Name: Stem Cell Transplantation Strategien für die Wiederherstellung der kognitiven Dysfunktion von Cranial Strahlentherapie verursachten Schäden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Lernen Sie die Stammzelltransplantation in den Hippocampus athymischer Ratten nach kranialer Strahlentherapie. Diese Methode demonstriert die Migration transplan tierter Zellen und bietet einen Rahmen zur Wiederherstellung kognitiver Funktionen.

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Diese Arbeit wurde vom NIH NINDS gewähren R01 NS074388 581 (CL Limoli), California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Grant RS1-00413 (CLL), CIRM Training Grant TG2-0115 (MMA), und ein CIRM Zuschuss zur Unterstützung JOVE der Video-Dokumentation.

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<li>Hefferan, M. P., Johe, K., Feldman, E. L., Lunn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+immunosuppressive+therapy+for+spinal+grafting+of+human+spinal+stem+cells+in+a+rat+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Optimization of immunosuppressive therapy for spinal grafting of human spinal stem cells in a rat model of ALS.</a> Cell. Transplant. , (2011).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Beträchtliche Forschung ist im Gange Erkundung der unzähligen Möglichkeiten, die Stammzellen klinisch eingesetzt werden können, um normale Funktionen beschädigt, gealtert und krankem Gewebe 8 Stellen. Die letztendliche Realisierung dieser Bemühungen erfordert ein detailliertes Verständnis des Verhaltens von transplantierten Zellen innerhalb einzigartige Mikroumgebung, die sich von normalem Gewebe unbeschädigt sind. Unsere Arbeit hat gezeigt, dass innerhalb des bestrahlten Gewebes Bett, kranial eingepflanzt NSCs können funktionell wiederherzustellen Erkenntnis, wo sie überleben, Migration und Differenzierung entlang neuronaler und Glia-Linien 2. Genau wie diese Zellen vermitteln Erholung der Erkenntnis ist zurzeit ungewiss, aber nicht auf die Durchführung einer Reihe von sorgfältig kontrollierten experimentellen Verfahren in reproduzierbarer Weise ab. Wir haben diese kritischen Verfahren hier in den Bemühungen um die translationale Potenzial von Stammzellen Therapien für Linderung negative kognitive Effekte mit den damit verbundenen Beschleunigung der detailliertenklinischen Behandlung von Gehirn und anderen Formen von Krebs. Weitere Überlegungen, die wahrscheinlich einen signifikanten Einfluss auf die Qualität der Daten haben, sind im Folgenden erläutert. Transplantation Therapien abhängig von Stammzellen als die kritische Reagenzien und dementsprechend Dabei ist darauf zu richtig zu charakterisieren Kulturen, der Aufrechterhaltung der Sterilität und die Nutzung abgestimmt Durchgang Zahlen für Zuverlässigkeit der Ergebnisse sein. Transplantierte menschliche Stammzellen wurden mit BrdU vor der Operation markiert, um ein Mittel für die Verfolgung von ihnen in vivo liefern. Unter unseren experimentellen Bedingungen hat transplantiert NSCs nicht in umfangreichen Proliferation, so dass eine Verdünnung des BrdU-Label war nicht problematisch. Alternativ können transplantierte menschliche Stammzellen aus Wirtszellen durch Immunfärbung für den menschlichen spezifische Marker wie nukleare Matrix Protein (h-NUC oder hNUMA) 9 oder human-spezifischen nuclear antigen (HuNu) 2 unterschieden werden. Menschliche Stammzellen können auch beschriftet seineine Vielzahl von fluoreszierenden Markern, um ihre Identifikation innerhalb des Host-Gehirn zu erleichtern. Achtung der Bestrahlung Parameter definieren genau dosierte Zufuhr Techniken und die hier beschriebene Modell der gegenwärtigen klinischen Praxis in der Radioonkologie. Reproduzierbare Transplantation von Stammzellen in das Gehirn ist auch entscheidend, und wird mit Hilfe einer digitalen stereotaktischen Instrument. Die Fähigkeit, genau micromanipulate ein Mikro-Spritze für die Stammzell-Implantation in kleine Hirnstrukturen wie Hippocampus reduziert menschliches Versagen. Mit dieser Apparatur wurden NSCs in vier verschiedenen Standorten überspannt den vorderen zu hinteren Regionen des Ratten-Hippocampus transplantiert. Dorso-ventralen (DV)-Koordinaten wurden basierend auf den Erfahrungen mit athymischer (ATN) Ratten, so dass chirurgische Eingriffe nicht zu einer Beschädigung des Hippokampus 2 bestimmt. Ein Frontalschnitt durch das Gehirn der Ratte zeigt wichtige Strukturen des Hippokampus inkl.uding Gyrus dentatus (DG), dentatus Hilus (DH) und CA1 und CA3 Unterfelder (Abb. 8). Transplantierte NSCs, dorsal von der sichtbaren Nadel-Darm-Trakt (Nt, redline) eingeführt, visualisiert als dunkel-Färbung (braun) Zellen hinterlegt bei der Transplantation-release site (Tr) knapp unter dem Corpus callosum (CC), die anschließend in der gesamten septo migrieren -zeitliche Achse des Hippocampus.

<table border="1"><tbody><tr><td> Material Name </td><td> Typ </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td> Digitale stereotaktische Instrument W/45 ° und 18 ° Earbars </td><td> Cranial Transplantation chirurgischen Setup </td><td> Leica Microsystems (bisher: MyNeuroLab) </td><td> 39463501 </td><td> Nützliches Zubehör: Stage mit Heizung und variablen Stromquelle (die Körpertemperatur während der Operation zu erhalten) </td></tr></tbody></table>

stem cell transplantation strategien für die wiederherstellung der kognitiven dysfunktion von cranial strahlentherapie verursachten schäden

Stem Cell Transplantation Strategies for the Restoration of Cognitive Dysfunction Caused by Cranial Radiotherapy

Strahlentherapie oft die einzige klinische Rückgriff für Menschen mit primären oder metastatischen Hirntumoren befallen. Während nützlich, kann eine Bestrahlung des Kopfes induzieren eine progressive und schwächenden Rückgang der Erkenntnis, dass ein Teil kann durch die Erschöpfung der neuralen Stammzellen verursacht werden. Angesichts der Verlängerung der Überlebenszeit von Patienten mit Hirntumoren, die Lebensqualität in Bezug auf die kognitive Gesundheit diagnostiziert hat sich eine zunehmende Besorgnis, vor allem in Ermangelung einer zufrieden stellenden langfristigen Behandlungen. Zu diesem schwerwiegenden gesundheitlichen Bedenken wir Stammzellen Ersatz verwendet haben als Strategie zur strahleninduzierten kognitiven Verfall zu bekämpfen Adresse. Unser Modell nutzt athymischer Ratten ausgesetzt Bestrahlung des Kopfes. Die ionisierende Strahlung ist entweder als ganze Gehirn oder als stark fokussierten Strahl auf den Hippocampus via lin Ohr ein ccelerator (LINAC) basierte stereotaktische Radiochirurgie geliefert. Zwei Tage nach der Bestrahlung, huMenschen neurale Stammzellen (hNSCs) wurden stereotaxically in den Hippocampus transplantiert. Die Ratten wurden dann für Veränderungen in Kognition, veredelt das Überleben der Zelle und für den Ausdruck der Differenzierung-spezifische Marker 1 und 4-Monate nach der Bestrahlung untersucht. Unsere kognitiven Tests Paradigmen haben gezeigt, dass Tiere mit hNSCs eingepflanzt signifikante Verbesserungen der kognitiven Funktion aufweisen. Unvoreingenommene Stereologie zeigt signifikanten Überlebensvorteil (10-40%) der transplantierten Zellen bei 1 und 4-Monate nach der Transplantation, abhängig von der Menge und Art der Zellen gepfropft. Eingepflanzten Zellen ausgiebig wandern, entlang Glia-und Nervenzellen Linien zu differenzieren, und drücken eine Reihe von unreifen und reifen phänotypische Marker. Unsere Daten zeigen, direkten kognitiven Vorteile aus eingepflanzt menschlichen Stammzellen, was darauf hindeutet, dass dieses Verfahren eines Tages leisten eine vielversprechende Strategie für die langfristige Wiederherstellung der Funktion der Kognition bei Personen unterzogen kranialen radiotherapy. Um die Verbreitung des kritischen erforderlichen Verfahren zu replizieren und erweitern unsere Untersuchungen haben wir schriftliche und bildliche Dokumentation von mehreren wichtigen Schritten in unserer experimentellen Plan vorgesehen, mit einem Schwerpunkt auf stereotaktischen radiosurgey und Transplantation.

Hirntumor-Patienten routinemäßig durchlaufen kranialen Strahlentherapie, und während von Vorteil, diese Behandlung führt oft lähmenden kognitive Dysfunktion. Dieser ernste ungelöste Problem hat derzeit keine klinischen Inanspruchnahme und getrieben hat unsere Anstrengungen zur Stammzell-basierten Therapien für die Verwertung von Strahlung induzierte kognitive dekrementiert zu entwickeln.

Stem Cell Transplantation Strategien für die Wiederherstellung der kognitiven Dysfunktion von Cranial Strahlentherapie verursachten Schäden

Die Strahlentherapie stellt oft die einzige klinische Option für Patienten dar, die an primären oder metastatischen Hirntumoren leiden. Obwohl die kranielle Bestrahlung vorteilhaft ist, ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Stammzellen reproduzierbar in den Hippocampus zu transplantieren. Zunächst werden athymische Ratten einer stereotaktischen Strahlentherapie unterzogen, um das klinische Vorgehen bei der Behandlung von Hirntumoren zu simulieren. Im Labor werden humane neuronale Stammzellen zur Transplantation kultiviert; typischerweise werden 1 Million Zellen zur Behandlung einer einzelnen Ratte benötigt.Zwei Tage nach der Bestrahlung werden die Stammzellen langsam an einer präzisen Position in den Hippocampus injiziert. Letztendlich zeigt das Protokoll die Migration der transplantierten Stammzellen im gesamten Hippocampus. Ich hatte die Idee zu diesen Methoden erstmals, als ich darüber nachzudenken begann, ob Stammzellen genutzt werden könnten, um die Hemmung der Neurogenese nach einer Schädelbestrahlung umzukehren. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da das Wachstum von Stammzellen nicht trivial ist und tägliche Aufmerksamkeit sowie Pflege unter antibiotikafreien Wachstumsbedingungen erfordert.Die visuelle Darstellung dieses Verfahrens wird den klinischen Prozess zur Bildrekonstruktion für die präzise Bestrahlung kleiner, gut definierter Hirnvolumina verständlich machen. Die Demonstration des Bestrahlungsverfahrens übernimmt Dr. Dante Rowa, ein klinischer Professor meiner Abteilung. Die Vorbereitung von Stammzellen wird von den Technikerinnen Ms. Mary Land und Catherine Tran aus meinem Labor gezeigt, und Dr. Muja, ein Postdoktorand, wird die für die Transplantation erforderlichen Verfahren demonstrieren.Wir verwenden bildgeführte Strahlentherapie-Software für eine präzise Positionierung der Tiere vor der Behandlung sowie eine modulierte Strahlentherapie für eine gezielte Bestrahlung mit minimaler Strahlenschädigung an anderen Gehirnarealen. 24 Stunden nach einer MRT-Aufnahme erzeugen Sie ein weiteres Volumen von Querschnittsbildern, indem Sie das sedierte Tier in einen CT-Scanner der Strahlentherapie einbringen. Positionieren Sie die Ratte in derselben Lage wie bei der MRT-Aufnahme, und stellen Sie den CT-Scanner so ein, dass er den Schädelbereich abscannt, um die CT-Daten für die Behandlungsplanung zu generieren.Beschaffen Sie 106 CT-Bilder mit einer Schichtdicke von 0,8 Millimetern. Übertragen Sie anschließend die MRT- und CT-Bilddaten auf die Behandlungsplanungssoftware Eclipse. Nutzen Sie Eclipse, um die MRT- und CT-Daten basierend auf der knöchernen Anatomie und der Übereinstimmung des Weichgewebes zu fusionieren.Dieser Schritt ist zeitlich variabel und je nach Bildqualität kann dieser Prozess zwischen einer und drei Stunden dauern. Sobald eine zufriedenstellende Bildfusion erreicht ist, werden die zu bestrahlenden Zielbereiche sowie angrenzende kritische Organe konturiert. Die Bestrahlung kann entweder auf das gesamte Gehirn oder auf bestimmte volumetrische Bereiche wie einzelne Hippocampi beschränkt werden.Die Konturen liefern nicht nur den Ort dieser Organe, sondern auch Volumeninformationen, die entscheidend für die Anpassung der Dosisverteilung sind. Um die Dosisverteilung anzupassen, geben Sie Informationen zur Ziel-Dosis, Ziel-Konformität und Dosisbegrenzungen für kritische Organe im Dosis-Optimierungsfenster von Eclipse ein.Wenn ein Plan erstellt wurde, stellt Eclipse die berechnete Dosis dar, die auf die axialen, koronalen und sagittalen Bilder aufgelegt ist, sowie im Format des Dosis-Volumen-Histogramms. An diesem Punkt muss der Plan bewertet werden, um festzustellen, ob er für die Applikation geeignet ist oder verbessert werden muss. Um den Bestrahlungsprozess zu beginnen, stellen Sie eine sedierte Ratte unter eine Papierdecke, um sie warm zu halten.Nach einigen Minuten setzen Sie die Ratte auf den Behandlungstisch des Strahlentherapie-Linearbeschleunigers, der mit der Decke bedeckt ist, wobei der Schädel freiliegt. Achten Sie darauf, sie in derselben Position zu platzieren, die zur Erstellung des CT-Scans verwendet wurde. Dieser Schritt ist entscheidend, um die Genauigkeit der Dosisabgabe sicherzustellen.Als Nächstes erzeugen Sie orthogonale Röntgenbilder der sedierten Ratten mithilfe des integrierten Bildgebungssystems im radiotherapeutischen Linearbeschleuniger, ko-registrieren Sie die orthogonalen Röntgenbilder mit einem Referenzbildsatz, der von Eclipse bereitgestellt wird, und führen Sie anschließend die erforderlichen Positions-korrekturen zur korrekten Bildausrichtung durch. Führen Sie die Bestrahlung als 10-Grad-Dosis mit einem IMRT-Bestrahlungsplan aus sechs Feldern für einen einzelnen Hippocampus und mit einem Rapid-Arc-Bestrahlungsplan aus zwei Bögen für die Bestrahlung beider Hippocampi durch. Nach Abschluss der Bestrahlung entfernen Sie die Verpackung aus dem Behandlungsraum und lassen die Tiere in einem beheizten Aufbewahrungsstall erholen.Bereiten Sie sich auf den chirurgischen Eingriff vor, indem Sie elektrische Schermaschinen verwenden, um das Fell von dem Kopf einer anästhesierten A TN Ratte zu entfernen. Reinigen Sie die rasierte Fläche durch mehrfache Anwendung von Povidon-Iod und 70 %igem Ethanol innerhalb einer laminarer Luftstromhaube. Bereiten Sie die stereotaktischen Instrumente, den Mikrobohrer, den Trockensterilisator und die Steuergeräte vor.Halten Sie das Tier während der Operation warm, indem Sie es auf eine beheizte Oberfläche legen. Vor und während der gesamten Operation werden sterile Handschuhe getragen und mit 70 %igem Ethanol besprüht. Chirurgisches Gerät wird in einer separaten laminarer Luftstrom-Werkbank aufbewahrt.Um aseptische Bedingungen aufrechtzuerhalten, bedecken Sie das Tier mit einem kleinen chirurgischen Tuch, sodass nur der Kopf freiliegt. Positionieren Sie den Kopf des Tieres fest im stereotaktischen Rahmen, indem Sie die Ohrstifte in das äußere Gehörorgan einführen. Gehen Sie äußerst vorsichtig vor, wenn Sie die Spitze des Ohrstifts in den Gehörgang schieben.Platzieren Sie die Schneidezahnhalterung, indem Sie die oberen Schneidezähne der Ratte einhaken und die Höhe der Halterung auf den standardmäßigen Bezugspunkt einstellen. Danach ziehen Sie die Nasenklammer fest. Zentrieren Sie die Position des Kopfes zwischen den Ohrhalterungen mit minimaler seitlicher Bewegung, um den stereotaktischen Nullpunkt zu erreichen.Wenn das Tier in Position ist, Augensalbe zur Vorbeugung der Austrocknung auftragen. Die Salbe erneut während der Operation auftragen. Mit einem sterilen Skalpell einen zwei Zentimeter langen medianen Hautschnitt entlang der Kopfhaut anlegen.Reinigen Sie die Fläche mit einem sterilen Wattestäbchen. Danach setzen Sie einen dissezierenden Retraktor ein, um das Periost offen zu halten. Üben Sie gegebenenfalls festen Druck auf die Stelle aus, wenn Blutungen auftreten.Mit einem in 1 % Wasserstoffperoxid getränkten Wattestäbchen werden die weichen Gewebe, die den Schädel bedecken, so lange entfernt, bis die Nähte Bregma und Lambda sichtbar sind. Der schwierigste Aspekt eines stereotaktischen Eingriffs ist die präzise Positionierung des Tierkopfes im stereotaktischen Rahmen. Um präzise stereotaktische Koordinaten auf dem Tier-Schädel zu markieren, verwenden Sie einen Wrap-Hirn-Atlas, um mithilfe von Bregma als Referenzpunkt die exakten stereotaktischen Koordinaten zu bestimmen. In dieser Studie erfolgt die Stammzelltransplantation an vier verschiedenen Stellen, wobei folgende stereotaktische Koordinaten zur Markierung der Positionen am Schädel verwendet werden: Zuerst wird Bregma identifiziert.Als Nächstes nullen Sie alle drei Koordinaten am digitalen Anzeigeregler. Nach dem Nullabgleich verwenden Sie die vorbestimmten Koordinaten, um die Transplantationsstellen zu lokalisieren, und machen mit einem feinen Schreibstift, der an einem Probenträger am Rahmen befestigt ist, eine Markierung.Verwenden Sie einen Bohrer, um an jeder markierten Stelle 0,35 Millimeter große Löcher durch den Schädel zu bohren. Achten Sie darauf, die Duramater nicht zu beschädigen. Falls während des Bohrens Blutung auftritt, üben Sie mit einem Wattestäbchen festen Druck aus.Das Tier ist nun bereit für die Transplantation. Die für die Transplantation verwendeten humanen neuronalen Stammzellen sollten im Voraus vorbereitet und bis zur Verwendung auf Eis gehalten werden. Wenn alles vorbereitet ist, füllen Sie eine 5-µL-Hamilton-Mikrospritze mit Nadelstärke 30 mit der Zellsuspension.Befestigen Sie die gefüllte Spritze an einem kleinen Probenhalter am stereotaktischen Rahmen. Sobald sie in die korrekte Position gebracht wurde, setzen Sie die Nadelspitze vorsichtig in die Öffnung im Schädel ein, bis sie die Gehirnoberfläche erreicht. Setzen Sie die DV-Koordinate am digitalen Anzeigeregler auf Null und führen Sie die Nadel dann sanft auf die gewünschte Tiefe ein.Halten Sie die Nadel eine Minute lang an Ort und Stelle. Injizieren Sie danach die Zellen mit einer Geschwindigkeit von 0,25 Mikrolitern pro Minute, insgesamt ein Mikroliter. Halten Sie die Nadel acht Minuten lang an Ort und Stelle, bevor Sie sie zurückziehen, um einen kapillaren Rückfluss des Injektionsinhalts langsam durch die Nadelbahn zu verhindern; ziehen Sie die Nadel anschließend vom Transplantationsort mit einer Geschwindigkeit von 0,5 Millimetern pro Minute zurück.Wiederholen Sie diesen Vorgang für die verbleibenden Transplantationsstellen. Sobald die Injektionen abgeschlossen sind, entfernen Sie den Hautretraktor und ziehen Sie die Haut vorsichtig mit stumpfen Pinzetten wieder über den Schädel. Verschließen Sie die Wunde nach der Operation durch Anlegen von vier bis fünf sterilen Edelstahlclips.Stellen Sie das Tier in einen beheizten Käfig und überwachen Sie seine Erholung. Ein Monat nach der Transplantation wurden Gehirnproben geschnitten und mit BRDU gefärbt, um transplantierte NSCs nachzuweisen, sowie mit Hämatin kontragefärbt. Die hier durch die rote Linie dargestellte Nadelbahn zeigt die Injektionsbahn an, die NSCs an der als TR bezeichneten Transplantatabgabestelle abgegeben hat, wie dargestellt.Hier zeigten die transplantierten NSC eine umfangreiche Migration von den Regionen Corpus callosum und CA1 zu den Regionen Gyrus dentatus und CA3 des Hippocampus. Es ist wichtig, dass der erfasste MRT-Bildsatz genau mit einem entsprechenden CT-Bildsatz verknüpft wird. Eine korrekte Bildfusion ist entscheidend für die Identifizierung und anschließende Konturierung der Hippocampus-Regionen vor dem Behandlungsverfahren. Erfassen Sie orthogonale Röntgenbilder, um sicherzustellen, dass das Tier exakt positioniert ist. Um den Erfolg der Transplantation sicherzustellen, muss während des gesamten Eingriffs ein steriles chirurgisches Umfeld aufrechterhalten werden.Markieren Sie die Otax-Koordinaten präzise und entfernen Sie die Mikrospritze nach der Injektion allmählich, um einen Flüssigkeitsreflux zu verhindern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mit einem tierischen Modell Ihrer Wahl ein klinisch relevantes Strahlungsverfahren durchführt und wie man Stammzellen chirurgisch in eine bestimmte Region des Gehirns transplantiert.

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