Spotvariations-Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie zur Analyse der molekularen Diffusion an der Plasmamembran lebender Zellen

Die derzeitige Ansicht der lateralen Organisation der Plasmamembran ist noch unvollständig. Aus diesem Grund ist es wichtig, einige neue innovative Techniken wie die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie mit Punktvariation zu implementieren. Dies ist eine sehr leistungsfähige Technik, die sich durch eine hervorragende zeitliche und räumliche Auflösung auszeichnet.

Darüber hinaus ist es nicht-invasiv und ermöglicht es, Zellmembranen unter physiologischen Bedingungen zu untersuchen. Öffnen Sie jeden Tag, bevor Sie ein Experiment durchführen, alle Irisblenden und verwenden Sie ein Leistungsmesser, um die Laserleistung zu messen, wobei die erste Iris vollständig geöffnet ist. Drehen Sie die halbe Platte, um die maximale Leistung zu ermitteln.

Wenn die Laserleistung geringer als üblich ist, verwenden Sie die Blende, um die Ausrichtung zu überprüfen, und bewegen Sie L1 und M1 abwechselnd, wenn nötig. Notieren Sie sich dann den Energiewert in einem Labornotizbuch. Um den Nachweispfad zu überprüfen, geben Sie Wasser, ein Deckglas und einen Tropfen mit zwei nanomolaren Rhodamin-6G-Lösungen auf das Objektiv.

Starten Sie dann die Korrelatorsoftware und zeichnen Sie die Daten auf. Die Autokorrelationsfunktion sollte ein geringes Rauschen, eine geringe Abfallgröße und eine hohe Zählrate pro Molekül und Sekunde anzeigen. Um die Spotgröße zu kalibrieren, legen Sie ein zellkulturcodiertes Deckglas auf das Wasserimmersionsobjektiv und geben Sie 200 Mikroliter zweier nanomolare Rhodamin-6G-Lösung auf das Deckglas.

Stellen Sie die Leistung des Laserstrahls von 488 Nanometern auf 300 Mikrowatt ein und wählen Sie in der Software den Anschluss des Mikroskops für die Beleuchtungserkennung svFCS aus. Schalten Sie den APD ein und öffnen Sie die Blende, bis ein Signal ertönt, um die minimale Abfallgröße zu erhalten, oder schließen Sie sie für eine größere Abfallgröße. Zeichnen Sie etwa 10 bis 20 Sekunden lange Autokorrelationsfunktionen auf, um die statistische Reproduzierbarkeit zu verbessern und die APD auszuschalten.

In einem geeigneten Datenanalyseprogramm werden die Läufe mit starken Fluktuationen aufgrund molekularer Aggregate überprüft und verworfen, dann der Durchschnitt der beibehaltenen Autokorrelationsfunktion mit einem 3D-Diffusionsmodell angepasst, die durchschnittliche Diffusionszeit aus den Anpassungsparametern extrahiert und die Daten als TXT-Datei gespeichert. Für die svFCS-Analyse stellen Sie den 488-Nanometer-Strahl auf zwei bis vier Mikrowatt ein und äquilibrieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Wählen Sie den Anschluss für das svFCS-Beleuchtungserkennungsmikroskop und auf dem APD aus.

Führen Sie anschließend einen XY-Scan und einen Z-Scan der ausgewählten Zelle durch. Wählen Sie die Plasmamembran am oberen Rand der Zelle aus, um den konfokalen Punkt mit der maximalen Fluoreszenzintensität zu lokalisieren und die Datenerfassung zu starten. Nehmen Sie in der Korrelator-Software eine Serie von 20 Läufen mit fünf Sekunden auf.

Schalten Sie nach der letzten Ausführung den APD aus, und verwerfen Sie alle unerwarteten Ausführungen, wie gezeigt. Passen Sie die Autokorrelationsfunktion "Mittelwert" an ein 2D-Diffusionsmodell mit zwei Spezies an und speichern Sie die Anpassungsparameter in der zuvor gespeicherten TXT-Datei. Wenn alle interessierenden Zellen aufgezeichnet wurden, analysieren Sie mindestens vier Abfallgrößen zwischen 200 und 400 Nanometern, um ein einziges Diffusionsgesetz zu ermitteln.

Wählen Sie dann in MATLAB einen Ordner aus, der alle TXT-Dateien enthält, die mindestens vier Abfallgrößenexperimenten entsprechen, und stellen Sie die Diffusionszeit im Vergleich zum quadratischen Abfall dar. In dieser Abbildung ist ein Diffusionsgesetz für Thy1-GFP zu beobachten, das in Cos7-Zellen exprimiert wird. Das Diffusionsgesetz hat einen positiven Zeit-Null-Wert, was darauf hinweist, dass das Thy1-GFP in Nanodomänenstrukturen der Plasmamembran eingeschlossen ist.

In dieser Analyse führte die Cholesterinoxidase-Behandlung der Zellen, die Thy1-GFP exprimieren, zu einer Verschiebung des Zeit-Null-Wertes des Diffusionsgesetzes auf 7,36 plus oder minus 1,34 Millisekunden. Dies bestätigt, dass die Art des Thy1-GFP-Einschlusses vom Cholesteringehalt abhängt und mit Lipid-Raft-Nanodomänen assoziiert ist. Eine kleine, aber signifikante Abnahme des Gesamtcholesteringehalts wurde auch bei der Behandlung mit Cholesterinoxidase beobachtet.

Da dieses Enzym nur auf den Cholesterinpool wirkt, der an der äußeren Falte der Plasmamembran zugänglich ist, deuten diese Daten darauf hin, dass die beobachtete Abnahme des Cholesterins nur mit der Plasmamembran verbunden ist und eine Destabilisierung der Lipid-Raft-Nanodomänen verursacht. Das Wichtigste bei diesem Verfahren ist die korrekte Kalibrierung des svFCS-Systems und die Vorbereitung der Zellen für die Analyse. svFCS ist ein hervorragendes Werkzeug, um die Organisation der Zellmembran zu untersuchen.

Es kann aber auch verwendet werden, um die Diffusion intrazellulärer Moleküle zu analysieren. Diese Technik kann erfolgreich in der Biomedizin eingesetzt werden, um den Einfluss der potenziellen Medikamente auf lebende Zellen wie Krebszellen zu bestimmen.