Entwicklung und Validierung eines empfindsamen Einzelmolekül Array digitale Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay für menschliche Interferon-α

Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen zur Art, Regulation und biologischen Wirkung der Interferon-induzierten Reaktionen in verschiedenen Krankheitsumgebungen, einschließlich Autoimmunität und Infektionen, zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre eigene Sensibilität. Diese Technik hat ein großes Potenzial für die Entdeckung von Biomarkern, um das Patientenmanagement bei vielen Krankheiten zu verbessern, da sie Zytokine mit beispielloser Empfindlichkeit quantifizieren kann.

Ein wichtiger Schritt bei diesem Ansatz war die Neutralisierung von Aktivitäten im Zusammenhang mit Patienten mit autoimmunem Polyindocrin-System Typ eins. Laden Sie zunächst 280 Millionen paramagnetische Kügelchen in ein Mikrofugenröhrchen und achten Sie dabei auf das Volumen. Dann die Kügelchen pulsieren, drehen Sie sie und legen Sie das Röhrchen für eine Minute auf einen Magnetabscheider.

Entfernen und entsorgen Sie die Verdünnungslösung, um die Kügelchen zu isolieren. Als nächstes die Kügelchen zweimal mit BWB und zweimal mit BCB waschen. Fügen Sie für jede Wäsche 200 Mikroliter hinzu und wirbeln Sie die Tube fünf Sekunden lang ein.

Trennen Sie dann die Kügelchen mit dem Magnetabscheider von der Lösung. Entsorgen Sie das Verdünnungsmittel nach einer Minute Trennung. Als nächstes fügen Sie 190 Mikroliter BCB pro Bead-Volumen hinzu.

Dann die Tube kurz wirbeln, die Tube pulsieren, drehen Sie die Tube und legen Sie die gewaschenen Kügelchen auf Eis. Um die Kügelchen zu aktivieren, kombinieren Sie einen Milliliter kaltes BCB mit 10 Milligramm EDC und wirbeln Sie es auf, bis die Lösung homogen ist. Arbeiten Sie schnell und sicher bei der Verwendung von EDC, da es inhärent instabil und equinus solution ist.

Geben Sie dann 10 Mikroliter kaltes, verdünntes EDC pro Bead-Volumen in die Bead-Suspension und wirbeln Sie die Beads kurz auf. Als nächstes legst du die Perlen für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einen Shaker. Um Antikörper an die Kügelchen zu konjugieren, werden die aktivierten Kügelchen zunächst durch Wirbeln und Pulsieren gedreht.

Legen Sie dann die Kügelchen für eine Minute in einen Magnetabscheider und entsorgen Sie den BCB-Überstand. Entfernen Sie anschließend die Röhre vom Magneten und waschen Sie die Kügelchen zweimal mit 200 Mikrolitern BCB. Dann die Kügelchen vortexen, pulsieren und magnetisch trennen, um den Puffer zu entfernen.

Fügen Sie dann schnell 200 Mikroliter kalten, pufferausgetauschten Antikörper zu den aktivierten Kügelchen hinzu. Nachdem Sie die Kügelchen in Lösung vortext haben, legen Sie die Suspension zwei Stunden lang bei 1.000 U/min auf den Schüttler bei Raumtemperatur. Beginnen Sie damit, der mit Antikörpern beschichteten Bead-Suspension einen Impulsspin zu geben, und verwenden Sie dann die magnetische Säule, um den Puffer zu entfernen.

Überprüfen Sie als Nächstes die Konzentration des Proteins im Puffer. Verwenden Sie ein Spektralphotometer mit geringem Volumen. Zu diesem Zeitpunkt sind die Antikörper an die Kügelchen gekoppelt und jeder Wert über Null bedeutet, dass die Kügelchen mit Antikörpern gesättigt sind.

Waschen Sie nun die Kügelchen mit 200 Mikrolitern BWB, wie bei allen vorherigen Wäschen. Übertragen Sie dann den Überstand in ein neues Röhrchen und überprüfen Sie die Proteinkonzentration. Die Quantifizierung der Proteine, die aus den Kügelchen freigesetzt werden, ermöglicht die Messung der Antikörperkopplung.

Waschen Sie die Kügelchen dann erneut mit 200 Mikrolitern BWB. Fügen Sie dann 200 Mikroliter Bead-Blocking-Puffer hinzu, wirbeln Sie das Röhrchen fünf Sekunden lang vor und geben Sie es für 30 Minuten in den Schüttler bei Raumtemperatur. Nach 30 Minuten sind die Kügelchen verstopft.

Waschen Sie sie dann einmal mit 200 Mikrolitern BWB und waschen Sie sie anschließend zweimal mit 200 Mikrolitern Bead Diluent Buffer für jede Wäsche. Lagern Sie dann die beschichteten und blockierten Kügelchen in 200 Mikrolitern Bead-Verdünnungspuffer bei vier Grad Celsius. In diesem Abschnitt des Videos werden Strategien vorgestellt, wie die Assay-Bedingungen mit der Einzelmolekül-Array-Analysator-Software in der Home-Brew-Konfiguration optimiert werden können.

Beginnen Sie mit dem Testen verschiedener Kombinationen von Fängerantikörpern, konjugierten Kügelchen und Biotinylierungsnachweis-Antikörpern in beiden Antikörperkombinationen. Als nächstes werden Kombinationen der drei verschiedenen Capture-Antikörper-Konzentrationen mit zwei unterschiedlichen Biotinylierungsverhältnissen für den Nachweis und Capture-Antikörper getestet und umgekehrt. Wählen Sie dann die Kombination, die die niedrigste Erkennungsstufe bietet, und verwenden Sie sie für weitere Schritte.

In diesem Fall ergibt ein Verhältnis von 30 zu einem Verhältnis von Biotin zu Antikörpern die beste Nachweisgrenze. Vergleichen Sie als Nächstes eine zweistufige Konfiguration mit einer dreistufigen Konfiguration. Dreistufige Konfigurationen haben drei verschiedene Inkubationsschritte.

Einen mit dem Capture-Antikörper, einen mit dem Nachweis-Antikörper und einen letzten, dritten für die SBG-Enzymmarkierung. Zweistufige Konfigurationen kombinieren die Erfassungs- und die Erkennungsinkubation. Führen Sie den Einzelmolekül-Array-Analysator mit den ausgewählten Fang- und Detektor-Antikörperkonzentrationen und -verhältnissen in den zwei- und dreistufigen Konfigurationen aus, die im Analysator vorkonfiguriert sind, gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Wählen Sie dann die Konfiguration aus, die die höchste Empfindlichkeit ermöglicht, und bewahren Sie sie für zukünftige Schritte auf. In diesem Fall bietet die zweistufige Konfiguration an jedem Testpunkt eine etwas höhere Empfindlichkeit. Optimieren Sie als Nächstes die Konzentrationen des Detektor-Antikörpers und des SBG.

Testen Sie drei verschiedene Konzentrationen von Detektor-Antikörpern mit drei verschiedenen Konzentrationen von SBG. Wählen Sie die Konzentrationen, die die höchste Empfindlichkeit bieten, und bewahren Sie sie für zukünftige Schritte auf. In diesem Fall haben 0,3 Mikrogramm pro Milliliter Antikörper und 150 Pica-molaren SBG das optimale Nachweisniveau mit niedrigen Hintergrundwerten und zufällig mittlerer Amplitude.

Weitere Optimierungsschritte finden Sie im Textprotokoll. Darin befinden sich Verfahren zur Optimierung der Assay-Spezifität und -Reproduzierbarkeit sowie ein Assay zur Proteinkonkurrenz. Mit einem Assay, der für den Nachweis von 13 Unterklassen von Interferon-alpha optimiert war, wurden Plasma und Serum bei SLE-Patienten, JDM-Patienten und gesunden Kontrollpersonen analysiert.

In beiden Krankheitskohorten wurden hohe Konzentrationen des Interferon-alpha-Proteins nachgewiesen. Die gestrichelte Linie zeigt den Nachweisgrad eines konventionellen, kommerziell erhältlichen Eliza, das das Interferon-alpha-Protein bei diesen Patientengruppen nicht nachweisen würde, obwohl die Rolle dieses Zytokins bei diesen Erkrankungen bekannt ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen Einzelmolekül-Array-Assay für die Analyse Ihrer Wahl entwickeln und validieren können.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass während der Zellauswahl von Antikörpern. Seit seiner Entwicklung hat dieser Assay eine bessere Charakterisierung der Rolle von Interferon-alpha bei einer Vielzahl von Autoimmunerkrankungen und -infektionen ermöglicht. Dieser Assay diente auch dazu, das Ansprechen auf neue Therapien zu überwachen und die zellulären Akteure zu identifizieren, die für bestimmte Autoimmunerkrankungen verantwortlich sind.