Was sind präzisionsgeschnittene Lungenschnitte?

Präzisionsgeschnittene Lungenschnitte sind dünne Abschnitte von Lungengewebe, die für experimentelle Studien zur Beurteilung zellulärer Reaktionen verwendet werden.

Wie wird LDH als Marker für Zytotoxizität verwendet?

LDH wird in den Überstand freigesetzt, wenn Zellmembranen beschädigt sind, was es zu einem zuverlässigen Marker für Zytotoxizität macht.

Welche Rolle spielen Tenside in dieser Studie?

Tenside stören die Lipiddoppelschicht der Zellen, was zu Membranschäden und LDH-Freisetzung führt.

Welche Bedeutung hat die Messung der Absorbanz bei verschiedenen Wellenlängen?

Die Messung der Absorbanz bei 492 nm und der Subtraktion der Referenz bei 630 nm ermöglicht eine genaue Quantifizierung der LDH-Aktivität.

Kann diese Methode auf andere Gewebearten angewendet werden?

Ja, die Methodik kann potenziell für die Beurteilung der Zytotoxizität in anderen Gewebearten angepasst werden.

Welche Auswirkungen haben die Ergebnisse auf die Lungengesundheit?

Die Ergebnisse liefern Einblicke darüber, wie Tenside die Lungenzelllebensfähigkeit beeinflussen können, was für das Verständnis von Lungenerkrankungen wichtig ist.

Bewertung der Zytotoxizität und Membranintegrität in Lungenschnitten mittels Laktatdehydrogenase-Assay

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

0 views • 2:58 min • July 8th, 2025

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Beginnen Sie mit menschlichen, präzisionsgeschnittenen Lungenschnitten, PCLS, die mit zytotoxischen Wirkstoffen wie Tensidmolekülen in einer Multiwell-Platte behandelt werden.

Das Tensid fügt sich in die Lipiddoppelschicht der Zelle ein, wodurch die hydrophoben Schwänze des Tensids mit dem hydrophoben Kern der Lipiddoppelschicht interagieren.

Dadurch wird die geordnete Anordnung der Lipidmoleküle gestört, was zur Bildung einer Mizelle führt.

Dies beeinträchtigt die Integrität der Membran und führt zum Austreten von intrazellulärem Inhalt, einschließlich Laktatdehydrogenase oder LDH, einem häufigen Indikator für Zellmembranschäden.

Sammeln Sie den Überstand mit dem freigesetzten LDH.

Fügen Sie den LDH-Assay-Reaktionscocktail hinzu, der Laktatsubstrat, NAD+, Diaphorase und Tetrazoliumsalz enthält, und inkubieren Sie.

LDH oxidiert Laktat zu Pyruvat bei gleichzeitiger Reduktion von NAD+-Coenzym zu NADH.

Diaphorase nutzt das NADH, um das Tetrazoliumsalz in Formazan zu reduzieren – ein farbiges Produkt.

Die Tensid-induzierte Zytotoxizität kann anhand der LDH-Aktivität gemessen werden, die durch die Formazanproduktion angezeigt wird.

Nach der Inkubation des PCLS mit oder ohne Testmittel werden 50 Mikroliter Überstand und Duplikate in eine neue 96-Well-Platte überführt. Dadurch werden Duplikate aus jeder behandelten Vertiefung einer 24-Well-Platte erzeugt.

Unmittelbar vor dem Assay bereiten Sie einen Mastermix der Arbeitslösung des LDH-Reagenzes vor, indem Sie 125 Mikroliter Katalysatorlösung gründlich mit 6,25 Millilitern Farbstofflösung für eine 96-Well-Platte mischen. Pipettieren Sie dann 50 Mikroliter der Mastermix-Arbeitslösung in jede Vertiefung, die bereits 50 Mikroliter Überstand enthält, und inkubieren Sie die Platte 20 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Messen Sie anschließend die Absorption jeder Vertiefung bei 492 Nanometern mit einem Mikroplatten-Reader und subtrahieren Sie die Absorption bei 630 Nanometern Referenz von der bei 492 Nanometern.