Eine Multiplex-Immunfärbemethode unter Verwendung von Primärantikörpern derselben Wirtsspezies

Es wird ein fixierter und permeabilisierter Nebennierenschnitt genommen, der aus einer Rinde und einer Medulla besteht. Behandeln Sie es mit einem siedenden sauren Puffer, indem Sie die fixierungsinduzierten Vernetzungen für die Antigen-Demaskierung aufbrechen.

Blockieren Sie die unspezifischen Bindungsstellen und führen Sie primäre Antikörper ein, die an Cortex-spezifische Marker binden.

Biotinylierte Sekundärantikörper werden hinzugefügt, die auf die Primärantikörper und Streptavidin-konjugierte Peroxidasen abzielen, die an Biotin binden.

Führen Sie ein mit Fluorophor markiertes Tyramid und Wasserstoffperoxid ein.

Die immobilisierten Peroxidasen verwenden Wasserstoffperoxid, um Tyramid zu aktivieren, das an nahe gelegene Proteine bindet und den Kortex markiert.

Behandeln Sie anschließend den Abschnitt mit dem Siedepuffer, um die gebundenen Antikörper zu entfernen.

Einführung der gleichen von der Wirtsspezies erzeugten Primärantikörper, die auf Medulla-spezifische Marker und biotinylierte Sekundärantikörper abzielen.

Führen Sie Streptavidin-konjugierte Peroxidasen und ein anderes Fluorophor-konjugiertes Tyramid ein, um das Mark zu markieren.

Das Entfernen der Cortex-spezifischen Primärantikörper hemmt die wieder eingeführten Sekundärantikörper, die an sie binden, und verhindert so eine Kreuzreaktivität.

Wenden Sie eine Kernfärbung an und führen Sie eine Bildgebung durch, um die deutlich gefärbte Rinde und Medulla sichtbar zu machen, wobei keine Antikörper-Kreuzreaktivität bestätigt wird.

Vor dem Färben entwachst und rehydrieren Sie formalinfixierte, in Paraffin eingebettete Objektträger mit fünfminütigem Eintauchen in jede Lösung, wie angegeben. Legen Sie die Objektträger nach dem zweiten Eintauchen in destilliertes Wasser in 275 Milliliter kochender Natriumcitratlösung auf den Boden einer Pipettenspitzenbox mit Deckel und stellen Sie die Box acht Minuten lang in eine 700-Watt-Mikrowelle bei 70 % Leistung.

Öffnen Sie am Ende der Behandlung den Deckel und lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie die Objektträger mit drei fünfminütigen Wäschen von frischem PBST in einem Coplin-Glas waschen. Um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren, schütteln Sie nach dem letzten Waschen das überschüssige PBST von jedem Objektträger und bedecken Sie die Objektträger mit einer ausreichenden Menge einer geeigneten Blockierungslösung.

Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer schütteln Sie die überschüssige Blockierungslösung von jedem Objektträger und fügen Sie jeder Probe 250 Mikroliter des ersten primären Antikörpers von Interesse hinzu. Um ein Austrocknen der Proben zu verhindern, können die Objektträger mit einem Stück Paraffinfolie bedeckt werden.

Nach einer nächtlichen Inkubation bei vier Grad Celsius in der befeuchteten Kammer waschen Sie die Objektträger dreimal mit frischem PBST für fünf Minuten pro Waschgang. Schütteln Sie das überschüssige PBST ab und bedecken Sie dann schnell jeden Objektträger mit 250 Mikrolitern einer geeigneten Sekundärantikörperlösung für eine einstündige Inkubation in der befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur.

Waschen Sie die Objektträger am Ende der Inkubation dreimal in frischem PBST, wie gezeigt, und fügen Sie jedem Objektträger 250 Mikroliter frisch zubereitete Streptavidin-Meerrettichperoxidase hinzu. Waschen Sie die Objektträger nach 30 Minuten bei Raumtemperatur dreimal in frischem PBST, schütteln Sie dann das überschüssige PBST ab und bedecken Sie jeden Objektträger mit 250 Mikrolitern frisch zubereiteter Fluorophor-Tyramid-Lösung.

Eine Minute später tauchen Sie die Objektträger in frisches PBST, gefolgt von drei zweiminütigen Waschgängen in frischem PBST. Tragen Sie nach der letzten Wäsche einige Tropfen einer 1-zu-1-Glycerin-zu-PBS-Lösung auf die Schnitte auf und prüfen Sie durch Fluoreszenzmikroskopie, ob ein Fluoreszenzsignal

Um den ersten Antikörperkomplex zu entfernen, legen Sie die mit Antikörpern markierten Objektträger mindestens acht Minuten lang in 275 Milliliter siedende Natriumcitratlösung, wie gezeigt. Öffnen Sie am Ende der Behandlung den Deckel und lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie die Objektträger dreimal fünf Minuten lang pro Waschgang mit PBST waschen.

Um das zweite Zielprotein von Interesse zu färben, wird nach dem Nachweis der Blockierung für unspezifische Bindung jede Probe über Nacht mit 250 Mikrolitern des zweiten primären Antikörpers von Interesse bei vier Grad Celsius markiert. Waschen Sie die Objektträger am nächsten Morgen dreimal für fünf Minuten in frischem PBST pro Waschgang, bevor Sie jeden Objektträger mit 250 Mikrolitern einer geeigneten Sekundärantikörperlösung für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur bedecken.

Waschen Sie die Objektträger am Ende der Inkubation dreimal in frischem PBST, wie gezeigt, und fügen Sie jedem Objektträger 250 Mikroliter frisch zubereitete Streptavidin-Meerrettichperoxidase hinzu. Um das Signal für das zweite Zielprotein von Interesse nach drei PBST-Waschungen zu entwickeln, behandeln Sie die Objektträger mit einem Fluorophor-konjugierten Tyramid in einem anderen Fluoreszenzspektrum.

Um die Entwicklung des Tyramidsignals zu stoppen, tauchen Sie die Objektträger in PBST und färben Sie die Proben mit einem geeigneten Kernfarbstoff.