetzt werden, um den Einfluss der potenziellen Medikamente auf lebende Zellen wie Krebszellen zu bestimmen.
Übersicht
In diesem Artikel wird ein Protokoll zur Konstruktion eines Mikroskops für die Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie mit ortsfester Variation (svFCS) zur Messung der molekularen Diffusion an der Plasmamembran lebender Zellen vorgestellt. Die Methode bietet eine hervorragende zeitliche und räumliche Auflösung und ist gleichzeitig nicht invasiv.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Fluoreszenzmikroskopie
Hintergrund
- Die laterale Organisation der Plasmamembran ist noch nicht vollständig verstanden.
- Neuartige Techniken wie die svFCS sind notwendig, um tiefere Einblicke zu gewinnen.
- Die svFCS ermöglicht die Untersuchung von Zellmembranen unter physiologischen Bedingungen.
- Eine sorgfältige Kalibrierung und Zellpräparation sind entscheidend für genaue Ergebnisse.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Protokolls für die svFCS-Mikroskopie.
- Messung der molekularen Diffusion an der Plasmamembran.
- Analyse des Einflusses von Cholesterin auf die Membranorganisation.
Verwendete Methoden
- Kalibrierung des svFCS-Systems mit einer Rhodamin-6G-Lösung.
- Datenerfassung mittels XY- und Z-Scans ausgewählter Zellen.
- Analyse der Diffusionsgesetze mit MATLAB.
- Vergleich der Diffusionsparameter vor und nach der Behandlung mit Cholesterinoxidase.
Hauptergebnisse
- Die Diffusion von Thy1-GFP ist innerhalb von Nano-Domänenstrukturen eingeschränkt.
- Eine Behandlung mit Cholesterinoxidase verändert den Zeit-Null-Wert des Diffusionsgesetzes.
- Es wurde eine Abnahme des gesamten Cholesteringehalts beobachtet.
- Die Studie legt nahe, dass Cholesterin die Stabilität von Lipidrafts beeinflusst.
Schlussfolgerungen
- Die svFCS eignet sich hervorragend zur Untersuchung der Organisation der Zellmembran.
- Mithilfe der Technik kann auch die Diffusion intrazellulärer Moleküle analysiert werden.
- Die Ergebnisse haben Auswirkungen auf das Verständnis der Wirkung von Arzneimitteln auf lebende Zellen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie mit Ortsauflösung (svFCS) ermöglicht eine hochauflösende Analyse der molekularen Diffusion an der Plasmamembran unter physiologischen Bedingungen und liefert entscheidende Erkenntnisse zur Organisation der Membran und zur Dynamik von Lipidrafts. Diese Fähigkeit unterstützt die Zielvalidierung, indem sie den biophysikalischen Kontext membranassoziiierter Proteine aufklärt, und trägt so zur mechanistischen Entschärfung von Risiken in der frühen Entdeckung bei. Die nichtinvasive Natur der Methode sowie ihre Verträglichkeit mit lebenden Zellen erhöhen ihre Nützlichkeit in präklinischen Screenings und translationalen Biomarker-Studien.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem das Diffusionsverhalten von Membranproteinen wie Thy1-GFP innerhalb von Nanodomänen quantifiziert wird.
- Operativer Wert: Zeigt cholesterolabhängige Einschränkung auf und ermöglicht die funktionelle Validierung von Assoziationen mit Lipidrafts.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem Ziele identifiziert werden, deren Membranlokalisation empfindlich gegenüber Störungen der Lipidumgebung ist.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte biologische Systeme für die Wirkstoff-Screening vor, indem unter physiologischen Bedingungen Baseline-Diffusionsgesetze etabliert werden.
- Quantitative Ausgabe: Erzeugt reproduzierbare Diffusionszeitmessungen über verschiedene Strahltaille-Größen hinweg und unterstützt damit die Assay-Standardisierung.
- Relevanz für das Screening: Erkennt durch Verbindungen hervorgerufene Verschiebungen der Diffusionsparameter, die auf Veränderungen der Membranorganisation oder einer Zielstrukturenbindung hinweisen.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Modelliert die Störung von Nanodomänen in der Plasmamembran-Raft, die für Pathologien mit Lipid-Dysregulation relevant ist.
- Translationale Kontinuität: Verbindet Beobachtungen aus der frühen Entdeckungsphase mit der präklinischen Validierung, indem gezeigt wird, wie Umweltstörungen (z. B. Cholesterinmodulation) das Target-Verhalten verändern.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Liefert mechanistische Endpunkte, die Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch auf Grundlage der Resistenz des Targets gegenüber Membranstörungen unterstützen.
Pipeline- und Workflow-Integration
svFCS fügt sich in die Entdeckungskette von der Testung von Zielhypothesen über die Identifizierung von Leitverbindungen bis hin zur präklinischen Validierung ein und bietet eine biophysikalische Charakterisierungsebene, die biochemische und phänotypische Assays ergänzt.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch Messung von Diffusionskoeffizienten und Identifizierung eingeschränkt beweglicher versus mobiler molekularer Populationen.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft von Assays durch standardisierte Kalibrierung mit Rhodamin 6G und Überprüfung der Integrität des Detektionspfads.
- Analytik: Liefert quantitative Diffusionsgesetze durch MATLAB-Analyse von Autokorrelationsfunktionen und ermöglicht den Vergleich des molekularen Verhaltens unter verschiedenen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet Veränderungen in der Membranorganisation mit funktionellen Ergebnissen und unterstützt die Abstimmung von Biomarkern, wenn Diffusionsverschiebungen mit phänotypischen Reaktionen korrelieren.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Untersuchung der Dynamik von Membranproteinen über mehrere Zielstrukturen und Zelllinien hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem er die nanoskalige Einschränkung und Diffusionsheterogenität an der Plasmamembran auflöst.
- Operationaler Wert: Stellt die Reproduzierbarkeit sicher durch standardisierte Kalibrierung der Laserleistung, Überprüfung der Detektionswege und Mittelung mehrfacher Autokorrelationsfunktionen.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem er die Stabilität von Zielstrukturen in naturnahen Membranumgebungen quantifiziert und so späte Ausscheidungen aufgrund unvorhergesehener biophysikalischer Probleme reduziert.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf ihrer Abhängigkeit von der Integrität lipidreicher Mikrodomänen für korrekte Lokalisation und Funktion.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Fluoreszenzmikroskopie, Lasersicherheit und der Analyse von Korrelationsspektroskopiedaten.
- Benötigt ein speziell angepasstes Fluoreszenzmikroskop mit Avalanche-Photodioden (APD), Korrelator-Software und präziser Kontrolle der Laserleistung (2–4 µW für svFCS-Messungen).
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg voraus, sowohl bei Kalibrierungsprotokollen (z. B. Validierung der Spotgröße mit Rhodamin 6G) als auch bei Datenanalyse-Pipelines (z. B. MATLAB-gestützte Anpassung von 2D-Diffusionsmodellen).
- Beinhaltet Anpassungen für verschiedene Membranproteine, Zelltypen und Störstoffe, die über Cholesterinoxidase hinausgehen.
- Ist eingeschränkt durch den hohen Anspruch an die Probenvorbereitung, um molekulare Aggregate zu vermeiden und die physiologische Relevanz während der Gleichgewichtseinstellung bei 37 °C sicherzustellen.
