Name: Spotvariations-Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie zur Analyse der molekularen Diffusion an der Plasmamembran lebender Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Erfahren Sie, wie Spotvariations-Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (svFCS) zur Analyse der molekularen Diffusion an der Plasmamembran lebender Zellen eingesetzt wird. Diese nicht-invasive Methode ermöglicht die Untersuchung von Membranorganisation und Cholesterin-Einfluss.

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SB, SM und DM wurden durch institutionelle Mittel des CNRS, des Inserm und der Universität Aix-Marseille sowie durch Programmzuschüsse der französischen Nationalen Forschungsagentur (ANR-17-CE15-0032-01 und ANR-18-CE15-0021-02) und des französischen "Investissement d'Avenir" (ANR-10-INBS-04 France-BioImaging, ANR-11-LABX-054 labex INFORM) unterstützt. Die KW würdigen "BioTechNan", ein Programm interdisziplinärer Umweltdoktoranden KNOW im Bereich Biotechnologie und Nanotechnologie. EB würdigt die finanzielle Unterstützung des Nationalen Wissenschaftszentrums Polens (NCN) im Rahmen des Projekts Nr. 2016/21/D/NZ1/00285 sowie der französischen Regierung und der französischen Botschaft in Polen. MŁ würdigt die finanzielle Unterstützung des polnischen Entwicklungsministeriums (CBR POIR.02.01.00-00-0159/15-00/19) und des Nationalen Zentrums für Forschung und Entwicklung (Innochem POIR.01.02.00-00-0064/17). TT würdigt die finanzielle Unterstützung des Nationalen Wissenschaftszentrums Polens (NCN) im Rahmen des Projekts Nr. 2016/21/B/NZ3/00343 und des Breslauer Biotechnologiezentrums (KNOW).

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier haben wir die Implementierung des svFCS-Moduls auf einem Standard-Fluoreszenzmikroskop beschrieben, einem leistungsstarken experimentellen Ansatz zur Entschlüsselung der Dynamik der Plasmamembranorganisation in lebenden Zellen dank der FCS-Diffusionsgesetzanalyse. Konzeptionell basiert das svFCS auf einem einfachen Prinzip: Korrelationsmessungen der Fluoreszenz im Zeitbereich bei gleichzeitiger Variation der Größe der Beleuchtungsfläche23. Diese Strategie war maßgeblich an der Ableitung nanoskopischer Informationen aus mikroskopischen Messungen beteiligt, die dazu beitragen, die wichtigsten physikalisch-chemischen Elemente, die zur Plasmamembranorganisation im stationären Zustand25 und physiologischen Prozessen30,31,32,33 beitragen, zu entschlüsseln. Insgesamt zeigen diese svFCS-Analysen eindeutig die Existenz lipidabhängiger Nanodomänen in verschiedenen Zelltypen und deren direkte Auswirkungen auf die Abstimmung verschiedener Signalereignisse.
In diesem Rahmen gibt es einige optische Aspekte, die beim Aufbau des svFCS-Setups berücksichtigt werden müssen, um das Photonenbudget zu optimieren und optische Aberrationen zu minimieren. Daher empfehlen wir, ein Mikroskop zu verwenden, aus dem die Röhrchenlinse entfernt werden kann, wenn die svFCS-Messung durchgeführt wird. Darüber hinaus spielt eine einzelne Blende eine Schlüsselrolle im svFCS-Aufbau: Sie verändert die Strahlgröße an der hinteren Blende des Objektivs und variiert so direkt die effektive Taillengröße (d.h. das effektive Anregungsvolumen). Der Strahldurchmesser sollte zur objektiven Rückenpupille passen, um die kleinste Taillengröße34 zu erhalten. Diese Option, die hilft, die Taillengröße abzustimmen, sorgt für eine Optimierung des Photonenbudgets und ist einfach zu implementieren. Schließlich wird eine minimale Anzahl von optischen Teilen entlang des Lichtweges verwendet; Je weniger komplex das System, desto weniger Photonen gehen verloren. All diese Optionen verbessern die Robustheit von svFCS-Experimenten erheblich.
In Bezug auf das Protokoll selbst müssen einige kritische Schritte beachtet werden. Am wichtigsten ist eine angemessene Ausrichtung der optischen Pfade, die für erfolgreiche svFCS-Messungen entscheidend ist (Protokoll, Abschnitt 2). Dies ist leicht zu überprüfen, indem das Fluoreszenzsignal einer 2 nM Rh6G-Lösung analysiert wird, die unter 300 μW Laserbeleuchtung ~ 200 kHz betragen sollte. Alle Iris sollten geöffnet werden, und die ACFs sollten eine wichtige Amplitude haben (typischerweise G0 ~ 1,5-2,0). Ein weiterer kritischer Punkt betrifft die Zellen und ihre Vorbereitung für die svFCS-Analyse (Protokoll, Abschnitte 4–8). Ihre Dichte muss angepasst werden, damit isolierte Zellen, die beobachtet werden sollen, für die Analyse zur Verfügung stehen. Nicht adhärente Zellen müssen auf einem gekammerten Deckglas unter Verwendung von Poly-L-Lysin-Lösung immobilisiert werden. Das Fluoreszenzsignal der Zellmarkierung sollte nicht zu stark sein, da dies sonst zu sehr flachen ACFs führt, die schwer zu montieren sind, und die Anpassungsparameter sind mit einem wichtigen Fehler belastet. Darüber hinaus machen inhomogene Markierungs- und Fluoreszenzaggregate in Zellen die Interpretation der svFCS-Messungen extrem schwierig. Schließlich beeinflusst die Behandlung mit Cholesterinoxidase die Zelllebensfähigkeit, und die svFCS-Analyse sollte eine Stunde nach der Behandlung nicht überschreiten. Es ist auch besser, die Fluoreszenzschwankungen von der oberen Plasmamembran aufzuzeichnen, da sie nicht an den Träger gebunden ist und aufgrund der physikalischen Wechselwirkungen mit dem Träger keine Gefahr einer gehinderten Diffusion von Molekülen besteht.
Es gab genügend Fortschritte in der svFCS-Technik für ihre Verwendung in verschiedenen Ansätzen aufgrund der Vielfalt der Modalitäten zur Anpassung des Nachweisvolumens, die es ermöglichen, verschiedene biologische Prozesse in lebenden Zellen zu untersuchen. Eine Alternative zur Einstellung der Größe des Anregungsvolumens ist die Verwendung eines variablen Strahlexpanders35. Es ist auch möglich, die Größe der Beleuchtungsfläche einfach zu modulieren, indem das Fluoreszenzsignal vom Abfang der Plasmamembran entlang der z-Richtung36 aufgezeichnet wird. Dies kann an einem Standard-Konfokalmikroskop erfolgen, für das ein theoretischer Rahmen entwickelt wurde, um das Diffusionsgesetz37,38 abzuleiten.
Obwohl die svFCS-Methode eine räumlich-zeitliche Auflösung bietet, die für die Charakterisierung der inhomogenen lateralen Organisation der Plasmamembran notwendig ist, schließen sich die geometrischen Einschlussmodi nicht gegenseitig aus. Eine Abweichung von t0 in die eine oder andere Richtung offenbart ausschließlich eine dominante Einschließungsart25. Darüber hinaus ergibt sich eine weitere wichtige Einschränkung der vorliegenden svFCS-Methode aus der klassischen optischen Beugungsgrenze (~200 nm). Dies ist zweifellos größer als die Domänen, die die Moleküle in der Zellplasmamembran einschließen. Daher wird die Analyse des Einschlusses aus dem t 0-Wert abgeleitet, extrapoliert aus dem Diffusionsgesetz.
Dieser Nachteil wurde durch die Implementierung alternativer Methoden überwunden. Zunächst bot die Verwendung von Metallfilmen, die mit Nanoaperturen gebohrt wurden, die Möglichkeit, einen sehr kleinen Membranbereich (d. h. unterhalb der optischen Beugungsgrenze einzelner nanometrischer Aperturen mit Radien zwischen 75 und 250 nm) zu beleuchten39. Das aus dem theoretischen Diffusionsgesetz für isolierte Domänenorganisation vorhergesagte Übergangsregime wurde somit berichtet und ermöglichte eine Verfeinerung der charakteristischen Größe der nanometrischen Membranheterogenitäten und eine quantitative Schätzung der Oberfläche lipidabhängiger Nanodomänen39. Alternativ wurde die nanometrische Beleuchtung auch mit Hilfe der optischen Nahfeld-Rastermikroskopie40 oder der planaren optischen Nanoantennen41 entwickelt. In jüngerer Zeit hat die Kombination von stimulierter Emissionsverarmung (STED) und FCS ein leistungsfähiges und empfindliches Werkzeug zur Dokumentation des Diffusionsgesetzes mit sehr hoher räumlicher Auflösung bereitgestellt. Dieses STED-FCS ermöglicht den Zugang zu molekularen Diffusionseigenschaften auf einer Nanoskala, die innerhalb kurzer Zeit auftreten, und ermöglicht die Untersuchung der dynamischen Organisation von Lipidsonden an der Plasmamembran42,43. Die unvollständige Unterdrückung der Fluoreszenz im STED-Prozess stellt jedoch die Analyse der Autokorrelationskurven in FCS in Frage.
Um diese Schwierigkeit zu überwinden, wurde ein neues Anpassungsmodell entwickelt, das die Genauigkeit der Diffusionszeiten und der durchschnittlichen Molekülzahlenmessungenverbessert 44. Für die langsame molekulare Diffusion an der Plasmamembran schließlich kann das svFCS-Prinzip auf Daten angewendet werden, die mittels Bildkorrelationsspektroskopie45 aufgezeichnet wurden. Kürzlich wurde gezeigt, dass die Kombination der Rasterkraftmikroskopie (AFM) mit der Abbildung von Total Internal Reflection-FCS (ITIR-FCS) zur Verfeinerung der Art des Mechanismus beiträgt, der die molekulare Diffusion an der Plasmamembran behindert, insbesondere in der Nähe der Perkolationsschwellenmembrankonfiguration aufgrund einer hohen Dichte von Nanodomänen46.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Etablierung des Diffusionsgesetzes durch svFCS den experimentellen Beweis erbracht hat, um auf lokale Heterogenität zu schließen, die durch dynamische kollektive Lipide und die Assoziationen von Membranproteinen erzeugt wird. Wie Wohland und seine Mitarbeiter46 feststellten, "bleibt die FCS-Diffusionsrechtsanalyse ein wertvolles Werkzeug, um strukturelle und organisatorische Merkmale unterhalb der Lösungsgrenze aus dynamischen Informationen abzuleiten". Dennoch müssen wir neue Modelle entwickeln, um die Interpretation des Diffusionsgesetzes zu verfeinern, die ein besseres Verständnis der Dynamik der molekularen Ereignisse an der Plasmamembran ermöglichen sollten.

Die Komplexität der Plasmamembranorganisation Das aktuelle Verständnis der Zellmembranorganisation muss mehrere Aspekte berücksichtigen1. Erstens variiert eine komplexe Lipidzusammensetzung nicht nur zwischen den Zelltypen, sondern auch innerhalb einer einzelnen Zelle (Membranorganellen/Plasmamembran). Außerdem sind assoziierte oder intrinsische Membranproteine meist in dynamischen multimeren Komplexen organisiert, wobei sich große Domänen außerhalb der Membran erstrecken und eine deutlich größere Fläche ausmachen als die der Transmembrandomänen allein. Darüber hinaus weisen membranassoziierte Proteine spezifische lipidbindende oder lipidwechselwirkende Fähigkeiten auf, die bei der Regulierung der Proteinfunktion eine Rolle spielen. Diese hängen direkt von der lokalen Zusammensetzung und Zugänglichkeit der Lipideab 2.
Schließlich wird ein signifikantes Maß an Asymmetrie zwischen zwei Membranblättchen aufgrund der intrinsischen asymmetrischen Struktur von Membranproteinen und der Verteilung von Lipiden beobachtet. Tatsächlich erzeugt ein lipidmetabolisches Gleichgewicht zwischen Synthese und Hydrolyse, kombiniert mit einem Lipid-Flip-Flop zwischen den Blättchen, eine solche asymmetrische Verteilung. Da jeder Transport über die Doppelschicht durch die freie Energie eingeschränkt wird, die benötigt wird, um die polare Kopfgruppe durch das hydrophobe Innere der Membranen zu bewegen, wird er normalerweise von selektiven Transportern unterstützt. Für jeden Zelltyp wird die Asymmetrie tendenziell fest aufrechterhalten. Insgesamt tragen diese Faktoren zur lateralen Inhomogenität oder Kompartimentierung der Plasmamembranbei 3,4.
Wir bereichern diese Darstellung der Plasmamembran unter Berücksichtigung der intrinsischen molekularen Diffusion innerhalb und über die Doppelschicht, die zur dynamischen lateralen Heterogenität auf einer Skala von Zehnteln bis Hunderten von Nanometern und Mikrosekunden bis Sekunden beiträgt. Zum Beispiel tragen lipidabhängige Membran-Nanodomänen – die sogenannten Lipid-Flöße, definiert als Cholesterin, und Sphingolipid-reiche Signalplattformen – zur Kompartimentierung der Plasmamembranbei 5,6. Die derzeitige Sicht der Membranorganisation ist jedoch nicht nur auf Lipidflöße beschränkt. Membran-Nanodomänen sind komplexer und heterogener in Zusammensetzung, Ursprung und Funktion. Dennoch muss ihre Anwesenheit an der Plasmamembran eng koordiniert werden, und dynamische Wechselwirkungen zwischen Proteinen und Lipiden scheinen für die räumliche Verteilung und chemische Modifikation von Membran-Nanodomänenwichtig zu sein 1,3,7,8.
Das svFCS-Prinzip und seine Anwendung zur Untersuchung der Organisation der Plasmamembran Obwohl bei der Analyse von Membrandomänen, hauptsächlich durch biophysikalische Techniken, große Fortschritte erzielt wurden, müssen die Determinanten, die die lokale Organisation der Plasmamembran bestimmen, mit angemessener räumlicher und zeitlicher Auflösung verfeinert werden. Determinanten, die auf der Verfolgung einzelner Moleküle basieren, bieten eine ausgezeichnete räumliche Präzision und ermöglichen die Charakterisierung verschiedener Bewegungsmodi 9,10,11,12, haben jedoch eine begrenzte zeitliche Auflösung mit klassisch niedrigen Kamerabildraten und erfordern mehr experimentellen Aufwand, um eine signifikante Anzahl von Trajektorien aufzuzeichnen. Alternativ kann der Diffusionskoeffizient von Membrankomponenten durch Fluoreszenzrückgewinnung nach Photobleichen (FRAP)13 oder Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS)14 bewertet werden. Letzteres hat mehr Aufmerksamkeit erhalten, vor allem wegen seiner hohen Empfindlichkeit und Selektivität, seines mikroskopischen Detektionsvolumens, seiner geringen Invasivität und seines großen Dynamikbereichs15.
Die konzeptionelle Grundlage von FCS wurde von Magde und Kollegen vor etwa 50 Jahren 16,17 eingeführt. Es basiert auf der Erfassung der Fluktuation der Fluoreszenzemission mit einer hohen zeitlichen Auflösung (von μs bis s)18. In seiner modernen Version werden Messungen in lebenden Zellen durch ein kleines konfokales Anregungsvolumen (~ 0,3 Femtoliter) durchgeführt, das in einem interessierenden Bereich (z. B. an der Plasmamembran) positioniert ist. Das Fluoreszenzsignal, das durch die Diffusion fluoreszierender Moleküle erzeugt wird, die in das Beobachtungsvolumen ein- und ausgehen, wird mit sehr hoher zeitlicher Auflösung (d.h. der Ankunftszeit jedes Photons auf dem Detektor) gesammelt. Dann wird das Signal berechnet, um die Autokorrelationsfunktion (ACF) zu erzeugen, aus der die durchschnittliche Zeit td (Diffusionszeit), für die ein Molekül innerhalb des Fokusvolumens bleibt, zusammen mit der mittleren Anzahl von Teilchen (N) extrahiert wird, die im Beobachtungsvolumen vorhanden sind, das umgekehrt proportional zur Amplitude des ACF ist. Dieser letzte Parameter könnte eine nützliche Information über die Molekülkonzentration innerhalb des Beobachtungsvolumens sein.
Seitdem wurde eine wachsende Anzahl von FCS-Modalitäten dank der sich schnell entwickelnden Instrumentierung in der Biophotonik implementiert, die die Beschreibung dynamischer Phänomene in lebenden Systemen ermöglicht. Dennoch würde eine molekulare Spezies eine überlappendere Verteilung der Diffusionskoeffizientenwerte erfahren, was sich normalerweise in einer anomalen Diffusionseigenschaft widerspiegelt, in der Moleküle mit einer nichtlinearen Beziehung in der Zeit19 diffundieren, und Schwierigkeiten, die biologische Bedeutung dieser anomalen Subdiffusion zu identifizieren. In der Vergangenheit wurde diese Schwierigkeit etwas überwunden, indem die molekulare Diffusion durch FRAP aus Gebieten unterschiedlicher Größe und nicht nur aus einem Bereich aufgezeichnet wurde, wodurch zusätzliche räumliche Informationen bereitgestellt wurden. Dies ermöglichte beispielsweise die Konzeptualisierung von Membranmikrodomänen20,21,22.
Eine Übersetzung dieser Strategie auf FCS-Messungen (d.h. die sogenannte Spotvariation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS)) wurde durch Variation der Größe des Fokusvolumens der Beobachtung etabliert, so dass die Fluktuation der Fluoreszenz auf verschiedenen räumlichen Skalen aufgezeichnet werdenkann 23. Somit liefert der svFCS-Ansatz indirekte räumliche Informationen, die die Identifizierung und Bestimmung molekularer Diffusionsmoden und der Art der Membranpartitionierung (isolierte versus zusammenhängende Domänen24) von untersuchten Molekülen ermöglichen. Durch die Darstellung der Diffusionszeit td als Funktion der verschiedenen räumlichen Skalen, die durch den Taillenwert (ω) definiert sind, der der Größe des Detektionsstrahlradius in diesem Fall23,25 entspricht, kann man das Diffusionsgesetz eines gegebenen Moleküls in einem gegebenen physiologischen Zustand charakterisieren. Das svFCS ist daher ein perfektes Analogon zur Einzelpartikelverfolgung im Zeitbereich26. Unter der Brownschen Diffusionsbeschränkung sollte man eine streng lineare Beziehung zwischen der Diffusionszeit td und der Taille ω erwarten (Abbildung 1)23,25. Der Ursprung der Abweichung des Diffusionsgesetzes von diesem Schema kann auf nicht-exklusive Gründe wie Zytoskelettgeflecht, molekulares Crowding, dynamische Partitionierung in Nanodomänen oder eine Kombination dieser und anderer Effekte zurückgeführt werden (Abbildung 1) und muss experimentell getestetwerden 25.
Hier bieten wir alle notwendigen Kontrollpunkte für den täglichen Gebrauch eines maßgeschneiderten optischen Systems svFCS, das von Grund auf neu entwickelt wurde und unsere bisherigen Protokollüberprüfungen27,28 zu diesem experimentellen Ansatz ergänzt. Darüber hinaus geben wir als Machbarkeitsnachweis Richtlinien für die Kalibrierung des Aufbaus, die Vorbereitung von Zellen, die Datenerfassung und die Analyse zur Etablierung des svFCS-Diffusionsgesetzes (DL) für Thy1-GFP, ein Plasmamembran-Glykosylphosphatidylinositol-verankertes Protein, von dem bekannt ist, dass es in Lipid-Floß-Nanodomänen lokalisiert ist29. Schließlich zeigen wir, wie sich die partielle Destabilisierung von Lipid-Floß-Nanodomänen durch Cholesterinoxidase-Behandlung auf die Diffusionseigenschaften von Thy1-GFP auswirkt. Darüber hinaus finden Sie eine detaillierte Beschreibung des Erstellens eines svFCS-Setups von Grund auf im Ergänzungsmaterial.

<table><tbody><tr><td>Aligment Werkzeug</td><td>Schlüsselschlüssel für SM1-Gewindesicherungsringe</td><td>Thorlabs</td><td>SPW602</td></tr><tr><td>Avalanche Photodiode und Single Photon Counting Module (SPCM)</td><td>Single-Photon Counting Module, Avalanche Photodiode</td><td>Excelitas</td><td>SPCM-AQRH-15</td></tr><tr><td></td><td>BNC 50 &Omega; Stecker auf 50 &Omega; Steckerkabel 2 m</td><td>RS Komponenten</td><td>742-4315</td></tr><tr><td></td><td>Koaxialkabel 415 Cinch Steckverbinder, RG-316, 50 &Omega; Mit Stecker, 1,22 m, RoHS2</td><td>RS Komponenten</td><td>885-8172</td></tr><tr><td></td><td>T-Stück 50&Omega; HF-Adapter BNC-Stecker auf BNC-Buchse 0 &rarr; 1GHz</td><td>RS Komponenten</td><td>546-4948</td></tr><tr><td></td><td>Brennenstuhl 2,5 m, 8 Sockel Typ E &ndash; Französisches Verlängerungskabel, 230 V</td><td>RS Komponenten</td><td>768-5500</td></tr><tr><td></td><td>Maskottchen, 6W Plug-In-Netzteil 5V dc, 1,2A, 1 Ausgang Schaltnetzteil, Typ C</td><td>RS Komponenten</td><td>452-8394</td></tr><tr><td></td><td>Crystek CCSMACL-MC-24 Referenzoszillator Stromkabel HF-Adapter</td><td>RS Komponenten</td><td>792-4079</td></tr><tr><td>Fluoreszenzfilterung</td><td>535/70 ET Bandpass, AOI 0&deg; Chroma Durchmesser 25 mm</td><td>AHF Filter</td><td>F47-539</td></tr><tr><td></td><td>Laser Strahlteiler zt488 RDC, AOI 45&deg; Chroma 25,5 x 36 x 1 mm</td><td>AHF-Filter</td><td>F43-088</td></tr><tr><td></td><td>496/LP BrightLine HC Langpassfilter, AOI 0&deg; Chroma Durchmesser 25</td><td>AHF Filter</td><td>F37-496</td></tr><tr><td>Hardware-Korrelator</td><td>80 MHz Digitaler Korrelator</td><td>Correlator.com</td><td>Flex02-12D</td></tr><tr><td>Laser</td><td>LASER LASOS LDM-XT Faser gekoppelt, 488 nm, 65 mW</td><td>Lasos</td><td>BLD-XT 488100</td></tr><tr><td>Lasersicherheit</td><td>High-Performance Schwarzes Abdeckband, 1" x 180' (25 mm x 55 m) Rolle</td><td>Thorlabs</td><td>T743-2.0</td></tr><tr><td></td><td>Linsengewebe, 25 Blatt pro Heftchen, 5 Heftchen</td><td>Thorlabs</td><td>MC-5</td></tr><tr><td></td><td>Laserschutzbrille, hellorangefarbene Gläser, 48 % Durchlässigkeit für sichtbares Licht</td><td>Thorlabs</td><td>LG3B</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss Axiovert 200M Motorisiertes inverses Fluoreszenzmikroskop Fein- und Grobfokussierung, Drehung des Reflektorrevolvers, Drehung des Objektivrevolvers, Umschalten der Kameraanschlüsse und interne Lichtverschlüsse</td><td>Carl Zeiss</td><td></td></tr><tr><td></td><td>C-Apochromat 40x/1,2 W Korr.selected für FCS (D=0,14-0,19 mm) (WD=0,28 mm bei D=0,17 mm), UV-VIS-IR</td><td>Carl Zeiss</td><td>421767-9971-711</td></tr><tr><td></td><td>Adapter W0,8 / M27x0,75 H "5"</td><td>Carl Zeiss</td><td>000000-1698-345</td></tr><tr><td></td><td>Mittelring W0,8 - W0,8 H "5"</td><td>Carl Zeiss</td><td>000000-1698-347</td></tr><tr><td>Optischer Weg</td><td>D25,4mm Spiegel, geschützt Silber</td><td>Thorlabs</td><td>Artikel-Nr.: PF10-03-P01</td></tr><tr><td></td><td>D25,4 mm, F=60,0 mm, sichtbarer Achromat</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-060-A</td></tr><tr><td></td><td>D25,4 mm, F=35,0 mm, Sichtbarer Achromat</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-035-A</td></tr><tr><td></td><td>25 & Mikro; Thorlabs</td><td></td><td>P25S I</td></tr><tr><td></td><td>25.4mm Mounted Zero, Order 1/2 Waveplate 488 nm</td><td>Thorlabs</td><td>WPH10M-488 (HWP)</td></tr><tr><td></td><td>20mm Polarisationsstrahlteiler Cube 420-680 nm</td><td>Thorlabs</td><td>PBS201</td></tr><tr><td></td><td>Rotationstisch 56 mm x 26 mm Gewinde</td><td>ID Thorlabs</td><td>RSP1/M</td></tr><tr><td></td><td>52 mm x 52 mm Kinematische Plattformhalterung</td><td>Thorlabs</td><td>KM100B/M</td></tr><tr><td></td><td>Verstellbare Prismenklemme</td><td>Thorlabs</td><td>PM3/M</td></tr><tr><td></td><td>Strahlblock - aktive Fläche 19 mm x 38 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LB1/M</td></tr><tr><td></td><td>Irisblende 1 mm bis 25 mm Apertur</td><td>Thorlabs</td><td>ID25/M</td></tr><tr><td></td><td>Linkshänder Kinematische zylindrische Objektivhalterung</td><td>Thorlabs</td><td>KM100CL</td></tr><tr><td>1"</td><td></td> Optikhalter, M4 Tap <td>Thorlabs</td><td>MFF101/M</td></tr><tr><td></td><td>1" Stapelbarer Objektivtubus</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L03</td></tr><tr><td></td><td>Stapelbarer Objektivanschluss für 1" optisch nutzbare Tiefe &frac12;</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L05</td></tr><tr><td></td><td>Stapelbare Objektivhalterung für 1" optisch nutzbare Tiefe 2"</td> <td>Thorlabs</td><td>SM1L20</td></tr><tr><td></td><td>Kleine optische Schienen 600mm, metrisch</td><td>Thorlabs</td><td>RLA600/M</td></tr><tr><td></td><td>Kleine optische Schienen 75mm, metrisch</td><td>Thorlabs</td><td>RLA075/M</td></tr><tr><td></td><td>Kleine optische Schienen 150mm, metrisch</td><td>Thorlabs</td><td>RLA150/M</td></tr><tr><td></td><td>Schienenträger, Senkbohrung 1"x 1"</td><td>Thorlabs</td><td>RC1</td></tr><tr><td></td><td>Schienenträger, senkrechte Schwalbenschwanzschiene</td><td>Thorlabs</td><td>RC3</td></tr><tr><td></td><td>Hochpräzise Translatierobjektivhalterung für 1 Zoll</td><td>Thorlabs</td><td>LM1XY/M</td></tr><tr><td>&frac12; " (12mm) Schwalbenschwanz-Translationstisch</td><td>Thorlabs</td><td>DT12/M</td>Schienenklemmen Thorlabs CL6<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Metrischer XYZ-Verschiebungstisch (enthält PT102)</td><td>Thorlabs</td><td>PT3/M</td></tr><tr><td></td> schwarzes <td>gummiertes Gewebe</td><td>Thorlabs</td><td>BK5</td></tr><tr><td></td><td>Kugeltreiber-Kit/ 6 Werkzeuge</td><td>Thorlabs</td><td>BD-KIT/M</td></tr><tr><td></td><td>Adapter mit externen M6 x 1,0 Gewinden und externen M4 x 0,7 Gewinden</td><td>Thorlabs</td><td>AP6M4M</td></tr><tr><td></td><td>Montagesockel, 25 mm x 58 mm x 10 mm, 5er Pack</td><td>Thorlabs</td><td>BA1S/M-P5</td></tr><tr><td></td><td>Objektivhalterung für 25,4mm Optik</td><td>Thorlabs</td><td>LMR1/M</td></tr><tr><td></td><td>SM1 FC/APC Adapter</td><td>Thorlabs</td><td>SM1FCA</td></tr><tr>Kinematische<td></td><td>Spiegelhalterung für 1 Zoll Optik</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td></tr><tr><td></td><td>Silizium Power Head, 400-1100nm, 50mW</td><td>Thorlabs</td><td>S120C</td></tr><tr><td></td><td>12,7 mm Pfostenhalter, federbelastete Sechskant-Rändelschraube, L=50 mm, 5er Pack</td><td>Thorlabs</td><td>PH50/M-P5</td></tr><tr><td></td><td>Pfostenhalter mit federbelasteter Sechskantschraube, L=20 mm</td><td>Thorlabs</td><td>PH20/M</td></tr><tr><td></td><td>12,7 mm x 50 mm Optischer Stift aus Edelstahl, M4 Bolzen, M6-Gewindebohrung, 5er Pack</td><td>Thorlabs</td><td>TR50/M-P5</td></tr><tr><td></td><td>12,7 mm x 75 mm Optischer Stift aus Edelstahl, M4 Bolzen, M6-Gewindebohrung, 5er Pack</td><td>Thorlabs</td><td>TR75/M-P5</td></tr><tr><td></td><td>USB Strom- und Energiezähler Schnittstelle</td><td>Thorlabs</td><td>PM100USB</td></tr><tr><td></td><td>12,7 mm x 30 mm Optischer Stift aus Edelstahl, M4 Bolzen, M6-Gewindebohrung</td><td>Thorlabs</td><td>TR30/M</td></tr><tr><td></td><td>12,7 mm x 20 mm Optischer Stift aus Edelstahl, M4 Bolzen, M6-Gewindebohrung</td><td>Thorlabs</td><td>TR20/M</td></tr><tr><td></td><td>750 mm lang Strukturschiene (Detektionsbox)</td><td>Thorlabs</td><td>XE25L750/M</td></tr><tr><td></td><td>350 mm lange Strukturschiene (Detektionsbox)</td><td>Thorlabs</td><td>XE25L350/M</td></tr><tr><td></td><td>Quick Corner Cube für 25 mm Schienen</td><td>Thorlabs</td><td>XE25W3</td></tr><tr><td></td><td>Rechtwinklige Halterung für 25 mm Schienen</td><td>Thorlabs</td><td>XE25A90</td></tr><tr><td></td><td>Schwarzes Posterboard 20" x 30" (508 mm x 762 mm), 1/16" (1,6 mm) dick, 5 Blatt</td><td>Thorlabs</td><td>TB5</td></tr><tr><td></td><td>Scharnier für 25 mm Schienengehäuse</td><td>Thorlabs</td><td>XE25H</td></tr><tr><td></td><td>Deckelanschlag für 25 mm Schienengehäuse</td><td>Thorlabs</td><td>XE25LS</td></tr><tr><td></td><td>M4 Zylinderschraubensatz</td><td>Thorlabs</td><td>HW-KIT1/M</td></tr><tr><td></td><td>M6 Zylinderschraubensatz und Hardware-Kit</td><td>Thorlabs</td><td>HW-KIT2/M</td></tr><tr><td></td><td>Tischklemme, L-Form, 5er Pack</td><td>Thorlabs</td><td>CL5-P5</td></tr><tr><td></td><td>SM1 Ringbetätigte Irisblende (&Oslash; 0.8 - &Oslash; 12 mm)</td><td>Thorlabs</td><td>SM1D12D</td></tr><tr><td></td><td>&Oslash; 1" SM1-montierte Milchglas-Ausrichtungsscheibe mit Oslash; 1 mm Loch</td><td>Thorlabs</td><td>DG10-1500-H1-MD</td></tr><tr><td></td><td>Optische Tischplatte mit Waben,</td><td>Standa Standa</td><td>1HB10-15-12</td></tr><tr><td></td><td>Optische Tischhalterung,</td><td>Standa Standa</td><td>1TS05-12-06-AR</td></tr><tr><td>Nanopositionierung für Proben</td><td>Präzisions-XYZ-Nanopositionierung</td><td>Physik Instrumente</td><td>PI P527-3.CD</td></tr><tr><td></td><td>Digital Multi-Channel Piezo Co, 3 Kanäle, -30 bis 130 V Sub-D-Stecker, kapazitive Sensoren,</td> <td>Physik Instrumente</td><td>PI E727-3.CD</td></tr><tr><td>Temperaturkammer</td><td>Zeiss 200M Inverses Mikroskop Inkubatorsystem MATT BLK</td><td>Digital Pixel</td> Dual Channel <td></td></tr><tr><td></td><td>Mikroprozessor Temperaturregler</td><td>Digital Pixel</td><td>DP_MTC_2000_DUO</td></tr><tr><td></td><td>zwei vibrationsfreie Heizmodule</td><td>Digital Pixel</td><td>DP_150_VF</td></tr><tr><td></td><td>PT100 Temperatursensor</td><td>Digital Pixel</td><td>DP_P100_TS</td></tr><tr><td>Biologische Reagenzien und Materialien</td>Zellkultur und Transfektion Cos7-Zellen <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>ATCC&reg;</td><td>CRL-1651&Handel;</td></tr><tr><td></td><td>8-Well-Lab-Tek-Kammern</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155411PK</td></tr><tr><td></td><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td></tr><tr><td></td><td>Fötales Rinderserum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000044</td></tr><tr><td></td><td>L-Glutamin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td></tr><tr><td>PBS-Puffer</td><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td></tr><tr><td></td><td>PenStrep</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td></tr><tr><td></td><td>PolyJet Transfektionsreagenz</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td></tr><tr><td>Messung des Cholesteringehalts</td><td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12216</td></tr><tr><td></td><td>Proteasehemmer Cocktail</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>87786</td></tr><tr><td></td><td>Phosphatasehemmer Cocktail</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78420</td></tr><tr><td></td><td>ROTI Nanoquant Arbeitslösung</td><td>Roth</td><td>K880</td></tr><tr><td></td><td>GloMax Discover Microplate Reader</td><td>Promega</td><td>GM3000</td></tr><tr><td>svFCS-Messungen</td><td>HBSS-Puffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025092</td></tr><tr><td></td><td>Hepes-Puffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td></tr><tr><td></td><td>Cholesterin Oxidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8868</td></tr><tr><td></td><td>Rhodamin 6G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83697-1G</td></tr></tbody></table>

spotvariations-fluoreszenz-korrelationsspektroskopie zur analyse der molekularen diffusion an der plasmamembran lebender zellen

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Dynamische biologische Prozesse in lebenden Zellen, einschließlich derjenigen, die mit der Organisation der Plasmamembran verbunden sind, finden auf verschiedenen räumlichen und zeitlichen Skalen statt, die von Nanometern bis Mikrometern bzw. Mikrosekunden bis Minuten reichen. Ein so breites Spektrum biologischer Prozesse stellt herkömmliche mikroskopische Ansätze in Frage. Hier beschreiben wir das Verfahren zur Durchführung von Messungen der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (svFCS) mit einem klassischen Fluoreszenzmikroskop, das angepasst wurde. Das Protokoll beinhaltet eine spezifische Leistungsüberprüfung des svFCS-Aufbaus und die Richtlinien für molekulare Diffusionsmessungen von svFCS an der Plasmamembran lebender Zellen unter physiologischen Bedingungen. Darüber hinaus bieten wir ein Verfahren zur Störung von Plasmamembran-Floß-Nanodomänen durch Cholesterinoxidase-Behandlung und zeigen, wie diese Veränderungen in der lateralen Organisation der Plasmamembran durch svFCS-Analyse aufgedeckt werden können. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese fluoreszenzbasierte Methode beispiellose Details über die laterale Organisation der Plasmamembran mit der entsprechenden räumlichen und zeitlichen Auflösung liefern kann.

Wir erzeugten eine DL für Thy1-GFP, ausgedrückt in Cos-7-Zellen (Abbildung 4, schwarze Quadrate). Das Diffusionsgesetz hat einen positiven t 0-Wert (19,47 ms ± 2 ms), was darauf hinweist, dass Thy1-GFP in Nanodomänenstrukturen der Plasmamembran eingeschlossen ist. Die Cholesterinoxidase-Behandlung der Zellen, die Thy1-GFP exprimieren, führte zur Verschiebung des DL t0-Wertes auf 7,36 ± 1,34 ms (Abbildung 4, graue Quadrate). Diese Beobachtung bestätigt, dass die Art des Thy1-GFP-Einschlusses vom Cholesteringehalt abhängt und mit Lipid-Floß-Nanodomänen assoziiert ist. Diese beiden Diffusionsgesetze unterscheiden sich gemäß dem oben beschriebenen statistischen Test (siehe Schritt 9.1.3) in Bezug auf t 0- und D-eff-Werte. Darüber hinaus bewerteten wir die Konzentration des gesamten zellulären Cholesterins in nicht behandelten Cos-7-Zellen im Vergleich zu den mit COase behandelten Zellen. Eine kleine, aber signifikante Abnahme des Gesamtcholesteringehalts wird bei der Behandlung mit COase beobachtet (Abbildung 5). Da dieses Enzym nur auf den Cholesterinpool wirkt, der am äußeren Blatt der Plasmamembran zugänglich ist, gehen wir davon aus, dass die beobachtete Abnahme des Cholesterinspiegels nur mit der Plasmamembran assoziiert ist und zur Destabilisierung von Lipid-Floß-Nanodomänen führt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig01.jpg"> Abbildung 1: Simulierte Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) Diffusionsgesetze, die durch Spot-Variations-FCS für verschiedene Formen der Membranorganisation festgelegt wurden. (Obere Tafeln) Schematische Darstellung der Membranorganisation - (A) freie Diffusion, (B) Netzbarrieren und (C) Fallen- / Domänengrenzen - mit der für ein einzelnes Molekül gezeichneten Flugbahn (rot). Blaue Kreise bezeichnen den Schnittpunkt der Membran und des Laserstrahls der Taille ω. (Untere Panels) FCS-Diffusionsgesetze, dargestellt durch Darstellung der Diffusionszeit td als Funktion des quadratischen Radius ω2. Die Diffusionsgesetzprojektion (grün gestrichelte Linie) durchschneidet die Zeitachse bei (A) dem Ursprung (t 0 = 0) im Falle der freien Diffusion; (B) in negativer Achse (t 0 &lt; 0), wenn maschenartige Barrieren vorhanden sind, oder (C) in positiver Achse (t 0 &gt; 0), wenn Fallen und Domänen (Lipidflöße) vorhanden sind. D ist der laterale Diffusionskoeffizient für die Brownsche Bewegung; Deff, der effektive Diffusionskoeffizient; Dmicro, der mikroskopische Diffusionskoeffizient innerhalb der Maschendrahtfallen; Din, der Diffusionskoeffizient innerhalb von Domänen; Dout, der Diffusionskoeffizient außerhalb von Domänen; L, die Größe der Seite einer quadratischen Domäne; und rD, der Radius einer kreisförmigen Domäne. Diese Figur wurde von He und Marguet6 modifiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig2v2.jpg"> Abbildung 2: Schematische Ansicht der svFCS-Hardwaresteuerung. Der Computer steuert alle Geräte über verschiedene Kommunikationsprotokolle: seriell (Mikroskop, externer Verschluss), USB (XYZ-piezoelektrischer Tisch, Korrelator) und PCI (Erfassungsplatine). DAQ: Datenerfassungsplatine, APD: Lawinenphotodiode, SPCM: Einzelphotonenzählmodul, DO: digitaler Ausgang. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig03.jpg"> Abbildung 3: Schematische Darstellung der optischen Anregungs- und Emissionspfade des svFCS-Aufbaus. Der svFCS-Aufbau besteht aus vier Modulen: (1) der Ausgang eines faserigen 488-nm-Lasers wird kollimiert, (2) eine Kombination aus einer Halbwellenplatte und einem polarisierenden Strahlteiler stellt die optische Leistung ein, (3) der Laserstrahl, der auf die Probe fokussiert ist, nachdem er sich durch ein röhrenlinsenfreies motorisiertes Mikroskop bewegt hat, und (4) die Fluoreszenz wird durch einen konfokalartigen Detektionspfad auf eine Lawinenphotodiode detektiert, die mit einem einzelnen Photonenzählmodul gekoppelt ist, die ein Signal an einen Hardware-Korrelator liefert. Einfachheit verleiht dem System seine Empfindlichkeit, Robustheit und Benutzerfreundlichkeit (ausführlich kommentiert in Ergänzendes Material). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig04.jpg"> Abbildung 4: Die svFCS-Diffusionsgesetze, die aus der Diffusionsanalyse von Thy1-GFP erzeugt werden, ausgedrückt in Cos-7. svFCS-Diffusionsgesetze von Cos-7-Zellen ohne Behandlung (NT, schwarze Quadrate) und nach Cholesterinoxidase-Behandlung (COase, graue Kreise). Die Einfügung in der Grafik stellt statistische Tests eines signifikanten Unterschieds zwischen den beiden vorgestellten svFCS-Diffusionsgesetzen dar (nach Mailfert et al.28). Der Prüfwert (T) sollte über dem auf 3,8 festgelegten Schwellenwert liegen, wenn beide Diffusionsgesetze unterschiedlich sind. Je höher es ist, desto größer ist der Unterschied zwischen den Diffusionsgesetzen. Der Wert von T ist farbcodiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig05.jpg"> Abbildung 5: Vergleich des Gesamtcholesteringehalts in Cos-7-Zellen. Cos-7-Zellen wurden entweder nicht behandelt (NT) oder 1 Stunde lang mit 1 E/ml Cholesterinoxidase (COase) behandelt. Die Daten stellen ein Beispiel für ein Experiment in dreifacher Ausfertigung dar. Zur Beurteilung der statistischen Differenz (α=0,05) wurde ein zweiseitiger, ungepaarter t-Test verwendet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Materialtabelle: Die Liste der optischen Elemente, die für das svFCS-Setup erforderlich sind.
Ergänzendes Material: Dieses Dokument beschreibt das Erstellen eines svFCS-Setups von Grund auf. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823_R1_Supp%20Mat_final.docx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Dieser Artikel zielt darauf ab, ein Protokoll zum Aufbau eines Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie-Mikroskops (svFCS) zur Messung der molekularen Diffusion an der Plasmamembran lebender Zellen vorzustellen.

Spotvariations-Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie zur Analyse der molekularen Diffusion an der Plasmamembran lebender Zellen

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

Die derzeitige Ansicht der lateralen Organisation der Plasmamembran ist noch unvollständig. Aus diesem Grund ist es wichtig, einige neue innovative Techniken wie die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie mit Punktvariation zu implementieren. Dies ist eine sehr leistungsfähige Technik, die sich durch eine hervorragende zeitliche und räumliche Auflösung auszeichnet.Darüber hinaus ist es nicht-invasiv und ermöglicht es, Zellmembranen unter physiologischen Bedingungen zu untersuchen. Öffnen Sie jeden Tag, bevor Sie ein Experiment durchführen, alle Irisblenden und verwenden Sie ein Leistungsmesser, um die Laserleistung zu messen, wobei die erste Iris vollständig geöffnet ist. Drehen Sie die halbe Platte, um die maximale Leistung zu ermitteln.Wenn die Laserleistung geringer als üblich ist, verwenden Sie die Blende, um die Ausrichtung zu überprüfen, und bewegen Sie L1 und M1 abwechselnd, wenn nötig. Notieren Sie sich dann den Energiewert in einem Labornotizbuch. Um den Nachweispfad zu überprüfen, geben Sie Wasser, ein Deckglas und einen Tropfen mit zwei nanomolaren Rhodamin-6G-Lösungen auf das Objektiv.Starten Sie dann die Korrelatorsoftware und zeichnen Sie die Daten auf. Die Autokorrelationsfunktion sollte ein geringes Rauschen, eine geringe Abfallgröße und eine hohe Zählrate pro Molekül und Sekunde anzeigen. Um die Spotgröße zu kalibrieren, legen Sie ein zellkulturcodiertes Deckglas auf das Wasserimmersionsobjektiv und geben Sie 200 Mikroliter zweier nanomolare Rhodamin-6G-Lösung auf das Deckglas.Stellen Sie die Leistung des Laserstrahls von 488 Nanometern auf 300 Mikrowatt ein und wählen Sie in der Software den Anschluss des Mikroskops für die Beleuchtungserkennung svFCS aus. Schalten Sie den APD ein und öffnen Sie die Blende, bis ein Signal ertönt, um die minimale Abfallgröße zu erhalten, oder schließen Sie sie für eine größere Abfallgröße. Zeichnen Sie etwa 10 bis 20 Sekunden lange Autokorrelationsfunktionen auf, um die statistische Reproduzierbarkeit zu verbessern und die APD auszuschalten.In einem geeigneten Datenanalyseprogramm werden die Läufe mit starken Fluktuationen aufgrund molekularer Aggregate überprüft und verworfen, dann der Durchschnitt der beibehaltenen Autokorrelationsfunktion mit einem 3D-Diffusionsmodell angepasst, die durchschnittliche Diffusionszeit aus den Anpassungsparametern extrahiert und die Daten als TXT-Datei gespeichert. Für die svFCS-Analyse stellen Sie den 488-Nanometer-Strahl auf zwei bis vier Mikrowatt ein und äquilibrieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Wählen Sie den Anschluss für das svFCS-Beleuchtungserkennungsmikroskop und auf dem APD aus.Führen Sie anschließend einen XY-Scan und einen Z-Scan der ausgewählten Zelle durch. Wählen Sie die Plasmamembran am oberen Rand der Zelle aus, um den konfokalen Punkt mit der maximalen Fluoreszenzintensität zu lokalisieren und die Datenerfassung zu starten. Nehmen Sie in der Korrelator-Software eine Serie von 20 Läufen mit fünf Sekunden auf.Schalten Sie nach der letzten Ausführung den APD aus, und verwerfen Sie alle unerwarteten Ausführungen, wie gezeigt. Passen Sie die Autokorrelationsfunktion "Mittelwert" an ein 2D-Diffusionsmodell mit zwei Spezies an und speichern Sie die Anpassungsparameter in der zuvor gespeicherten TXT-Datei. Wenn alle interessierenden Zellen aufgezeichnet wurden, analysieren Sie mindestens vier Abfallgrößen zwischen 200 und 400 Nanometern, um ein einziges Diffusionsgesetz zu ermitteln.Wählen Sie dann in MATLAB einen Ordner aus, der alle TXT-Dateien enthält, die mindestens vier Abfallgrößenexperimenten entsprechen, und stellen Sie die Diffusionszeit im Vergleich zum quadratischen Abfall dar. In dieser Abbildung ist ein Diffusionsgesetz für Thy1-GFP zu beobachten, das in Cos7-Zellen exprimiert wird. Das Diffusionsgesetz hat einen positiven Zeit-Null-Wert, was darauf hinweist, dass das Thy1-GFP in Nanodomänenstrukturen der Plasmamembran eingeschlossen ist.In dieser Analyse führte die Cholesterinoxidase-Behandlung der Zellen, die Thy1-GFP exprimieren, zu einer Verschiebung des Zeit-Null-Wertes des Diffusionsgesetzes auf 7,36 plus oder minus 1,34 Millisekunden. Dies bestätigt, dass die Art des Thy1-GFP-Einschlusses vom Cholesteringehalt abhängt und mit Lipid-Raft-Nanodomänen assoziiert ist. Eine kleine, aber signifikante Abnahme des Gesamtcholesteringehalts wurde auch bei der Behandlung mit Cholesterinoxidase beobachtet.Da dieses Enzym nur auf den Cholesterinpool wirkt, der an der äußeren Falte der Plasmamembran zugänglich ist, deuten diese Daten darauf hin, dass die beobachtete Abnahme des Cholesterins nur mit der Plasmamembran verbunden ist und eine Destabilisierung der Lipid-Raft-Nanodomänen verursacht. Das Wichtigste bei diesem Verfahren ist die korrekte Kalibrierung des svFCS-Systems und die Vorbereitung der Zellen für die Analyse. svFCS ist ein hervorragendes Werkzeug, um die Organisation der Zellmembran zu untersuchen.Es kann aber auch verwendet werden, um die Diffusion intrazellulärer Moleküle zu analysieren. Diese Technik kann erfolgreich in der Biomedizin eingesetzt werden, um den Einfluss der potenziellen Medikamente auf lebende Zellen wie Krebszellen zu bestimmen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Eine Technik, um die Lipidfloß Partitionierung von fluoreszierenden Proteinen an der Plasmamembran von lebenden Zellen Sonde beschrieben. Es nutzt die Unterschiede in der Verbreitung Zeiten von Proteinen innerhalb oder außerhalb der Lipid-Rafts befindet. Acquisition können dynamisch in Kontrollbedingungen oder nach dem Medikament zusätzlich durchgeführt werden.

Bestimmung der Lipid Raft Partitionieren von Fluoreszenz-markierten Sonden in lebenden Zellen mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS)

Dieses Video zeigt die Verwendung von Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie, um die Wechselwirkung zwischen Zelloberflächenproteinen bei Zell-Zell-Kontakten zu detektieren. Durch die Expression des interessierenden Transmembran-Adhäsionsrezeptors, der mit einem fluoreszierenden Protein markiert ist, und durch Mischen von zwei verschiedenen Zellpopulationen, die zwei spektral getrennte Fluoreszenzmarkierungen besitzen, wird die Trans-Interaktion zwischen den Rezeptoren zweier benachbarter Zellen...

Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie zur Untersuchung der Proteininteraktion an Zellkontakten

Dieses Papier bietet eine Schritt für Schritt Anleitung, um die Fluktuationsanalyse-Technik k-Raum-Bild-Korrelations-Spektroskopie (KIC) zur Messung der Diffusionskoeffizienten von fluoreszenz in lebenden Säugerzellen gekennzeichnet Plasmamembranproteinen.

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Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen In Vitro

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Hochpräzisions-FRET auf Einzelmolekül-Niveau für die Bestimmung der Biomolekülstruktur

Automatisierte Systeme und Protokolle für die routinemäßige Vorbereitung einer großen Anzahl von Bildschirmen und Nanoliter Kristallisation Tröpfchen für Dampf-Diffusion-Experimente sind beschrieben und diskutiert.

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Hier präsentieren wir ein experimentelles Protokoll, die eingesetzt werden kann, um die verbindliche Affinitäten und Art der Interaktion von markierungsfreie Phospholipid-bindendes Protein annexin A2 mit immobilisierten Solid unterstützt Bilayer (SLB) durch gleichzeitige Messung bestimmen die Mass Aufnahme und die viskoelastischen Eigenschaften des Proteins annexin A2.

Dissipative Microgravimetry die Bindung Dynamik der Phospholipid-bindende Protein Annexin A2, solide unterstützt Lipid Bilayer mit einem Quarz-Resonator zu studieren

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