Ein Multiplex-Bead-basierter Immunoassay zur Quantifizierung mehrerer Zytokinziele

Nehmen Sie eine Multiwell-Platte mit Filtern an der Basis.

Fügen Sie eine Testprobe hinzu, die verschiedene Zytokine enthält.

Fügen Sie verschiedene Sätze von Mikrosphären hinzu, die sich nach Größe und interner Fluoreszenzintensität unterscheiden.

Jedes Set ist an einen Antikörper konjugiert, der auf ein bestimmtes Zytokin abzielt.

Inkubieren Sie die Platte im Dunkeln unter Rühren.

Die Antikörper binden an ihre Zielzytokine und immobilisieren sie auf den Mikrosphären.

Wenden Sie ein Vakuum an, um die ungebundenen Zytokine zu entfernen. Mikrosphärengebundene Zytokine bleiben aufgrund der kleineren Porengröße der Membran erhalten.

Fügen Sie einen Cocktail aus Biotin-konjugierten Nachweisantikörpern hinzu, die an die Mikrosphären-gebundenen Zytokine binden.

Fügen Sie ein fluoreszierendes Reporter-konjugiertes Streptavidin hinzu und inkubieren Sie im Dunkeln unter Rühren. Streptavidin bindet an Biotin und immobilisiert den Reporter auf dem Mikrosphärenkomplex.

Entfernen Sie ungebundene Moleküle und resuspendieren Sie die Mikrosphären.

Identifizieren Sie mit Hilfe der Durchflusszytometrie die gebundenen Zytokine, indem Sie die Größe und die innere Fluoreszenz der Mikrosphären bestimmen.

Um die Menge eines bestimmten Zytokins zu bestimmen, messen Sie die Fluoreszenzintensität des Reporters.

Um den Assay durchzuführen, lassen Sie alle Reagenzien vor der Verwendung auf Raumtemperatur erwärmen.

dieser Demonstration werden Polypropylen-Filterplatten verwendet. Es ist unbedingt erforderlich, dass die Platte während des gesamten Untersuchungsvorgangs, einschließlich der Waschschritte, aufrecht gehalten wird, um einen Verlust der Kügelchen zu vermeiden.

Befeuchten Sie das Filterpapier vor, indem Sie 100 Mikroliter 1x Waschpuffer in jede Vertiefung geben und die Platte 1 Minute lang bei Raumtemperatur ruhen lassen. Entfernen Sie das Puffervolumen mit Hilfe des Vakuumverteilers. Tupfen Sie überschüssigen Waschpuffer vom Boden der Platte ab, indem Sie die Platte auf einen Stapel sauberer Papiertücher drücken. Legen Sie dann die Platte auf die umgedrehte Plattenabdeckung.

Für Zellkulturüberstandsproben geben Sie 25 Mikroliter Assay-Puffer in alle Vertiefungen. Geben Sie 25 Mikroliter jedes Standards in die Standardvertiefungen. Geben Sie abschließend 25 Mikroliter jeder Probe in die Probenvertiefungen. Die gemischten Kügelchen 30 Sekunden lang vortexen. Geben Sie dann 25 Mikroliter der gemischten Kügelchen in jede Vertiefung und schütteln Sie die Perlenflasche mit Unterbrechungen, um ein Absetzen der Perlen zu vermeiden.

Versiegeln Sie die Platte mit einem Plattenversiegeler. Nach dem Versiegeln wickeln Sie die gesamte Platte, einschließlich der umgedrehten Plattenabdeckung, mit Alufolie ein. Stellen Sie die Platte auf einen Plattenschüttler, befestigen Sie sie und schütteln Sie sie zwei Stunden lang bei Raumtemperatur bei ca. 500 U/min. Legen Sie die Platte ohne Umdrehen auf den Vakuumverteiler und wenden Sie das Vakuum wie zuvor an. Geben Sie dann 200 Mikroliter 1x Waschpuffer in jede Vertiefung

Entfernen Sie den Inhalt der Vertiefungen der Assay-Platte durch Vakuumfiltration. Tupfen Sie überschüssigen Waschpuffer mit einem saugfähigen Pad oder Küchenpapier vom Boden der Platte ab, bevor Sie diesen Schritt noch einmal wiederholen. Geben Sie anschließend 25 Mikroliter Nachweisantikörper in jede Vertiefung. Nachdem Sie die Platte mit einem frischen Plattenversiegeler versiegelt haben, wickeln Sie die gesamte Platte, einschließlich der umgekehrten Plattenabdeckung, mit Alufolie ein.

Stellen Sie die Platte auf einen Plattenschüttler und schütteln Sie sie 1 Stunde lang bei ca. 500 U/min bei Raumtemperatur. Geben Sie ohne Vakuumieren 25 Mikroliter Streptavidin-Phycoerythrin-Reagenz direkt in jede Vertiefung. Verschließen und wickeln Sie die Platte wie zuvor ein. Dann. Stellen Sie die Platte auf einen Plattenschüttler und schütteln Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur bei ca. 500 U/min.

Nachdem Sie den Vakuumfiltrationsschritt zweimal wiederholt haben, geben Sie 200 Mikroliter 1x Waschpuffer in jede Vertiefung. Die Perlen 1 Minute lang auf einem Tellerschüttler aufhängen. Übertragen Sie die Proben mit einer Mehrkanalpipette von der Filterplatte in FACS-Röhrchen, um die Proben auf einem Durchflusszytometer abzulesen.