Immunhistochemie und Multiple Markierung mit Antikörper aus dem gleichen Host Arten, die Adult Neurogenese Studieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Einschränkungen der indirekten Immunfluoreszenz zu umgehen, um neurale Vorläuferzellen zu untersuchen. Wenn geeignete Primärantikörper von verschiedenen Wirtsspezies nicht verfügbar sind. Zunächst wird ein Thymidin-Analogon injiziert, um die sich teilenden Zellen zu markieren, wonach das Gewebe geerntet, verarbeitet und in Kryoschnitte geschnitten wird.

Dann wird zu Beginn eine sequentielle multiple Immunfluoreszenz durchgeführt. Dabei wird ein unmarkierter Primärantikörper appliziert, der dann an einen fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper gebunden wird. Als nächstes werden die offenen Perikopen auf dem ersten Sekundärantikörper mit Serum der Primärantikörperspezies blockiert, und alle Immunglobuline, die vom zweiten Sekundärantikörper erkannt werden könnten, werden mit unkonjugierten Fab-Fragmenten bedeckt.

Dadurch kann das Gewebe mit einem zweiten Primärantikörper behandelt werden, der mit einem anderen Sekundärantikörper markiert werden kann. Letztendlich werden Bilder der Schnitte verwendet, um die Entwicklung und Regulation von neuralen Vorläuferzellen als Reaktion auf bestimmte Reize und ihre Beteiligung an bestimmten Gehirnfunktionen zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der simultanen multiplen Immunfluoreszenz besteht darin, dass sie Probleme umgeht, die sich normalerweise aus der Notwendigkeit ergeben, Primärantikörper zu verwenden, die in derselben Wirtsspezies gezüchtet wurden.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der adulten Neurogenese zu beantworten, wie z.B. die Proliferation von hippokampalen Vorläuferzellen als Reaktion auf physiologische oder pharmakologische Reize, Hirnpathologien oder Alterung. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da die mehrfache Markierung mit primären Antikörpern derselben Wirtsspezies zu unerwünschten Antikörperkreuzaktivitäten ohne adäquate Blockierung führen kann. Wiegen Sie zunächst die zu injizierenden Tiere und bereiten Sie eine frische 10 Milligramm pro Milliliter Thymidin-Analogon-Stammlösung für die Injektion vor.

Wenn die Lösung fertig ist, bereiten Sie eine gewichtsangepasste Dosis in einer Feindosierspritze mit einer 30-Gauge-Nadel vor. Halten Sie dann die Maus am Genick fest und injizieren Sie das Thymidin-Analogon intraperitoneal zum gewünschten Zeitpunkt, betäuben Sie die Maus tief und trans cardio. Perfundieren Sie es mit 10 Millilitern eiskaltem PBS, gefolgt von 40 Millilitern frischer eiskalter Formaldehydlösung.

Präparieren Sie dann das Gehirn und fixieren Sie es nach der Fixierung mit demselben Fixiermittel. Inkubieren Sie die gesammelten Gehirne 24 Stunden lang in 10%iger Saccharose bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag überführen Sie das Gehirn in 30%ige Saccharose und inkubieren Sie weitere 48 Stunden.

Wenn die Gehirne für den Kryoschutz bereit sind, frieren Sie sie in minus 25 Grad Celsius heißem Isop-Pentan ein. Verwenden Sie später einen Kryostaten, um 40-Mikrometer-Koronalschnitte für die Langzeitlagerung zu schneiden. Übertragen Sie die Abschnitte in eine Frostschutzlösung und halten Sie sie bei minus 20 Grad Celsius.

Beginnen Sie damit, die Abschnitte mit Hilfe einer feinen Bürste aus der Frostschutzlösung auf TBS zu übertragen. Spülen Sie die Abschnitte gründlich aus, beginnend mit einer Nachtwäsche bei vier Grad Celsius, gefolgt von fünf 10-minütigen Wäschen bei Raumtemperatur. Alle diese Inkubationen sollten unter kontinuierlichem, sanftem Rühren durchgeführt werden.

Wenn eines der interessierenden Antigene ein Thymidin-Analogon ist, muss an dieser Stelle ein Salzsäure-Denaturierungsschritt durchgeführt werden, gefolgt von einem Neutralisationsschritt im Bohrungspuffer. Fahren Sie mit der permeablen und Blockierung der unspezifischen Antikörperbindungsstellen in TBS plus fort. Lassen Sie diese Inkubation eine Stunde lang bei Raumtemperatur laufen, dann inkubieren Sie sie im ersten Primärantikörper, verdünnt in TBS, plus über Nacht bei vier Grad Celsius am nächsten Tag.

Waschen Sie die Abschnitte dreimal in TBS und einmal in TBST. Lassen Sie jedes Bad 10 Minuten lang gehen. Dann in einem ersten Fluorochrom-konjugierten Sekundärantikörper drei Stunden lang bei Raumtemperatur inkubieren.

Schützen Sie die Abschnitte ab sofort vor Lichteinwirkung. Nach einer weiteren Waschserie werden die Schnitte in eine 10%ige Serumlösung der Wirtsspezies überführt, aus der die beiden Primärantikörper hergestellt wurden. Inkubieren Sie die Schnitte drei Stunden lang in dieser Lösung, um die offenen Perikopen auf dem ersten Sekundärantikörper zu sättigen.

Später dreimal in TBS und einmal in TBST spülen, um das Serum zu entfernen. Bereiten Sie dann eine Lösung von TBS plus mit 50 Mikrogramm pro Milliliter unkonjugierter monovalenter Fab-Fragmente vor, die gegen die Wirtsspezies des primären Antikörpers gerichtet sind. Damit werden die Epitope abgedeckt, die sonst vom zweiten Sekundärantikörper erkannt werden könnten.

Übertragen Sie die Schnitte in diese Lösung und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Spülen Sie die Abschnitte nach der Inkubation mindestens dreimal in TBS und einmal in TBST. Tupfen Sie während des Transfers die Netzeinsätze mit den Abschnitten auf ein Papiertuch, um die Reste der Fab zu entfernen.

Inkubieren Sie nun die Abschnitte im zweiten Primärantikörper über Nacht bei vier Grad Celsius. Nach einer weiteren Waschserie den zweiten Sekundärantikörper drei Stunden lang bei Raumtemperatur auftragen. Zum Schluss die Abschnitte dreimal in TBS waschen und mit dem Aufkleben der Gelatine fortfahren.

Trocknen Sie die Dias an der Luft und decken Sie sie mit einem ANTIFA-Montagemedium ab. Die fluoreszenzmarkierten Schnitte mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop. Nehmen Sie Bildstapel an zufälligen Positionen entlang der gesamten Ausdehnung des Gyrus dentatus mit 400-facher Vergrößerung auf.

Analysieren Sie mindestens 50 zufällig ausgewählte Zellen von Interesse pro Hemisphäre für die gemeinsame Markierung der verschiedenen Marker. Um die absoluten Zahlen für bestimmte Neugeborenen-Zellpopulationen zu berechnen, multiplizieren Sie die Prozentsätze der co-markierten Zellen mit der Gesamtzahl der Neugeborenenzellen, die aus der DAB-Färbeanalyse geschätzt wurden. Die beschriebenen Methoden wurden zur Quantifizierung und Charakterisierung von neugeborenen Zellen im postnatalen und adulten Hippocampus eines Neurogenese-defizienten Zyklus verwendet.

D Zwei-Knockout-Mausmodell, DAB-Färbung gegen verschiedene Proliferationsmarker wie KI 67 oder BRDU, zeigte konsistent Unterschiede in der Zellzahl von Neugeborenen zwischen Wildtyp- und Knockout-Mäusen. BRDU-markierte neugeborene Zellen konnten mit einem konventionellen multiplen Immunfluoreszenzprotokoll phänotypisiert werden, bei dem gleichzeitig primäre Antikörper gegen B-R-D-U-G-F-A-P-Nest in GFP und Doppelcourtin appliziert wurden. Dies ermöglichte die erfolgreiche Identifizierung von neugeborenen Vorläuferzellen vom Typ eins, Typ zwei A, Typ zwei B und Typ drei innerhalb einer einzigen Probe.

Alternativ könnte mit längeren Zeitintervallen zwischen der BRDU-Injektion und der Tötung des Tieres die endgültige Anzahl der neugeborenen Neuronen durch gleichzeitige BRDU-New-n-Immunfärbung analysiert werden. Das sequentielle Immunmarkierungsprotokoll funktionierte perfekt, wenn die Abschnitte zunächst gleichzeitig mit Kaninchen-Anti-KI 67-, Ziegen-Anti-GFP- und Meerschweinchen-Anti-Doppelkordon-Antikörpern inkubiert wurden, und dann mit Kaninchen-Anti-GFAP-Antikörpern, aber nicht umgekehrt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie bis zu vier verschiedene Antigene in einem einzelnen Gewebeschnitt mit primären Antikörpern visualisieren können, die im selben Wirt gezüchtet wurden.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, geeignete Kontrollen einzubeziehen, um die Möglichkeit von Antikörpern, Kreuzreaktionen oder falsch positiven Ergebnissen auszuschließen. Beachten Sie, dass die Reihenfolge der primären Antikörperinkubationen das Ergebnis des Protokolls stark beeinflussen kann.