Eine Immunfluoreszenz-basierte Methode zur Quantifizierung von Replikationsstress in Krebszellen

Beginnen wir mit Krebszellen, die IdU tragen, einen synthetischen Ersatz für Thymidin-Nukleotid, der bereits in ihre DNA integriert ist. Wenn diese Zellen auf Replikationsstress stoßen, stoppt ihre DNA-Synthese und IdU wird in exponierten einzelsträngigen DNA-Regionen freigelegt.

Fixieren Sie die Zellen und fügen Sie Detergenzmoleküle hinzu, um die Zellmembran durchlässig zu machen.

Fügen Sie BSA hinzu, um Nicht-Ziel-Antikörper-Bindungsstellen zu blockieren.

Einführung von Anti-IdU-Antikörpern, die mit IdU-markierter einzelsträngiger DNA interagieren.

Fügen Sie mit grünem Fluorophor markierte Sekundärantikörper hinzu, die auf Anti-IdU-Antikörper abzielen. Entfernen Sie die ungebundenen Antikörper.

Legen Sie das Deckglas auf einen Objektträger, der ein Einbettmedium mit einem Fluoreszenzfarbstoff enthält, der die Zellkerne färbt.

Beobachten Sie unter einem Fluoreszenzmikroskop die blauen Kerne.

Die grünen Fluoreszenzherde stellen Antikörper dar, die an die einzelsträngige DNA binden.

Zählen Sie die Anzahl der Herde, um das Ausmaß der Replikationsbelastung zu quantifizieren.

Geben Sie 1 Milliliter Zellsuspension auf Poly-L-Lysin-Deckgläser, die in die Vertiefungen einer 24-Well-Platt