Stem Cell Transplantation Strategien für die Wiederherstellung der kognitiven Dysfunktion von Cranial Strahlentherapie verursachten Schäden

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Stammzellen reproduzierbar in den Hippocampus zu transplantieren. Zunächst werden athyme Ratten einer stereotaktischen Strahlentherapie unterzogen, um zu simulieren, was während der klinischen Behandlung von Hirntumoren passieren könnte. Im Labor werden humane neurale Stammzellen für die Transplantation gezüchtet, 1 Million Zellen werden in der Regel für die Behandlung einer einzelnen Ratte benötigt.

Zwei Tage nach der Bestrahlung werden die Stammzellen langsam an einer bestimmten Stelle in den Hippocampus injiziert. Letztendlich zeigt das Protokoll die Wanderung transplantierter Stammzellen durch den Hippocampus. Die Idee zu diesen Methoden kam mir, als ich anfing, über die Aussichten der Verwendung von Stammzellen nachzudenken, um die Hemmung der Neurogenese umzukehren. Nach der Schädelbestrahlung haben Personen, die diese Methode kennen, im Allgemeinen Schwierigkeiten, da das Wachstum von Stammzellen nicht trivial ist und unter antibiotikafreien Wachstumsbedingungen tägliche Aufmerksamkeit und Pflege erfordert.

visuelle Demonstration dieses Verfahrens wird den klinischen Prozess entmystifizieren, der für die Rekonstruktion von Bildern für die präzise Bestrahlung kleiner, gut definierter Gehirnvolumina verwendet wird. Das Bestrahlungsverfahren wird von Dr. Dante Rowa, einem klinischen Professor meiner Abteilung, demonstriert. Die Präparation von Stammzellen wird von Frau Mary Land und Catherine Tran Technikern in meinem Labor demonstriert und Dr. Muja, ein Postdoktorand, wird die für die Transplantation erforderlichen Verfahren demonstrieren.

Wir verwenden eine bildgeführte Strahlentherapie-Software für die genaue Positionierung der Tiere vor der Behandlung und eine modulierte Strahlentherapie für eine gezielte Bestrahlung mit minimaler Strahlenschädigung anderer Teile des Gehirns. 24 Stunden nach einer MRT-Untersuchung erzeugen Sie ein weiteres Schnittbildvolumen, indem Sie das sedierte Tier in einen Radioonkologie-CT-Scanner legen. Platzieren Sie die Ratte in der gleichen Position, die für den MRT-Scan verwendet wurde, und stellen Sie das CT-Gerät so ein, dass es die Schädelregion scannt, um die CT-Behandlungsplanungsdaten zu generieren.

Erhalten Sie 106 CT-Bilder mit einer Bilddicke von 0,8 Millimetern. Übertragen Sie anschließend die MRT- und CT-Bilddaten an die Eclipse-Behandlungsplanungssoftware. Verwenden Sie Eclipse, um die MRT- und CT-Daten basierend auf der knöchernen Anatomie und dem Weichteilabgleich zu fusionieren.

Dies ist ein zeitvariabler Schritt, der je nach Bildqualität zwischen einer und drei Stunden dauern kann. Sobald eine zufriedenstellende Bildfusion erreicht ist, konturieren Sie die zu bestrahlenden Zielregionen sowie die angrenzenden kritischen Organe. Die Bestrahlung kann an das gesamte Gehirn erfolgen oder auf bestimmte volumetrische Regionen wie einzelne Nilpferd-Campi beschränkt werden.

Die Konturen liefern nicht nur die Lage dieser Organe, sondern auch Volumeninformationen, die für die Anpassung der Dosisverteilung entscheidend sind. Um die Dosisverteilung anzupassen. Geben Sie Informationen über die Zieldosis, die Zielkonformität und die Dosiseinschränkungen für kritische Organe in das Dosisoptimierungsfenster in Eclipse ein.

Sobald ein Plan erstellt wurde, stellt eclipse die berechnete Dosis zur Verfügung, die den axialen koronalen und sagittalen Bildern sowie im Dosisvolumen-Histogrammformat überlagert wird. An diesem Punkt muss der Plan bewertet werden, um festzustellen, ob er für die Umsetzung geeignet ist oder verbessert werden muss. Um den Bestrahlungsprozess zu starten, lege eine sedierte Ratte unter eine Papierdecke, um sie warm zu halten.

Setzen Sie die Ratte nach einigen Minuten auf die Behandlungsliege des Strahlentherapie-Linearbeschleunigers, bedeckt mit der Decke, aber mit freiliegendem Schädel. Stellen Sie sicher, dass Sie es in der gleichen Position platzieren, die zum Erstellen des CT-Scans verwendet wurde. Dieser Schritt ist entscheidend, um die Genauigkeit der Dosisabgabe zu gewährleisten.

Nehmen Sie als Nächstes orthogonale Röntgenbilder der sedierten Ratten mit dem integrierten Bildgebungssystem im Strahlentherapie-Linearbeschleuniger auf, registrieren Sie die orthogonalen Röntgenbilder mit einem von Eclipse bereitgestellten Referenzbildsatz und wenden Sie die erforderlichen Positionskorrekturen für die korrekte Bildausrichtung an. Verabreichen Sie die Bestrahlung als 10-Grad-Dosis mit einem Sechs-Feld-IMRT-Plan für einen einzelnen Hippocampus und mit einem Zwei-Arc-Schnellbogenplan für beide Hippo-Campi-Bestrahlungen. Nehmen Sie nach Beendigung der Behandlung den Wickel aus dem Behandlungsraum und lassen Sie ihn in einem beheizten Käfig ruhen.

Um sich auf die Operation vorzubereiten, verwenden Sie eine elektrische Schermaschine, um das Fell vom Kopf einer betäubten A-TN-Ratte zu entfernen. Reinigen Sie den rasierten Bereich mit wiederholten Anwendungen von Povidon, Jod und 70 % Ethanol in einer Laminar-Flow-Haube. Bereiten Sie die stereotaktischen Instrumente, den Mikromolarenbohrer, den Trockenbettsterilisator und die Controller vor.

Halten Sie das Tier während der Operation warm, indem Sie es auf eine beheizte Oberfläche legen. Sterile Handschuhe werden vor und während der Operation getragen und mit 70% Ethanol besprüht. Die chirurgische Ausrüstung wird in einer speziellen Laminar-Flow-Haube aufbewahrt.

Um aseptische Bedingungen aufrechtzuerhalten, decken Sie das Tier mit einem kleinen OP-Tuch ab, so dass nur der Kopf freiliegt. Positionieren Sie den Kopf des Tieres fest innerhalb des stereotaktischen Rahmens, indem Sie Ohrstangen in den äußeren Hörrahmen einführen. Seien Sie äußerst vorsichtig, wenn Sie die Spitze des Luftbügels in den Gehörgang schieben.

Platzieren Sie die Schneidezahnstange, indem Sie die oberen Schneidezähne der Ratte einhaken und die Höhe der Stange auf den Standardreferenzpunkt einstellen. Ziehen Sie dann die Nasenklemme fest. Zentrieren Sie die Position des Kopfes zwischen den Ohrbügeln mit minimaler seitlicher Bewegung, um einen stereotaktischen Nullpunkt zu erreichen.

Nachdem das Tier in Position gebracht wurde, tragen Sie eine befeuchtende Augensalbe auf, um ein Austrocknen zu verhindern. Tragen Sie die Salbe während der Operation noch einmal auf. Machen Sie mit einem sterilen Skalpell einen zwei Zentimeter langen Hautschnitt in der Mittellinie entlang der Kopfhaut.

Reinigen Sie den Bereich mit einem sterilen Wattestäbchen-Applikator. Führen Sie als Nächstes einen Präparierretraktor ein, um das Periost offen zu halten. Üben Sie festen Druck auf den Bereich aus, wenn Blutungen auftreten.

Entfernen Sie mit einem Applikator mit Wattespitze, der in 1 % Wasserstoffperoxid getaucht ist, die Weichteile, die den Schädel bedecken, bis die Nähte bgma und lambda sichtbar sind. Der schwierigste Aspekt der stereotaktischen Chirurgie ist die präzise Positionierung des Tierkopfes im stereotaktischen Rahmen. Um genaue stereotaktische Koordinaten auf dem Tierschädel zu markieren, verwenden Sie einen Wrap-Gehirnatlas, um die genauen stereotaktischen Koordinaten unter Verwendung des B-BGMA als Referenz zu bestimmen. In dieser Studie wird die Stammzelltransplantation an vier verschiedenen Stellen unter Verwendung der folgenden stereotaktischen Koordinaten durchgeführt, um die Stellen auf dem Schädel zu markieren, identifizieren Sie zuerst das bgma.

Nächste Null. Alle drei Koordinaten werden auf dem Controller für die Digitalanzeige angezeigt. Verwenden Sie nach dem Nullen die vorgegebenen Koordinaten, um die Transplantationsstellen zu lokalisieren und eine Markierung mit einer feinen Punktmarkierung vorzunehmen, die an einem Sondenhalter am Rahmen befestigt ist.

Verwende einen Bohrer, um an jeder markierten Stelle 0,35 Millimeter große Löcher durch den Schädel zu bohren. Achten Sie darauf, dass die Durham-Membran nicht beschädigt wird. Wenn während des Bohrens Blutungen auftreten, üben Sie mit einem Applikator mit Wattespitze festen Druck aus.

Das Tier ist nun bereit für die Transplantation. Die für die Transplantation verwendeten menschlichen neuralen Stammzellen sollten im Voraus vorbereitet und bis zur Verwendung auf Eis gelegt werden. Wenn Sie fertig sind, füllen Sie eine Hamilton-Mikrospritze mit fünf Mikrolitern und 30 Gauge mit der Zellsuspension.

Befestigen Sie die gefüllte Spritze an einem kleinen Sondenhalter am stereotaktischen Rahmen. Sobald Sie sich in die richtige Position gebracht haben, führen Sie die Spitze der Nadel vorsichtig in das Loch im Schädel ein, bis sie die Oberfläche des Gehirns erreicht. Nullen Sie die DV-Koordinate auf dem Controller der Digitalanzeige und führen Sie die Nadel dann vorsichtig bis zur gewünschten Tiefe ein.

Halten Sie die Nadel eine Minute lang an Ort und Stelle. Nach dieser Zeit injizieren Sie Zellen mit einer Geschwindigkeit von 0,25 Mikrolitern pro Minute, also insgesamt einen Mikroliter. Halten Sie die Nadel acht Minuten lang an Ort und Stelle, bevor Sie sie zurückziehen, um einen kapillaren Rückfluss des Injektionsinhalts durch die Nadelschiene zu verhindern. Ziehen Sie die Nadel langsam mit einer Geschwindigkeit von 0,5 Millimetern pro Minute von der Transplantationsstelle zurück.

Wiederholen Sie diesen Vorgang für die verbleibenden Transplantationsstellen. Wenn die Injektionen abgeschlossen sind, entfernen Sie den Hautretraktor und ziehen Sie die Haut mit einer stumpfen Pinzette vorsichtig wieder über den Schädel. Verschließen Sie die Wunde nach der Operation mit dem Anlegen von vier bis fünf sterilen Edelstahlclips.

Setzen Sie das Tier in einen beheizten Käfig und überwachen Sie seine Genesung. Einen Monat nach der Transplantation wurden Gehirnproben geschnitten und mit BRDU gefärbt, um transplantiertes NSCS nachzuweisen und die Färbung mit Hämatin zu konterkarieren. Die Nadelspur, die hier durch die rote Linie dargestellt wird, zeigt die Injektionsbahn, die NSCS an der als TR bezeichneten Transplantatfreisetzungsstelle abgelagert hat, wie zu sehen.

Hier zeigte das transplantierte NSCS eine ausgedehnte Migration von den Corpus cossum und CA one Regionen zum Gyrus dente und ca drei Regionen des Hippocampus. Es ist wichtig, dass der aufgenommene Mr.I-Bildsatz genau mit einem entsprechenden CT-Bildsatz abgeglichen wird. Die richtige Bildfusion ist entscheidend für die Identifizierung und anschließende Konturierung der Hippocampusregionen vor dem Behandlungsverfahren, die Aufnahme von oder orthogonalen Röntgenbildern, um sicherzustellen, dass das Tier genau positioniert ist. Um den Erfolg der Transplantation zu gewährleisten, bleibt die chirurgische Umgebung jederzeit steril.

Mark Otax koordiniert genau und entfernt die Mikrospritze nach der Injektion schrittweise, um einen Flüssigkeitsrückfluss zu verhindern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein klinisch relevantes Bestrahlungsverfahren mit einem Tiermodell Ihrer Wahl durchführen und wie Stammzellen chirurgisch in eine bestimmte Region des Gehirns transplantiert werden.