Name: Entwicklung und Validierung eines empfindsamen Einzelmolekül Array digitale Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay für menschliche Interferon-α (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Erfahren Sie die Entwicklung eines hochempfindlichen Single-Molecule-Array-digital-ELISA-Assays zur Detektion aller IFN-α-Subtypen in humanen Proben. Diese Methode ermöglicht Biomarker-Discovery bei Autoimmunerkrankungen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

DD und YJC anerkennen, Unterstützung von der ANR (Projekt IFNX, keine. CE17001002) und der ImmunoQure AG für die Bereitstellung von monoklonalen Antikörpern. Wir danken Brigitte Bader-Meunier, Nathalia Bellon, Christine Bodemer, Alex Belot, Isabelle Melki und Pierre Quartier für die Bereitstellung von klinischer Proben. YJC erkennt das European Research Council (GA 309449: Stipendium für YJC), und einer staatlichen Förderung durch die National Research Agency (Frankreich) unter der "Investitionen für die Zukunft"-Programm mit der Referenz ANR-10-IAHU-01 verwaltet.

<ol><li>Isaacs, A., Lindenmann, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13465720">Classics in Oncology Virus Interference: I. The Interferon.</a> Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 258-267 (1957).</li>
<li>Isaacs, A., Lindenmann, J., Valentine, R. C., Alerts, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pillars+Article%3A+Virus+Interference.+II.+Some+Properties+of+Interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+London.+Ser.+B%2C+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Pillars Article: Virus Interference. II. Some Properties of Interferon.</a> Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 268-273 (1957).</li>
<li>Hunt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombotic+Microangiopathy+Associated+with+Interferon+Beta%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Thrombotic Microangiopathy Associated with Interferon Beta.</a> N. Engl. J. Med. 370, 1270-1271 (2014).</li>
<li>Hooks, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+Interferon+in+the+Circulation+of+Patients+with+Autoimmune+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Immune Interferon in the Circulation of Patients with Autoimmune Disease.</a> N. Engl. J. Med. 301, 5-8 (1979).</li>
<li>Greenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-alpha%2Fbeta+Mediated+Innate+Immune+Mechanisms+in+Dermatomyositis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Interferon-alpha/beta Mediated Innate Immune Mechanisms in Dermatomyositis.</a> Ann. Neurol. 57, 664-678 (2005).</li>
<li>Crow, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+interferonopathies+a+novel+set+of+inborn+errors+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Type I interferonopathies a novel set of inborn errors of immunity.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1238, 91-98 (2011).</li>
<li>Rodero, M. P., Crow, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+interferon+-+mediated+monogenic+autoinflammation%3A+The+type+I+interferonopathies%2C+a+conceptual+overview%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Type I interferon - mediated monogenic autoinflammation: The type I interferonopathies, a conceptual overview.</a> J. Exp. Med. 213, 2527-2538 (2016).</li>
<li>Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+biological+assay+for+interferons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive biological assay for interferons.</a> J. Immunol. Methods. 185, 9-17 (1995).</li>
<li>Meager, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+assays+for+interferons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Biological assays for interferons.</a> J. Immunol. Methods. 261, 21-36 (2002).</li>
<li>Hua, J., Kirou, K., Lee, C., Crow, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Assay+of+Type+I+Interferon+in+Systemic+Lupus+Erythematosus+Plasma+and+Association+With+Anti+-+RNA+Binding+Protein+Autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Functional Assay of Type I Interferon in Systemic Lupus Erythematosus Plasma and Association With Anti - RNA Binding Protein Autoantibodies.</a> Arthritis Rheumatol. 54, 1906-1916 (2006).</li>
<li>Niewold, T. B., Kariuki, S. N., Morgan, G. A., Shrestha, S., Pachman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+serum+interferon-alpha+activity+in+juvenile+dermatomyositis%3A+associations+with+disease+activity+at+diagnosis+and+after+thirty-six+months+of+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Elevated serum interferon-alpha activity in juvenile dermatomyositis: associations with disease activity at diagnosis and after thirty-six months of therapy.</a> Arthritis Rheumatol. 60, 1815-1824 (2009).</li>
<li>Seo, Y., Kim, G., Kwak, H., Nam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+HeLa+Mx2+%2F+Luc+Reporter+Cell+Line+for+the+Quantification+of+Human+Type+I+Interferons%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Validation of a HeLa Mx2 / Luc Reporter Cell Line for the Quantification of Human Type I Interferons.</a> Pharmacology. 84, 135-144 (2009).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+surface+expression+of+Fc%CE%B3+receptor+RI+%28+CD64+%29%2C+a+biomarker+reflecting+type-I+interferon+levels+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res.+Ther%22%5BJournal%5D)">Monocyte surface expression of Fcγ receptor RI ( CD64 ), a biomarker reflecting type-I interferon levels in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Res. Ther. 12, 1-12 (2010).</li>
<li>Berger-Rentsch, M., Zimmer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Vesicular+Stomatitis+Virus+Replicon-Based+Bioassay+for+the+Rapid+and+Sensitive+Determination+of+Multi-Species+Type+I+Interferon%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Vesicular Stomatitis Virus Replicon-Based Bioassay for the Rapid and Sensitive Determination of Multi-Species Type I Interferon.</a> PLoS One. 6, e25858(2011).</li>
<li>Rissin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+enzyme-linked+immunosorbent+assay+detects+serum+proteins+at+subfemtomolar+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations.</a> Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).</li>
<li>Wu, D., Milutinovic, M. D., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+array+%28Simoa%29+assay+with+optimal+antibody+pairs+for+cytokine+detection+in+human+serum+samples%5BTitle%5D)+AND+%22R.+Soc.+Chem%22%5BJournal%5D)">Single molecule array (Simoa) assay with optimal antibody pairs for cytokine detection in human serum samples.</a> R. Soc. Chem. 140, 6277-6282 (2015).</li>
<li>Simoa. Scientific Principle of SimoaTM (Single Molecule Array) Technology. <a target="_blank" href="http://www.healthtech.com/uploadedFiles/Conferences/White_Papers/MXA/Scientific-Principles-of-Simo-Technology.pdf">Whitepaper 1.0</a>. , Quanterix Corp. 1-2 (2013).</li>
<li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+enzyme-linked+immunosorbent+assays+Theoretical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single molecule enzyme-linked immunosorbent assays Theoretical considerations.</a> J. Immunol. Methods. 378, 102-115 (2012).</li>
<li>Yeung, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+highly+sensitive+immunoassay+technologies+for+quantitative+measurements+of+sub-pg+%2F+mL+levels+of+cytokines+in+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of highly sensitive immunoassay technologies for quantitative measurements of sub-pg / mL levels of cytokines in human serum.</a> J. Immunol. Methods. 437, 53-63 (2016).</li>
<li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+measurements+of+tumor+necrosis+factor+%CE%B1+and+interleukin-6+in+the+plasma+of+patients+with+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single molecule measurements of tumor necrosis factor α and interleukin-6 in the plasma of patients with Crohn's disease.</a> J. Immunol. Methods. 372, 177-186 (2011).</li>
<li>Meissner, E. G., Decalf, J., Casrouge, A., Masur, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Changes+of+Post-Translationally+Modified+Forms+of+CXCL10+and+Soluble+DPP4+in+HCV+Subjects+Receiving+Interferon-Free+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dynamic Changes of Post-Translationally Modified Forms of CXCL10 and Soluble DPP4 in HCV Subjects Receiving Interferon-Free Therapy.</a> PLoS One. 10, e0133236(2015).</li>
<li>Decalf, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+DPP4+activity+in+humans+establishes+its+in+vivo+role+in+CXCL10+post-translational+modification%3A+prospective+placebo-controlled+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Inhibition of DPP4 activity in humans establishes its in vivo role in CXCL10 post-translational modification: prospective placebo-controlled clinical studies.</a> EMBO Mol. Med. 8, 679-683 (2016).</li>
<li>Rabing Brix Petersen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+in+plasma+from+patients+with+diabetic+retinopathy+-+development+and+validation+of+digital+ELISA+by+Single+Molecule+Array+%28Simoa%29+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin in plasma from patients with diabetic retinopathy - development and validation of digital ELISA by Single Molecule Array (Simoa) technology.</a> J. Immunol. Methods. 446, 60-69 (2017).</li>
<li>Disanto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+Neurofilament+Light%3A+A+Biomarker+of+Neuronal+Damage+in+Multiple+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Serum Neurofilament Light: A Biomarker of Neuronal Damage in Multiple Sclerosis.</a> Ann. Neurol. 81, 857-870 (2017).</li>
<li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+digital+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+ultrasensitive+measurement+of+amyloid-+%CE%B2+1+-+42+peptide+in+human+plasma+with+utility+for+studies+of+Alzheimer%27s+disease+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers.+Res.+Ther%22%5BJournal%5D)">A digital enzyme-linked immunosorbent assay for ultrasensitive measurement of amyloid- β 1 - 42 peptide in human plasma with utility for studies of Alzheimer's disease therapeutics.</a> Alzheimers. Res. Ther. 8, 1-15 (2016).</li>
<li>Passaes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+HIV-1+p24+Assay+Detects+Single+Infected+Cells+and+Differences+in+Reservoir+Induction+by+Latency+Reversal+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive HIV-1 p24 Assay Detects Single Infected Cells and Differences in Reservoir Induction by Latency Reversal Agents.</a> J. Virol. 91, e02296(2017).</li>
<li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Detection+of+Bacterial+Genomic+DNA+at+Sub-Femtomolar+Concentrations+Using+Single+Molecule+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct Detection of Bacterial Genomic DNA at Sub-Femtomolar Concentrations Using Single Molecule Arrays.</a> Anal. Chem. 85, 1932-1939 (2013).</li>
<li>Cohen, L., Hartman, M. R., Amardey-wellington, A., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+direct+detection+of+microRNAs+using+single+molecule+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Digital direct detection of microRNAs using single molecule arrays.</a> Nucleic Acids Res. 45, e137(2017).</li>
<li>Meyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AIRE-Deficient+Patients+Harbor+Unique+High-Affinity+Disease-Ameliorating+Autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">AIRE-Deficient Patients Harbor Unique High-Affinity Disease-Ameliorating Autoantibodies.</a> Cell. 166, 582-595 (2016).</li>
<li>Simoa. Homebrew Assay Development Guide. Simoa HD-1 Analyzer & Quanterix SR-X. User-0021 08. , Quanterix corporation. (2017).</li>
<li>Rodero, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+interferon+alpha+protein+reveals+differential+levels+and+cellular+sources+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Detection of interferon alpha protein reveals differential levels and cellular sources in disease.</a> J. Exp. Med. 214, 1547-1555 (2017).</li>
<li>Pleil, J., Angrish, M., Madden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemistry+for+high-throughput+screening+of+human+exhaled+breath+condensate+%28EBC%29+media+implementation+of+automated+Quanterix+SIMOA+instrumentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Breath+Res%22%5BJournal%5D)">Immunochemistry for high-throughput screening of human exhaled breath condensate (EBC) media implementation of automated Quanterix SIMOA instrumentation.</a> J. Breath Res. 9, 047108(2015).</li>
<li>Schiess, R., Wollscheid, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Proteomic+Strategy+for+Clinical+Biomarker+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Targeted Proteomic Strategy for Clinical Biomarker Discovery.</a> Mol. Oncol. 3, 33-44 (2009).</li>
<li>Wilson, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Simoa+HD-1+Analyzer%3A+A+Novel+Fully+Automated+Digital+Immunoassay+Analyzer+with+Single-Molecule+Sensitivity+and+Multiplexing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Autom%22%5BJournal%5D)">The Simoa HD-1 Analyzer: A Novel Fully Automated Digital Immunoassay Analyzer with Single-Molecule Sensitivity and Multiplexing.</a> J. Lab. Autom. 21, 533-547 (2016).</li>
<li>Rivnak, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fully-automated%2C+six-plex+single+molecule+immunoassay+for+measuring+cytokines+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A fully-automated, six-plex single molecule immunoassay for measuring cytokines in blood.</a> J. Immunol. Methods. 424, 20-27 (2015).</li>
<li>Anderson, N. L., Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Plasma+Proteome.+History%2C+character%2C+and+diagnostic+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+proteomics%22%5BJournal%5D)">The Human Plasma Proteome. History, character, and diagnostic prospects.</a> Mol. Cell. proteomics. 1, 845-867 (2002).</li>
<li>Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+in+the+multiplex+era%3A+Potentials+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin.+Appl%22%5BJournal%5D)">ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls.</a> Proteomics Clin. Appl. 9, 406-422 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier beschrieben wir die Entwicklung und Validierung von einer hoch reproduzierbare, Gromer Einzelmolekül Array digitale ELISA für direkte Quantifizierung des IFN-α Proteins in humanen Proben (Schritte in Tabelle 1zusammengefasst). Einer der wichtigsten Schritte bei der Entwicklung des Tests ist die Wahl der Antikörper Paar16, mit den Eigenschaften in Bezug auf die Kinetik und Epitop Bindung als Schlüssel zu einem erfolgreichen Test. Es ist wichtig, vermeiden den Einsatz von gekoppelte monoklonale Antikörper, die gezielt das gleiche Epitop oder sterische Behinderung verursachen. Polyclonal Antikörper könnte als Erkennung Antikörper verwendet werden, um diese Beschränkungen zu überwinden. Wenn die gewünschte Empfindlichkeit bei jedem gegebenen Schritt nicht erreicht wird, sollte weitere Optimierungsmöglichkeiten betrachtet werden. Dazu gehören die Verwendung von alternativen Antikörper Paare, Änderungen in den Parametern wie proteintyp (z.B. BSA < Kasein), pH (6,0-8,5), Ionenstärke, Pufferkapazität (z.B. NaCl und Phosphat-Konzentrationen), Träger Perlen und/oder Anwesenheit von Tensiden. Eine Vielzahl von Parametern werden con optimiert, wenn einen einzelnes Molekül Array Assay Entwicklung. Jedoch insgesamt Bedingungen, die hohe Signal: Hintergrund-Verhältnisse und minimale LODs geben die sind bevorzugt (siehe Abbildung 1, Abbildung 2und Abbildung 3).
Hinsichtlich Spezifität, der IFN-α-Test zeigte kein Kreuz Reaktivität für andere IFNs getestet (β, γ, λ1, λ2, ω) (Abb. 4a) und war in der Lage alle 13 IFN-α-Subtypen (Abbildung 4 b). Der Test ergab jedoch eine geringere Affinität für die IFN-α2-Subtyp, (Abbildung 4 b und ergänzenden Tabelle 4). Interessanterweise wurden unterschiedliche Empfindlichkeiten für die einzelnen Klassen der IFN-α2 (a, b, C) auch beobachtet, die möglicherweise aufgrund unterschiedlichen Herstellungsverfahren oder andere Aminosäure-Sequenzen, wie die IFN-α2-Subtypen aus verschiedenen kommerziellen gewonnen wurden, Lieferanten. Mit dieser einzigen Ausnahme gab die IFN-α-Arten sehr ähnliche Reaktionen. Die Spezifität des Assays zeigte sich weiter durch Vorbehandlung der Proben mit der Anti-IFN-α ein Klon, die das Signal (Abb. 6 und ergänzenden Tabelle 6) aufgehoben.
Eines der wichtigsten Vorteile dieser Technologie ist, dass alle Analyten von Interesse kann potenziell gezielte16. Darüber hinaus können verschiedenen biologische Proben getestet werden, wie z. B. Serum, Plasma, Liquor cerebrospinalis, zelluläre Lysates, Kultur Überstände31 und sogar Atem32. In der Regel ist eine Verdünnung von 1:3 von Plasma durchgeführt, um zu vermeiden, mögliche Verstopfung der Einzelmolekül-Array-Analysator. Jedoch der Analyten von Interesse in sehr geringen Konzentrationen in die relevanten biologischen Probe vorhanden sein könnten und möglicherweise höhere Konzentrationen der Probe erforderlich (je nach Empfindlichkeit der Assay)33. Obwohl es Potenzial gibt für multiplexing unter Beibehaltung guter Empfindlichkeit34, ist es ein schwieriger Prozess und Assays für die Messung von größer als 6 Proteine innerhalb der gleichen Experimente haben noch35werden entwickelt.
Die Fähigkeit zu erkennen und zu quantifizieren, Zytokine und andere biologische relevante Proteine bei so niedrigen Konzentrationen eröffnet eine ganze Reihe neuer Anwendungen33,36. Es ist bekannt, dass zahlreiche Proteine ihre Wirkung auch bei sehr geringen Konzentrationen, ausüben, die bisher unter der Nachweisgrenze der besten ELISAs37lagen. Während andere Immunoassay-Technologien Vorteile gegenüber konventionellen ELISA19 bieten, zeigen wir hier, dass Einzelmolekül Array digitale ELISA eine reproduzierbare und robuste Plattform für den empfindsamen Nachweis geringer Konzentration Zytokine in ist humanen Proben. Diese Technologie bietet enormes Potenzial für die Entdeckung von Biomarkern und verbesserte Patientenmanagement eine Vielzahl von Krankheiten.

Art I IFNs sind eine Familie von Zytokinen, die eine zentrale Rolle in der Orchestrierung antivirale Immunantwort. Sie wurden zuerst von Isaacs und Lindenmann 60 Jahren entdeckt,1,2 , und es ist nun bekannt, dass diese heterogene Familie von Polypeptiden besteht aus 14 verschiedenen Unterklassen (13 IFN-α-Subtypen und 1 IFN-β). Ich IFNs sind unerlässlich, um die Räumung von Virusinfektionen, sondern haben auch in der Pathologie der unterschiedlichsten Krankheiten Staaten, darunter die Autoimmunerkrankungen systemischer Lupus erythematodes (SLE), juvenile Dermatomyositis (JDM), in Verbindung gebracht und der Typ Ich Interferonopathies in welchem konstitutive Ergebnisse I IFN-induzierte Signalisierung in Pathologie3,4,5,6,7.
Studium der Typ I IFN Protein Ebenen in biologischen Proben ist seit seiner ersten Identifikation als eine "störenden Substanz"1,2herausfordernd. Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) ist derzeit die am weitesten verbreitete Methode zur Erkennung von IFN-α-Protein. Trotz des Seins gezielte, einfache und schnelle, Typ I IFN ELISAs vorhandene wichtige Einschränkungen, z. B. begrenzte Empfindlichkeit. Darüber hinaus erfordert die Messung alle IFN-α-Subtypen den Einsatz von mehreren Tests mit eigenen Erkennung Kapazität und Empfindlichkeit. Zwar gibt es kommerzielle ELISAs, die verschiedene Subtypen des IFN-α zu erkennen, ihre Empfindlichkeit ist begrenzt (1,95 Pg/mL, 12,5 Pg/mL und 12.5 Pg/mL, beziehungsweise) die ist oft unzureichend, IFN-α Proteins in biologischen Proben zu erkennen. Um diese Einschränkung zu umgehen, Typ I IFN mehrere biologische Proxy-Assays wurden entwickelt, um die Quantifizierung durch Messung induzierte Genexpression oder funktionelle Aktivität8,9,10,11, 12 , 13 , 14. dennoch diese Tests bieten kein direktes Maß für die IFN-α-Protein.
In dieser Studie wurde Einzelmolekül Array ELISA Digitaltechnik verwendet, um einen Test zum Nachweis von einzelnen IFN-α-Protein-Moleküle zu entwickeln. Digitalen ELISA nutzt die gleichen grundlegenden Chemie als konventionellen ELISA, jedoch die Reaktion findet statt in Arrays bestehend aus 50.000 einzelne 46 Femtoliter Größe Brunnen15,16. Einzelne Proteinmoleküle durch Antikörper-beschichtete paramagnetischen Perlen erfasst und mit einem biotinylierte detektionsantikörper, gefolgt durch die Bindung an ein Enzym-Konjugat Streptavidin-β-Galaktosidase (SBG) gekennzeichnet. Anschließend werden die Perlen mit einem Fluorogenic Enzym-Substrat, Resorufin-β-D-Galactopyranoside (RGP) in Einzelmolekül-Arrays ausgesetzt. Durch die Verringerung des Volumens Reaktion 2 Milliarden Mal17, eine hohe lokale Konzentration von Fluoreszenzsignal erreicht und Einzelmolekül zählt sind möglich, wie jedes Molekül erzeugt ein Signal, das nun zuverlässig sein kann gemessen18. Im Wesentlichen können Einzelmolekül-Arrays zählen einzelne Immunocomplexes und die Festlegung einer durchschnittlichen Anzahl von Enzymen pro Perle (AEB). Zählen die Mikrovertiefungen, in denen ein Signal erkannt wird, erlaubt Quantifizierung/Digitalisierung der Protein-Moleküle, da gibt es eine direkte Korrelation zwischen Proteinkonzentration und das Verhältnis zwischen Immunocomplexed-Perlen und eine Gesamtanzahl von Perlen in vorhanden die Femtoliter große Kammern.
Yeung Et Al. eine umfangreiche Cross-Plattform-Evaluierungsstudie mit neun verschiedenen Technologien und vier Zytokin-Immunoassays für den Vergleich der Assay-Präzision, Sensibilität und Datenkorrelation über die verschiedenen Plattformen19durchgeführt. Eines der wichtigsten Ergebnisse der Studie war, dass Einzelmolekül-Arrays und Einzelmolekül Immunoassay zählen die höchste Empfindlichkeit zur Erkennung von Zytokinen in humanem Serum innerhalb der Sub-Pg/mL Konzentrationsbereich vorgestellt. Einzelmolekül Array digitale ELISA Zytokin Assays wurden verwendet, um die Untersuchung der Rolle von TNF-α und IL-6 in Crohns Krankheit20, IFN-α in Interferonopathy und Auto-immun-Patienten 7, und die verschiedenen posttranslational modifiziert Formen des C-X-C Motiv-Chemokin 10 (CXCL10) in chronischer Hepatitis und gesunden Spendern erhalten Sitagliptin21,22. Weitere Anwendungen sind die Messung von Rhodopsin bei Patienten mit diabetischer Retinopathie23; die Untersuchung von Gehirn Pathologien durch Serum/Plasma Messungen der Neurofilamente Licht24 und Amyloid-β 1-42 Peptid25im Zusammenhang mit Multipler Sklerose und Alzheimer-Krankheit, beziehungsweise. Einzelmolekül Array Assays können auch für verbesserte Erregernachweis z. B. Charakterisierung der HIV Virus-Reservoir26, und auch für die Erkennung von DNA-27 und Mikro-RNAs28verwendet werden. Ein großer Vorteil der Einzelmolekül-Array-Technologie ist diese hohe Vielseitigkeit, wie ein Test gegen jeden Analyten von Interesse entwickelt werden kann, wenn ein spezifischer Antikörper-paar zur Verfügung steht. Darüber hinaus sind Homebrew Assay Kits im Handel erhältlich, soll die Entwicklung von neue Assays, das, die Protokoll die in abgewandelter Form unten beschrieben wird.
Hier ist eine detaillierte Beschreibung der Entwicklung und Validierung Schritte für ein einzelnes Molekül Array Assays, dass die Ergebnisse in erweiterte Empfindlichkeit für IFN-α Proteindetektion präsentiert. Antikörper für Einzelmolekül Array Assays sollte hochspezifische, Kreuz Reaktivität mit Verwandte Proteine (mit Arten Spezifität berücksichtigt, falls relevant) zu vermeiden. Im Idealfall sollte die Antikörper mit einem K-D kleiner als 10-9 M gewählt werden; hoher Affinität sorgt für starke Bindung mit der Produktion von einem höheren Signal. Die Kinetik der Antikörper-Antigen-Bindung sind auch wichtige und schnelle Kauf und langsam Koff wird Antigen-Antikörper-komplexen Baugruppe begünstigen. Beginnend mit einem Antikörper-Paar, das eine gute Leistung in klassischen ELISA, mit einer Begrenzung der Nachweisgrenze (LOD) von 1-100 Pg/mL, hat erhöht die Chancen auf einen hochempfindlichen Einzelmolekül-Array-Assay. Chang und Kollegen führte detaillierte kinetische Untersuchungen der biomolekularen Wechselwirkungen auftreten bei jedem einzelnen Schritt, schlägt eine Reihe von Gleichungen, analytische Empfindlichkeit18vorherzusagen. Sie zeigten dieses Einzelmolekül-Array digitale ELISA wirksam innerhalb einer breiten Palette von Antikörper Affinitäten zu sein scheint (KD ~ 10−11 - 10−9 M), ebenso wie die Signalerzeugung abhängiger auf der Rate der solche Antikörper ist.
Um hohe Affinität zu nutzen geben wir Antikörper isoliert von Patienten mit dem Syndrom autoimmune Polyendocrinopathy nutzten Antikörper 1/autoimmune Polyendocrinopathy-Candidiasis-ektodermalen Dystrophie (APS1/APECED)29. Aus Gründen, die noch nicht erforscht sind, wird die große Mehrheit der AIRE-defizienten Personen entwickeln eine Reihe von hoch-Avidität Antikörper gegen alle IFN-α-Subtypen29und ausgewählt wurden zwei Anti-IFN-α-Antikörper Klone von ergänzenden verbindliche Affinitäten für die IFN-α Subtypen, als durch IC50 Werte geschätzt. Die Kombination dieser einzigartigen High-Affinität Antikörper mit Einzelmolekül-Array-Technologie ermöglicht die direkte Quantifizierung der IFN-α bei Konzentrationen von Attomolar (fg/mL). So empfindsamen IFN-α Proteindetektion trägt zu einem besseren Verständnis der Natur, Verordnung und biologische Wirkung der IFN-induzierte Reaktion in verschiedenen Krankheiten Einstellungen.

<table><tbody><tr><td>Anti-IFN-& alpha; Antikörper A (8H1 Klon)</td><td>ImmunoQure AG</td><td>NA</td><td>Nicht kommerziell erhältlich</td></tr><tr><td>Anti-IFN-& alpha; Antikörper B (12H5 Klon)</td><td>ImmunoQure AG</td><td>NA</td><td>Nicht kommerziell erhältlich</td></tr><tr><td>Anti-IFN-& alpha; Antikörper EBI-1 Klon</td><td>eBioscience</td><td>BMS216C</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IFN-&alpha; Antikörper BMS216BK Klon</td><td>eBioscience</td><td>BMS216BK</td><td>Kein ELISA-Kit, sondern Bulk ABS</td></tr><tr><td>IFN & Alpha; 2c</td><td>eBioscience</td><td>BMS305</td><td>OK</td></tr><tr><td>IFN & alpha; I (17)</td><td>PBL</td><td>11150-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; 2a</td><td>PBL</td><td>11100-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; 2a</td><td>PeproTech</td><td>Nicht mehr lieferbar</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; 2b</td><td>PBL</td><td>11105-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; 1</td><td>PBL</td><td>11175-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN & alpha; 4a (M1)</td><td>PBL</td><td>11177-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; 4b (a4)</td><td>PBL</td><td>11180-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &Alpha; B2 (a8)</td><td>PBL</td><td>11115-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; C (a10)</td><td>PBL</td><td>11120-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN & alpha; D (a1)</td><td>PBL</td><td>11125-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; G (a5)</td><td>PBL</td><td>11135-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; F (a21)</td><td>PBL</td><td>11130-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; H2 (a14)</td><td>PBL</td><td>11145-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; J1 (a7)</td><td>PBL</td><td>11160-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; K (a6)</td><td>PBL</td><td>11165-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; WA (a16)</td><td>PBL</td><td>11190-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &lambda; 1</td><td>PeproTech</td><td>300-02L</td><td></td></tr><tr><td>IFN & lambda; 2</td><td>PeproTech</td><td>300-02K</td><td></td></tr><tr><td>IFN &Omega</td><td>PeproTech</td><td>300-02J</td><td></td></tr><tr><td>IFN &Beta;</td><td>PeproTech</td><td>300-02BC</td><td></td></tr><tr><td>IFN & Gamma</td><td>PeproTech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IFN-&alpha; ELISA</td><td>PBL</td><td>41115.1</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platten</td><td>Corning</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>ISRE-Reporter</td><td>Qiagen</td><td>CCS-008L</td><td></td></tr><tr><td>Fu-GENE HD Transfektionsreagenz</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Reduced Serum Mediuem</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Dual-Luciferase Reporter Assay</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 Ersatz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer NanoDrop 1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nicht mehr lieferbar</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Mikrozentrifugenröhrchen - 0,5 mL Filter</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC505096</td><td></td></tr><tr><td>Bead Conjugation Buffer</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>Kann nicht separat bestellt</td></tr><tr><td>werden Nicht kodiert Paramagnetische Perlen</td><td>Quanterix</td><td>101360</td><td></td></tr><tr><td>Bead Wash Buffer</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>Kann nicht separat bestellt</td></tr><tr><td>werden EDC</td><td>Fisher Scientific</td><td>11844071</td><td></td></tr><tr><td>Bead Blocking Buffer</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>Kann nicht separat bestellt werden</td></tr><tr><td>Bead Diluent</td><td>Buffer Quanterix</td><td>101362</td><td></td></tr><tr><td>Detektor und Probe Verdünnungsmittel</td><td>Quanterix</td><td>101359</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylierungsreaktionspuffer</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>Kann nicht separat bestellt</td></tr><tr><td>werden NHS-PEG4-Biotin Fisher</td><td>Scientific</td><td>11891195</td><td></td></tr><tr><td>diH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge für 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen (Heraens Fresco 21 Zentrifuge)</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002478</td><td></td></tr><tr><td>Standard-Labor-Wirbelmischer (MS2 Minishaker)</td><td>IKA</td><td>MS2</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten (10, 20, 200 und 1000 &mu; l)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tipps (10, 20, 200 und 1000 &mu; l)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnetabscheider für 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen (Life Technologies DynaMag-2)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Mini Tischzentrifuge (Galaxy MinisStar)</td><td>VWR</td><td>521-2844</td><td></td></tr><tr><td>Mischer/Schüttler (Eppendorf Thermomixer Comfort)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single molecule array (Simoa) Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SBG, Bead- und Detektor-Barcode-Etiketten</td><td>Quanterix</td><td>101652</td><td></td></tr><tr><td>15-ml-Reagenzflaschen</td><td>Quanterix</td><td>102411</td><td></td></tr><tr><td>Simoa-Proben 96-Well-Platten</td><td>Quanterix</td><td>101457</td><td></td></tr><tr><td>Simoa Discs</td><td>Quanterix</td><td></td><td></td>100001</tr><tr><td>Simoa 2.0 leitfähige Spitzen</td><td>Quanterix</td><td>101726</td><td></td></tr><tr><td>Simoa Küvetten</td><td>Quanterix</td><td>100803</td><td></td></tr><tr><td>Simoa SBG Reagenz</td><td>Quanterix</td><td>102295</td><td></td></tr><tr><td>Simoa RGP Reagenz</td><td>Quanterix</td><td>101736</td><td></td></tr><tr><td>Simoa System Buffer 1</td><td>Quanterix</td><td>100486</td><td></td></tr><tr><td>Simoa System Buffer 2</td><td>Quanterix</td><td>100487</td><td></td></tr><tr><td>Dichtungsöl</td><td>Quanterix</td><td>100206</td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Simoa HD-1 Analyzer</td><td>Quanterix</td><td>100032</td><td></td></tr><tr><td>Technologies</td><td></td><td></td><td></td></tr>Single <tr><td>molecule array (Simoa)</td><td>Quanterix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single molecule counting Erenna Immunoassay Systeme</td><td>Singluex</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

entwicklung und validierung eines empfindsamen einzelmolekül array digitale enzym-linked immunosorbentprobe assay für menschliche interferon-α

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Das Hauptziel dieses Protokolls ist es, die Entwicklung und Validierung einer Interferon (IFN) beschreiben-α Einzelmolekül Array digitale Enzyme-Linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) Assay. Dieses System ermöglicht die Quantifizierung des menschlichen IFN-α Proteins mit noch nie da gewesenen Sensibilität, und keine Kreuzreaktivität für andere Arten von IFN.
Der erste wichtige Schritt des Protokolls ist die Wahl des Antikörper-Paars, gefolgt von der Konjugation des Antikörpers erfassen paramagnetischen Perlen und biotinylierungen von den detektionsantikörper. Nach diesem Schritt können verschiedene Parameter wie Test-Konfiguration, Detektor antikörperkonzentration und Puffer Zusammensetzung geändert werden, bis die optimale Empfindlichkeit erreicht ist. Schließlich sind Spezifität und Reproduzierbarkeit der Methode bewertet, um die Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. Hier entwickelten wir eine IFN-α Einzelmolekül Array Assays mit einem Limit von Erkennung von 0,69 fg/mL mit hoher Affinität Autoantikörper von Patienten mit biallelische Mutationen im autoimmune Regulator (AIRE) Protein verursacht autoimmune Polyendocrinopathy isoliert Syndrom Typ 1/autoimmune Polyendocrinopathy-Candidiasis-ektodermalen Dystrophie (APS1/APECED). Wichtig ist, aktiviert diese Antikörper Nachweis von allen 13 IFN-α-Subtypen.
Diese neue Methode ermöglicht die Erkennung und Quantifizierung von IFN-α-Protein im menschlichen biologischen Proben in Attomolar Konzentrationen zum ersten Mal. Ein solches Instrument werden sehr nützlich bei der Überwachung der Ebenen dieses Zytokin in Gesundheit und Krankheit Staaten und vor allem Infektionen, Autoimmunität, Autoinflammation.

Zusammenfassend lässt sich sagen beschichtet eine Pan-IFN-α Einzelmolekül Array Assays mit einem Limit von Erkennung von 0,69 fg/mL, mit einer 2-Schritt-Konfiguration mit Capture Perlen mit 0,3 mg/mL Anti-IFN-α ein Antikörper und Anti-IFN-α B Erkennung Antikörper biotinylierte bei einem Biotin: Antikörper-Verhältnis von 30 wurde entwickelt. Die Konzentrationen für biotinylierte detektionsantikörper und SBG verwendet wurden 0,3 µg/mL und 150 pM, beziehungsweise. Dieser hochspezifischen Test ist in der Lage alle 13 IFN-α-Subtypen erkennen und reagiert nicht Kreuz mit anderen haben. So während es nicht möglich zu identifizieren und quantifizieren der einzelnen Arten der IFN-α, alle von ihnen erkannt werden und zusammen die einen Gesamtkonzentration Wert für IFN-α, das die 13 verschiedenen Unterklassen umfasst vermessen.
Um die mögliche diagnostische Wertigkeit des neu entwickelten Assays zu erkunden, wurden IFN-α Proteins im Plasma und Serum von gesunden Personen gemessen und verglichen mit Proben von Patienten mit SLE und JDM. Wie in Abbildung 7dargestellt, wurden hohe Niveaus des IFN-α Proteins in beiden Kohorten Krankheit im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen nachgewiesen. Die gepunktete Linie zeigt die LOD eine konventionelle kommerziell erhältlichen ELISA, illustrieren, wie dieser Ansatz nicht IFN-α Proteins bei diesen Patientengruppen trotz der ihr bekannten Verbänden von dieses Zytokin mit diesen Phänotypen erkennen würde. Darüber hinaus könnte IFN-α über 5 Protokolle, Größenordnung, quantifiziert werden, illustrieren den Dynamikbereich des Assays mit nachweisbaren Konzentrationen zwischen 1-10 fg/mL die hochsensiblen Charakter des Tests bestätigt.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57421/57421fig7.jpg"> Abbildung 7: Quantifizierung der IFN-α Proteins in Plasma und Serum von Patienten Kohorten. Diese Zahl wurde von Rodero Et al.modifiziert. 2017. Plasma von gesunden Kontrollpersonen (n = 20) und Patienten mit SLE (n = 72) und JDM (n = 43) wurden mit dem Pan-IFNα Einzelmolekül-Array-Assay getestet. Analyse erfolgte mittels One-Way ANOVA Test (Kruskal-Wallis) und Dunns mehrere Vergleich zwischen den Gruppen getestet. Median ist dargestellt. Gepunktete Linie zeigt LOD eine Referenz menschlichen Anti-IFN-α ELISA (1,95 Pg/mL = 1950 fg/mL). <a href="/files/ftp_upload/57421/57421fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Schritt</td>
			<td>Überlegungen</td>
			<td>Referenz</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">(1) Antikörper paar Wahl</td>
			<td>Ziel verschiedene Epitope</td>
			<td rowspan="3">Tabelle 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hohe Affinität</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kauf schnell / langsam Kaus
</td>
		</tr>
<tr>
<td>2. Antikörper paar Orientierung</td>
			<td rowspan="3">Wählen Sie mit der niedrigsten Limit of Detection</td>
			<td rowspan="3">Abbildung 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3. erfassen Sie antikörperkonzentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>(4) Biotin: Detektor-Antikörper-Verhältnis</td>
		</tr>
<tr>
<td>5. 2 vs. 3-Schritt-Konfiguration</td>
			<td>Wählen Sie die Bedingung mit dem höchsten Signal: Hintergrund-Verhältnis</td>
			<td>Abbildung 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>(6) Detektor antikörperkonzentration</td>
			<td rowspan="2">Wählen Sie mit der niedrigsten Limit of Detection</td>
			<td rowspan="2">Abbildung 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>(7) SBG Konzentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>8. Besonderheiten</td>
			<td>Kreuzreaktivität zu bewerten</td>
			<td rowspan="2">Abbildung 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>(9) Empfindlichkeit</td>
			<td>Anerkennung der Subtypen zu bewerten, (falls zutreffend)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10. die Reproduzierbarkeit</td>
			<td>Assay-Variabilität zu bewerten</td>
			<td>Abbildung 5</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Zusammenfassung der Schritte für die Entwicklung und Optimierung eines einzelnen Moleküls Array Assays. Diese Tabelle fasst die verschiedenen Schritte für die Entwicklung und Optimierung eines einzelnen Moleküls Array Assays, von der anfänglichen Auswahl der Antikörper paar bis die Beurteilung der Reproduzierbarkeit.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Antigen</td>
			<td>8H 1 (A)</td>
			<td>12H 5 (B)</td>
			<td>Sifalimumab</td>
			<td>Rontalizumab</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ1</td>
			<td>28.3</td>
			<td>51,3</td>
			<td>460</td>
			<td>22.63</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ2</td>
			<td>2563</td>
			<td>10.7</td>
			<td>9.02</td>
			<td>2.15</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ4</td>
			<td>5.11</td>
			<td>2.99</td>
			<td>35,35</td>
			<td>325.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ5</td>
			<td>2.01</td>
			<td>19.6</td>
			<td>93.29</td>
			<td>2.49</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ6</td>
			<td>64,7</td>
			<td>3.03</td>
			<td>4.97</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ7</td>
			<td>0,9</td>
			<td>0,63</td>
			<td>233.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ8</td>
			<td>302</td>
			<td>0,83</td>
			<td>691</td>
			<td>10,86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ10</td>
			<td>2,54</td>
			<td>0,71</td>
			<td>43.2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ14</td>
			<td>3224</td>
			<td>2.1</td>
			<td>14.52</td>
			<td>0,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ16</td>
			<td>1,83</td>
			<td>32,99</td>
			<td>59.18</td>
			<td>28.65</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ17</td>
			<td>2.21</td>
			<td>0,77</td>
			<td>890.9</td>
			<td>23.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ21</td>
			<td>2.78</td>
			<td>12.87</td>
			<td>1769</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Pan-Alpha Antikörper Auswahl. IC50 (ng/mL) anhand der Interferon-stimulierten Response-Element (ISRE)-Luciferase Neutralisation Assay. Tabelle zeigt IC50-Werte der mAbs in Einzelmolekül-Array-Assay für alle IFN-α-Subtypen verwendet. 10.000 HEK 293 MSR-Zellen wurden in weiße Hälfte-Bereich-96-Well-Platten ausgesät und umgekehrt mit 50 ng Komplettformel ISRE Firefly Luciferase Reporter und Renilla-Luciferase-Konstrukte mit Transfektion Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers transfiziert. Das Luciferase exprimierenden Konstrukt diente als eine interne Normalisierung Kontrolle. Zellen wurden über Nacht in reduziert Serum Medium ergänzt mit unwesentlichen Aminosäuren 0,1 mM, 1 mM Natrium Pyruvat, 0,5 % fötalen Rinderserum bei 37 ° C, 5 % CO2 in eine feuchte Atmosphäre inkubiert. Nach der Inkubation über Nacht wurden Zellen angeregt für 24 h mit Mischungen von rekombinanten menschlichen IFN-α mit oder ohne Anti-IFN-α mAbs oder Kontrolle IgG, die für 1 h bei 37 ° c preincubated worden war-haltigem medium Nach 24 Stunden der Stimulation wurden dual Luciferase Reporter Assays nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. «-» Nicht bestimmt. Sifalimumab ist ein vollständig humaner Immunglobulin G1 κ monoklonaler Antikörper, der bindet und neutralisiert die Mehrheit der IFN-α-Untertypen; Rontalizumab ist ein humanisierter monoklonaler Antikörper gegen IFN-α. Adaptiert von Meyer Et Al. 2016 und Rodero Et al. 2017.
Ergänzende Tabelle1: Auswahl der Antikörper Orientierung erfassen antikörperkonzentration auf Perlen und biotinylierungen Verhältnis. Die zwei möglichen unterschiedlichen Konfigurationen wurden getestet, mit dem Anti-IFN-α A als Capture-Antikörper und Anti-IFN-α B als Erkennung Antikörper (A) und Vice Versa (B). IFNα - 2c wurde als Antigen eingesetzt. Verschiedene Aufnahme-Antikörper-Konzentrationen sowie Biotin: Antikörper (B:A)-Verhältnisse wurden für beide Konfigurationen getestet. Sättigung (SA). Orange: AEB-Werte, die für LOD Berechnung verwendet wurden; Diese Konzentrationen galten leer wie die AEB-Werte unverändert. LOD war als meine leere + 3SD. berechnet <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_1.xlsx">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Tabelle 2: Test der 2 Vs 3-Schritt Konfiguration. Die 2- und 3 - Schritt-Konfigurationen wurden anhand IFNα - 2c, als Antigen. AEB-Werte werden auch als Signal/Rationen (S/B) Hintergrund für beide Bedingungen angezeigt. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_2.xlsx">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Tabelle3: Optimierung der Detektor und SBG Konzentration. Drei verschiedene Konzentrationen der biotinylierte Detektor Antikörper (0,1 0,3 und 0,6 µg/mL) zusammen mit drei unterschiedlichen Konzentrationen der SBG (50, 150 und 250 pM) bewertet wurden. AEB-Werte werden für die neun getesteten Bedingungen angezeigt. Orange: AEB-Werte, die für LOD Berechnung verwendet wurden; Diese Konzentrationen galten leer wie die AEB-Werte unverändert. LOD war als meine leere + 3SD. berechnet <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_3.xlsx">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Tabelle 4: Spezifität und Sensitivität des optimierten IFNα Einzelmolekül Array Assays. Durchschnittliche Enzym pro Perlen Werte werden angezeigt wenn IFN-β, IFN-λ1, IFN-λ2, IFN-ω und IFN-γ waren rekombinante Proteine getestet (A), zusammen mit den 16 Subtypen des IFN-α (B). «-» Nicht bestimmt. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_4.xlsx">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Tabelle 5: Reproduzierbarkeit des optimierten IFNα Einzelmolekül Array Assays. Die AEB-Mittelwerte für alle drei unabhängigen Läufe sind zu einer Konzentration von 10.000 fg/mL aufgetaucht. «-» Nicht bestimmt. Sättigung (SA). <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_5.xlsx">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Tabelle 6: Protein Wettbewerb Assay. Durchschnittliche Enzym pro Perlen Werte werden angezeigt, für alle Bedingungen getestet. Messungen erfolgten in zweifacher Ausfertigung. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_6.xlsx">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>

Hier präsentieren wir ein Protokoll um die Entwicklung und Validierung eines einzelnen Moleküls Array digitale ELISA Assays, ermöglicht ultra-sensitive Detektion von allen IFN-α-Subtypen in humanen Proben zu beschreiben.

Entwicklung und Validierung eines empfindsamen Einzelmolekül Array digitale Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay für menschliche Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen zur Art, Regulation und biologischen Wirkung der Interferon-induzierten Reaktionen in verschiedenen Krankheitsumgebungen, einschließlich Autoimmunität und Infektionen, zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre eigene Sensibilität. Diese Technik hat ein großes Potenzial für die Entdeckung von Biomarkern, um das Patientenmanagement bei vielen Krankheiten zu verbessern, da sie Zytokine mit beispielloser Empfindlichkeit quantifizieren kann.Ein wichtiger Schritt bei diesem Ansatz war die Neutralisierung von Aktivitäten im Zusammenhang mit Patienten mit autoimmunem Polyindocrin-System Typ eins. Laden Sie zunächst 280 Millionen paramagnetische Kügelchen in ein Mikrofugenröhrchen und achten Sie dabei auf das Volumen. Dann die Kügelchen pulsieren, drehen Sie sie und legen Sie das Röhrchen für eine Minute auf einen Magnetabscheider.Entfernen und entsorgen Sie die Verdünnungslösung, um die Kügelchen zu isolieren. Als nächstes die Kügelchen zweimal mit BWB und zweimal mit BCB waschen. Fügen Sie für jede Wäsche 200 Mikroliter hinzu und wirbeln Sie die Tube fünf Sekunden lang ein.Trennen Sie dann die Kügelchen mit dem Magnetabscheider von der Lösung. Entsorgen Sie das Verdünnungsmittel nach einer Minute Trennung. Als nächstes fügen Sie 190 Mikroliter BCB pro Bead-Volumen hinzu.Dann die Tube kurz wirbeln, die Tube pulsieren, drehen Sie die Tube und legen Sie die gewaschenen Kügelchen auf Eis. Um die Kügelchen zu aktivieren, kombinieren Sie einen Milliliter kaltes BCB mit 10 Milligramm EDC und wirbeln Sie es auf, bis die Lösung homogen ist. Arbeiten Sie schnell und sicher bei der Verwendung von EDC, da es inhärent instabil und equinus solution ist.Geben Sie dann 10 Mikroliter kaltes, verdünntes EDC pro Bead-Volumen in die Bead-Suspension und wirbeln Sie die Beads kurz auf. Als nächstes legst du die Perlen für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einen Shaker. Um Antikörper an die Kügelchen zu konjugieren, werden die aktivierten Kügelchen zunächst durch Wirbeln und Pulsieren gedreht.Legen Sie dann die Kügelchen für eine Minute in einen Magnetabscheider und entsorgen Sie den BCB-Überstand. Entfernen Sie anschließend die Röhre vom Magneten und waschen Sie die Kügelchen zweimal mit 200 Mikrolitern BCB. Dann die Kügelchen vortexen, pulsieren und magnetisch trennen, um den Puffer zu entfernen.Fügen Sie dann schnell 200 Mikroliter kalten, pufferausgetauschten Antikörper zu den aktivierten Kügelchen hinzu. Nachdem Sie die Kügelchen in Lösung vortext haben, legen Sie die Suspension zwei Stunden lang bei 1.000 U/min auf den Schüttler bei Raumtemperatur. Beginnen Sie damit, der mit Antikörpern beschichteten Bead-Suspension einen Impulsspin zu geben, und verwenden Sie dann die magnetische Säule, um den Puffer zu entfernen.Überprüfen Sie als Nächstes die Konzentration des Proteins im Puffer. Verwenden Sie ein Spektralphotometer mit geringem Volumen. Zu diesem Zeitpunkt sind die Antikörper an die Kügelchen gekoppelt und jeder Wert über Null bedeutet, dass die Kügelchen mit Antikörpern gesättigt sind.Waschen Sie nun die Kügelchen mit 200 Mikrolitern BWB, wie bei allen vorherigen Wäschen. Übertragen Sie dann den Überstand in ein neues Röhrchen und überprüfen Sie die Proteinkonzentration. Die Quantifizierung der Proteine, die aus den Kügelchen freigesetzt werden, ermöglicht die Messung der Antikörperkopplung.Waschen Sie die Kügelchen dann erneut mit 200 Mikrolitern BWB. Fügen Sie dann 200 Mikroliter Bead-Blocking-Puffer hinzu, wirbeln Sie das Röhrchen fünf Sekunden lang vor und geben Sie es für 30 Minuten in den Schüttler bei Raumtemperatur. Nach 30 Minuten sind die Kügelchen verstopft.Waschen Sie sie dann einmal mit 200 Mikrolitern BWB und waschen Sie sie anschließend zweimal mit 200 Mikrolitern Bead Diluent Buffer für jede Wäsche. Lagern Sie dann die beschichteten und blockierten Kügelchen in 200 Mikrolitern Bead-Verdünnungspuffer bei vier Grad Celsius. In diesem Abschnitt des Videos werden Strategien vorgestellt, wie die Assay-Bedingungen mit der Einzelmolekül-Array-Analysator-Software in der Home-Brew-Konfiguration optimiert werden können.Beginnen Sie mit dem Testen verschiedener Kombinationen von Fängerantikörpern, konjugierten Kügelchen und Biotinylierungsnachweis-Antikörpern in beiden Antikörperkombinationen. Als nächstes werden Kombinationen der drei verschiedenen Capture-Antikörper-Konzentrationen mit zwei unterschiedlichen Biotinylierungsverhältnissen für den Nachweis und Capture-Antikörper getestet und umgekehrt. Wählen Sie dann die Kombination, die die niedrigste Erkennungsstufe bietet, und verwenden Sie sie für weitere Schritte.In diesem Fall ergibt ein Verhältnis von 30 zu einem Verhältnis von Biotin zu Antikörpern die beste Nachweisgrenze. Vergleichen Sie als Nächstes eine zweistufige Konfiguration mit einer dreistufigen Konfiguration. Dreistufige Konfigurationen haben drei verschiedene Inkubationsschritte.Einen mit dem Capture-Antikörper, einen mit dem Nachweis-Antikörper und einen letzten, dritten für die SBG-Enzymmarkierung. Zweistufige Konfigurationen kombinieren die Erfassungs- und die Erkennungsinkubation. Führen Sie den Einzelmolekül-Array-Analysator mit den ausgewählten Fang- und Detektor-Antikörperkonzentrationen und -verhältnissen in den zwei- und dreistufigen Konfigurationen aus, die im Analysator vorkonfiguriert sind, gemäß den Anweisungen des Herstellers.Wählen Sie dann die Konfiguration aus, die die höchste Empfindlichkeit ermöglicht, und bewahren Sie sie für zukünftige Schritte auf. In diesem Fall bietet die zweistufige Konfiguration an jedem Testpunkt eine etwas höhere Empfindlichkeit. Optimieren Sie als Nächstes die Konzentrationen des Detektor-Antikörpers und des SBG.Testen Sie drei verschiedene Konzentrationen von Detektor-Antikörpern mit drei verschiedenen Konzentrationen von SBG. Wählen Sie die Konzentrationen, die die höchste Empfindlichkeit bieten, und bewahren Sie sie für zukünftige Schritte auf. In diesem Fall haben 0,3 Mikrogramm pro Milliliter Antikörper und 150 Pica-molaren SBG das optimale Nachweisniveau mit niedrigen Hintergrundwerten und zufällig mittlerer Amplitude.Weitere Optimierungsschritte finden Sie im Textprotokoll. Darin befinden sich Verfahren zur Optimierung der Assay-Spezifität und -Reproduzierbarkeit sowie ein Assay zur Proteinkonkurrenz. Mit einem Assay, der für den Nachweis von 13 Unterklassen von Interferon-alpha optimiert war, wurden Plasma und Serum bei SLE-Patienten, JDM-Patienten und gesunden Kontrollpersonen analysiert.In beiden Krankheitskohorten wurden hohe Konzentrationen des Interferon-alpha-Proteins nachgewiesen. Die gestrichelte Linie zeigt den Nachweisgrad eines konventionellen, kommerziell erhältlichen Eliza, das das Interferon-alpha-Protein bei diesen Patientengruppen nicht nachweisen würde, obwohl die Rolle dieses Zytokins bei diesen Erkrankungen bekannt ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen Einzelmolekül-Array-Assay für die Analyse Ihrer Wahl entwickeln und validieren können.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass während der Zellauswahl von Antikörpern. Seit seiner Entwicklung hat dieser Assay eine bessere Charakterisierung der Rolle von Interferon-alpha bei einer Vielzahl von Autoimmunerkrankungen und -infektionen ermöglicht. Dieser Assay diente auch dazu, das Ansprechen auf neue Therapien zu überwachen und die zellulären Akteure zu identifizieren, die für bestimmte Autoimmunerkrankungen verantwortlich sind.

development-validation-an-ultrasensitive-single-molecule-array

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

ampliPHOX kolorimetrischen Nachweis Technologie wird als eine kostengünstige Alternative zu Fluoreszenzdetektion für Mikroarrays vorgestellt. Basierend auf Photopolymerisation, produziert ampliPHOX festen Polymer-Spots, die mit bloßem Auge in nur wenigen Minuten. Die Ergebnisse werden dann abgebildet und automatisch interpretiert mit einer einfachen, aber leistungsstarken Softwarepaket.

ampliPHOX kolorimetrischen Nachweis einer DNA Microarray für Influenza

Quantitative, High-Throughput-, Echtzeit-und Label-free biomolekularen Erkennung (DNA, Proteine, etc.) auf...

Biomolekulare Erkennung Einsatz der Interferometrische Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

Diese Methode beschreibt die Verwendung von Infrarot-Farbstoff basierende Imaging-System für den Nachweis von H1N1 in bronchioalveolar Lavage (BAL) Flüssigkeit von infizierten Mäuse mit einer hohen Empfindlichkeit. Diese Methodik in einem 96 durchgeführt werden kann - oder 384-Well-Platte, erfordert &lt;10 ul Volumen von Testmaterial und hat das Potenzial für die gleichzeitige Screening von mehreren Erregern.

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Die Charakterisierung von T-Zell-Epitopen von Krankheitserregern, die lokalisierte Infektionen wie das humane Papillomvirus verursachen, ist aufgrund der begrenzten Anzahl von T-Zellen im Umlauf eine Herausforderung. Es wird eine Methode beschrieben, bei der seltene T-Zellen isoliert und charakterisiert wurden, ausgehend von einer sehr geringen Anzahl von Zellen.

Verwendung von Interferon-γ enzyme-linked immunospot Assay zur Novel T-Zell-Epitope des humanen Papillomvirus Charakterisieren

Mit Luminex Corporation xMAP-Mikrokugel-Technologie haben wir die Multiplex Fluorometric Immunoassay (MFIA) für serologischen Überwachung von verschiedenen Labors Tierarten entwickelt. Die MFIA ist eine Suspension Microarray, wo Antigen, Gewebekontrolle oder Immunglobuline kovalent an farbkodierten Polystyrol-Mikrokügelchen verbunden sind. Die MFIA Prüfverfahren sowie verschiedene Themen zur Fehlerbehebung adressiert ist.

Multiplexed Fluorometric Immunoassay Testing Methodology und Fehlerbehebung

Dieses Video zeigt eine bildgebende Methode zur Visualisierung der in situ Interferon-gamma (IFN-γ) Sekretion in der Milz der Maus. Nach einer bakteriellen Infektion und der Induktion der IFN-γ-Akkumulation in T-Zellen und natürlichen Killerzellen wird die Milz aus der Maus entnommen. Nach der Entnahme von Gewebeschnitten wird eine Immunfärbung durchgeführt, um IFN-γ in den Zellen sichtbar zu machen.

Assay zur Identifizierung der Interferon-gamma-Sekretion in lymphatischen Organen der Maus

Dieses Video zeigt einen sekretierten embryonalen alkalischen Phosphatase-Assay unter Verwendung von HEK-Blue Interferon-α/β-Reporterzellen zur Quantifizierung der Typ-I-Interferone (IFNs), die nach Stimulation plasmazytoider dendritischer Zellen durch HIV-1-infizierte CD4+ T-Zellen freigesetzt werden.

Quantifizierung von bioaktiven Typ-I-Interferonen mit Hilfe eines sezernierten embryonalen alkalischen Phosphatase-Reporter-Assays

Dieses Protokoll beschreibt einen Hochdurchsatz-qRT-PCR-Assay für die Analyse von Typ I und III IFN-Expressionssignaturen. Der Assay unterscheidet Unterschiede zwischen einzelnen Basenpaaren zwischen den sehr ähnlichen Transkripten dieser Gene. Durch die Chargenmontage und das robotergestützte Pipettieren sind die Assays konsistent und reproduzierbar.

Hochdurchsatz-quantitative Echtzeit-RT-PCR-Assay zur Bestimmung Expressionsprofile der Typen I und III Interferon-Formationsglieder

Unter Verwendung einer gedruckten Glykan-Microarray-Strategie wurde ein konventioneller 96-Well-Plattenassay für die Analyse der Hämagglutinin-Avidität und Spezifität des Influenza-A-Virus für Sialinsäure-haltige Rezeptoren miniaturisiert.

Ein miniaturisiertes Glycan Microarray-Test zur Beurteilung der Avidität und Spezifität von Influenza-A-Virus Hämagglutininarten

Aktuellen Multiplex Diagnostik Zika, Chikungunya und Dengue-Viren erfordern komplexe Probenvorbereitung und teure Instrumentierung, und sind in geringen Ressourcen Umgebungen geeignet zu erkennen. Wir zeigen eine Diagnose, mit denen Isotherme Verstärkung mit zielgruppenspezifischer Strang verschieblich Sonden zu erkennen und diese Viren mit hoher Sensitivität und Spezifität zu unterscheiden.

Gemultiplexten isothermen Verstärkung basiert Diagnoseplattform zu erkennen, Zika, Chikungunya und Dengue-Fieber 1

Dieser Bericht beschreibt ein automatisiertes Protokoll für Multiplex-Immunfluoreszenz-Assays (mIF) auf einem automatisierten Objektträgerfärbegerät. Es demonstriert die hohe Reproduzierbarkeit der räumlichen Proteomik auf Standard-Hochdurchsatz-Gewebe-Autostainern und Ganzobjektträger-Fluoreszenz-Imagern, was ideal für kundenspezifische mIF-Assays über eine große Anzahl von Gewebeobjektträgern in der translationalen Forschung ist.

Automatisierte Hochdurchsatz-Multiplex-Immunfluoreszenz-Assays für die translationale Forschung

Erfahren Sie die Entwicklung eines hochempfindlichen Single-Molecule-Array-digital-ELISA-Assays zur Detektion aller IFN-α-Subtypen in humanen Proben. Diese Methode ermöglicht Biomarker-Discovery bei Autoimmunerkrankungen.

Entwicklung und Validierung eines empfindsamen Einzelmolekül Array digitale Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay für menschliche Interferon-α (Video) | JoVE Journal

Entwicklung und Validierung eines empfindsamen Einzelmolekül Array digitale Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay für menschliche Interferon-α

Weitere Videos entdecken