Name: Intracerebrale Transplantation und In Vivo Biolumineszenz-Tracking von menschlichen neuralen Vorläuferzellen im Gehirn der Maus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Erfahren Sie die intrazerebrale Transplantation und das In-Vivo-Biolumineszenz-Tracking menschlicher neuraler Vorläuferzellen im Mausgehirn. Diese Methode ermöglicht die quantitative Langzeitbeobachtung von Zellmigration und Überleben.

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Die Autoren RR und CT bedanken sich für die Unterstützung durch die Mäxi Foundation und das 3R Competence Center.

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</ol>

Die Autoren haben keine potenziellen Interessenkonflikte zu erklären.

Die Regeneration des verletzten Gehirns, um eine funktionelle Genesung zu ermöglichen, bleibt eine ungelöste Herausforderung. Viele innovative präklinische Ansätze haben sich entwickelt, die beispielsweise auf Immunmodulation19,20, Angiogenese 1,21,22,23, Blut-Hirn-Schrank-Integrität 2,3,24,25 und Zellersatz 5,26 abzielen. . Gerade in den letzten Jahren haben sich zellbasierte Therapien aufgrund großer Fortschritte in der Stammzelltechnologie und effizienter Differenzierungsprotokolle zu einer vielversprechenden Behandlungsstrategie für das Gehirn entwickelt15,28. Dieses Papier bietet ein wertvolles Protokoll für die Transplantation und Verfolgung von Nervenzellen im Gehirn der Maus. Die Methode ist für alle transduzierbaren Zelllinien für In-vivo-Anwendungen im Gehirn der Maus anwendbar.
Das vorgestellte Setup verwendet Transplantate menschlichen Ursprungs in einer Maus. Diese Transplantate sind bei immunkompetenten Wildtypmäusen aufgrund der Immunogenität langfristig nicht lebensfähig. Daher wurden immundefiziente NSG-Mäuse verwendet, um diese Einschränkung zu überwinden. Alternativ kann die Verwendung von Maustransplantaten bevorzugt werden, um die immunogenen Aspekte zu überwinden. Wenn eine Transplantation menschlicher Zellen erforderlich ist, stellen humanisierte Mausmodelle eine aufkommende Alternative dar, um die Wahrscheinlichkeit einer Transplantatabstoßung zu verringern29.
Ein kommerzieller viraler Vektor mit zwei Reportern, bestehend aus Glühwürmchen-Luciferase und eGFP unter dem EF1α-Promotor, wurde verwendet, um die Transplantate zu visualisieren. Dieser Promotor wurde ausgewählt, um eine hohe Signalintensität15 zu erreichen. Abgesehen von NPCs wurde jedoch gezeigt, dass andere Zelltypen die Gehirnfunktion nach Verletzungen fördern, einschließlich der Perizyten30 und Astrozyten31; Daher könnten je nach verwendeter Zelllinie andere Promotoren besser geeignet sein, hohe Expressionsniveaus zu erreichen. Darüber hinaus kann die Verwendung von Transgenpromotoren wie CMV zu einer Herunterregulierung führen, insbesondere in Langzeitexperimenten32. Die Transduktionseffizienz des lentiviralen Vektors hängt stark von der verwendeten Zelllinie ab und kann zwischen einzelnen Experimenten variieren. Daher muss die Transduktionseffizienz vor Beginn der In-vivo-Experimente und zur Korrektur von Variationen der Transduktionseffizienz zwischen den Experimenten bewertet werden. Auch die Hirnregion der Transplantation beeinflusst die Signalstärke. Obwohl für kortikale Transplantationen eine Nachweisgrenze von <6.000 Zellen erreicht wurde, kann es erforderlich sein, dass mehr Zellen ein Signal in tieferen Hirnregionen, zum Beispiel Striatum- oder Hippocampus, erkennen.
Die Transplantationsvolumina im Gehirn der Maus sind auf 1-2 μL begrenzt. Daher ist es wichtig, eine geeignete Zellzahl für die Experimente zu identifizieren. Es wurde bereits beobachtet, dass steigende Zellzahlen zu einer verminderten Überlebensrate führen, höchstwahrscheinlich aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von Nährstoffen und Sauerstoff im Bereich derTransplantation 33. Die In-vivo-Biolumineszenzbildgebung bietet im Vergleich zu anderen In-vivo-Bildgebungsverfahren wie MRT oder CT eine relativ geringe räumliche Auflösung. Kurze Migrationswege von transplantierten Zellen können daher nur in der anschließenden Post-hoc-Analyse zuverlässig beurteilt werden.
Die absolute Signalstärke der Biolumineszenz ist im Allgemeinen proportional zur transplantierten Zellzahl. Die Signalstärke könnte jedoch reduziert werden, wenn Transplantate in tiefere Hirnstrukturen transplantiert werden oder wenn die Signalstärke außerhalb des linearen Detektionsspektrums des In-vivo-Bildgebungssystems liegt. Derzeit werden neuartige Substrate entwickelt, um eine effizientere Penetration über die Blut-Hirn-Dämpfung zu gewährleisten als D-Luciferin, einschließlich cycluc1. Diese Substrate könnten die Nachweisgrenze der transplantierten Zellen in Zukunft weiter verbessern18. Insgesamt ermöglicht dieses Protokoll ein einfaches, minimal-invasives Verfahren zur Transplantation und Beobachtung von Transplantaten im Mäusegehirn.

Das Gehirn von Säugetieren hat nach Verletzungen oder Krankheiten begrenzte Regenerationsfähigkeiten, was innovative Strategien zur Förderung der Gewebe- und Funktionsreparatur erfordert. Präklinische Strategien konzentrieren sich auf verschiedene Aspekte der Gehirnregeneration, einschließlich Neuroprotektion, Neurogenese, Angiogenese 1,2, Blut-Hirn-Schranken-Reparatur 3,4 oder Zelltherapie 5,6. Die Zelltherapie hat den Vorteil, dass sie viele dieser Pro-Reparatur-Prozesse gleichzeitig fördern kann. In Experimenten mit der Transplantation von Zellen erfolgte die Gewebereparatur durch (1) direkten Zellersatz und (2) Produktion von Zytokinen, was zu Angiogenese und Neurogenese führte7. Jüngste Fortschritte in der Stammzelltechnologie haben die Entwicklung skalierbarer, gut charakterisierter neuronaler Zellquellen, die jetzt für klinische Studien in der Pipeline sind (überprüft in 7,8,9), weiter erleichtert. Obwohl Zelltherapien für einige neurologische Erkrankungen (z. B. Parkinson-Krankheit10, Schlaganfall 11 und Rückenmarksverletzung12) das klinische Stadium erreicht haben, war ihre Wirksamkeit variabel, und es ist mehr präklinische Forschung erforderlich, um die Mechanismen der Transplantat-Wirt-Interaktionen zu verstehen.
Eine wesentliche Einschränkung vieler präklinischer Studien ist die kontinuierliche Verfolgung der transplantierten Zellen im Wirt. Oft werden nur Endpunktmessungen durchgeführt, wobei die dynamischen Migrations- und Überlebensprozesse im Wirt ausgelassenwerden 6,13. Diese Einschränkungen führen zu einer schlechten Charakterisierung der transplantierten Zellen und erfordern hohe Tierzahlen, um Längsschnittveränderungen zu verstehen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, transduzieren wir in dieser Studie induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC)-abgeleitete neuronale Vorläuferzellen mit einem kommerziell erhältlichen lentiviralen Dual-Reporter-Vektor, der aus roter Glühwürmchen-Luciferase und verbessertem grün fluoreszierendem Protein (rFluc-eGFP) besteht. Diese Zellen werden über eine stereotaktische intraparenchymale Injektion in das Gehirn der Maus transplantiert und mit Hilfe der in vivo Biolumineszenzbildgebung über 5 Wochen longitudinal verfolgt. Nach der Hirngewebeentnahme werden die GFP-exprimierenden transplantierten Zellen identifiziert und in histologischen Hirnschnitten weiter charakterisiert. Diese Methode kann nahtlos an alternative transduzierbare Zellquellen und Transplantationswege für In-vivo-Anwendungen im Nagetiergehirn angepasst werden. Insgesamt ist das Verfahren wertvoll, um Längsschnittinformationen über das Überleben und die Migration von Transplantaten im Gehirn der Maus zu erhalten und die anschließende histologische Charakterisierung zu erleichtern.

<table><tbody><tr><td>Virale Transduktion</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro (Lenti-Labeler-Virus)</td><td>Systembio</td><td>LL410VA-1</td><td></td></tr><tr><td>Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Mikroröhrchen; 1,5 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z606340</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Röhrchen; 15 mL</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop-Deckgläser</td><td></td><td></td><td>Produkt nach Wahl</td></tr><tr><td>Objektträger</td><td></td><td></td><td>Produkt nach Wahl</td></tr><tr><td>Sterlie Wattestäbchen</td><td></td><td></td><td>Produkt nach Wahl</td></tr><tr><td>Nähte; 5/0 Seide mit gebogener Nadel</td><td>B. Braun</td><td>G0762482</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenfilter; 0,22 & Mikro; m</td><td>TPP</td><td>99722</td><td></td></tr><tr><td>Spritze; 1 mL und 0,5 mL</td><td>B. Braun</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturplatte (24 Well)</td><td>TPP</td><td>92024</td><td></td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automatisierter Zellzähler (Vi-CELL XR)</td><td>Beckmann Coulter Life Science</td><td>383721</td><td></td></tr><tr><td>Pinzetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>11064-07</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette, fein</td><td>Fine Science Tools</td><td>11412-11</td><td></td></tr><tr><td>Heizkissen</td><td></td><td></td><td>Produkt nach Wahl</td></tr> High <tr><td>Speed Brushless Micromotor Kit</td><td>Foredom</td><td>K.1060-22.</td><td></td></tr><tr><td>Ideales Mikrobohrer-Set mit 5</td><td>Zellpunkt-spezifischen</td><td>60-1000<</td><td></td></tr><tr><td>em>In-Vivo-Bildgebungssystem (IVIS Lumina III mit Living Imaging 4.2 Softwarepaket)</td><td>Perkin Elmer</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran-Verdampfer</td><td>Provet AG</td><td>330724</td><td></td></tr><tr><td>Mikroinjektionsspritzen-Pumpensystem</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3T-1</td><td></td></tr><tr><td>Mikroliter-Spritze; 700er-Serie; Lautstärke: 5-10 &Mikro; L</td><td>Hamilton</td><td>7635-01</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica</td><td>HM430</td><td></td></tr><tr><td>NanoFill-33 G-Nadel (abnehmbar und wiederverwendbar)</td><td>World Precision Instruments</td><td>NF33BV-2</td><td></td></tr><tr><td>Nadelhalter</td><td>Fine Science Tools</td><td>12001-13</td><td></td></tr><tr><td>Perfusionspumpe und -schläuche</td><td>Masterflex</td><td>HV-77120-42</td><td></td></tr><tr><td>Skalpell</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Kleine Bonnschere, gerade</td><td>Fine Science Tools</td><td>14184-09</td><td></td></tr><tr><td>Kleine Federschere, gerade</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Spatel</td><td>Merck</td><td>Z243213-2EA</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktischer Rahmen für Nagetiere; motorisiert</td><td>World Precision Instruments</td><td>99401</td><td></td></tr><tr><td>Pharmazeutika und Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>A11105-01</td><td>Proteolytikum und Kollagenolytikum; Reagenz zur Zelldissoziation</td></tr><tr><td>Anti-Human-Nuclei Antikörper, Klon 235-1, Biotin-Konjugat</td><td>Merck</td><td>MAB1281B</td><td></td></tr><tr><td>B27 &ndash; Nahrungsergänzungsmittel (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504-001</td><td></td></tr><tr><td>Betadine (11 mg Iod als Povidon-Iod pro 1 ml L&ouml; sung)</td><td>Mundipharma Medical Company</td><td>Alle Arzneimittel wurden von der Kantonsapotheke Zürich, Schweiz, zur Verfügung gestellt</td><td></td></tr><tr><td>Blockierungslösung (3% Eselsserum; 0,1% Triton-X-100 in PBS)</td><td></td><td></td><td>Produkt nach Wahl; kann hausgemacht</td></tr><tr><td>werden CHIR99021 (10 mM &ndash; 2.500x)</td><td>StielMACS</td><td>130-103-926</td><td></td></tr><tr><td>Kryoprotektiv-Lösung</td><td></td><td></td><td>Produkt der Wahl; kann hausgemacht werden</td></tr><tr><td>DAPI-Lösung (1 mg/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin Kaliumsalz</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>Esel Anti-Maus IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-31570</td><td></td></tr><tr><td>Eselsserum</td><td></td><td></td><td>Produkt der Wahl</td></tr><tr><td>Esconarcon (Pentobarbitalum natricum 300 mg)</td><td>Streuli Pharma AG</td><<td>em>Alle Arzneimittel wurden von der Kantonsapotheke, Zürich, Schweiz, zur Verfügung gestellt</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol; 70%</td><td></td><td></td><td>Produkt der Wahl</td></tr><tr><td>FGF Rekombinantes humanes Protein, frei von tierischem Ursprung</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; </td><td></td>PHG6015</tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>Gibco</td><td>A12860-01</td><td></td></tr><tr><td>hLif (10 & Mikro; g/mL &ndash; 1.000x)</td><td>PeproTech</td><td>AF-300-05-25UG</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran (Isofluran (1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl-difluormethyl&shy; 99,9%)</td><td>Provet AG</td><<td>em>Alle Arzneimittel wurden von der Kantonsapotheke, Zürich, Schweiz, zur Verfügung gestellt</td><td></td></tr><tr><td>Laminin-L521 (L-521)</td><td>Biolaminin</td><td>LN LN521</td><td></td></tr><tr><td>Lidocain Salbe (Lidocain: 25 mg, Prilocain: 25 mg)</td><td>Aspen Pharma Schweiz GmbH</td><td>Alle Arzneimittel wurden von der Kantonsapotheke Zürich, Schweiz, zur Verfügung gestellt</td><td></td></tr><tr><td>Montage Medium</td><td></td><td></td><td>Produkt nach Wahl; kann selbst gemacht werden</td></tr><tr><td>N2- Supplement (100x)</td><td>Gibco</td><td>&nbsp; 75202-001</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasales</td><td>Gibco</td><td>&nbsp; 21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Ophtalmisches Gleitmittel (Retinolpalmitat: 15.000 IE)</td><td>Bausch & Lomb Swiss AG</td><<td>em>Alle Arzneimittel wurden von der Kantonsapotheke Zürich, Schweiz, zur Verfügung gestellt</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd-Lösung</td><td></td><td></td><td>Produkt der Wahl</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>Kann auch hausgemacht werden</td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithin-Lösung (pLO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl (Carprofen 50 mg)</td><td>Zoetis Schweiz GmbH</td><td>Alle Arzneimittel wurden von der Kantonsapotheke Zürich, Schweiz, zur Verfügung gestellt</td><td></td></tr><tr><td>Ringer Laktat</td><td>B. Braun</td><td>3570500</td><td></td></tr><tr><td>Ringer Lösung</td><td>B. Braun</td><td>3570030</td><td></td></tr><tr><td>Kochsalzlösung (0,9% NaCl)</td><td>B. Braun</td><td>3570160</td><td></td></tr><tr><td>SB431542 (10 mM &ndash; 3.333,3x)</td><td>StemMACS</td><td>130-106-543</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekleber (Histoacryl)</td><td>B. Braun</td><td>1050060</td><td></td></tr></tbody></table>

intracerebrale transplantation und in vivo biolumineszenz-tracking von menschlichen neuralen vorläuferzellen im gehirn der maus

Intracerebral Transplantation and In Vivo Bioluminescence Tracking of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain

Die Zelltherapie ist seit langem ein aufstrebendes Behandlungsparadigma in der experimentellen Neurobiologie. Zelltransplantationsstudien stützen sich jedoch häufig auf Endpunktmessungen und können daher longitudinale Veränderungen der Zellmigration und des Überlebens nur in begrenztem Umfang bewerten. Dieses Papier bietet ein zuverlässiges, minimal-invasives Protokoll zur Transplantation und Längsverfolgung neuronaler Vorläuferzellen (NPCs) im erwachsenen Mäusegehirn. Vor der Transplantation werden die Zellen mit einem lentiviralen Vektor transduziert, der einen biolumineszenten (Firefly-Luciferase) und fluoreszierenden (grün fluoreszierendes Protein [GFP]) Reporter umfasst. Die NPCs werden mit Hilfe stereotaxischer Injektionen in den sensomotorischen Kortex in die richtige kortikale Hemisphäre transplantiert. Nach der Transplantation wurden gepfropfte Zellen bis zu fünf Wochen (an den Tagen 0, 3, 14, 21, 35) mit einer Auflösungsgrenze von 6.000 Zellen mittels In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung durch den intakten Schädel nachgewiesen. Anschließend werden die transplantierten Zellen in histologischen Hirnschnitten identifiziert und weiter mit Immunfluoreszenz charakterisiert. Somit bietet dieses Protokoll ein wertvolles Werkzeug, um Zellen im Gehirn der Maus zu transplantieren, zu verfolgen, zu quantifizieren und zu charakterisieren.

Unser Ziel ist es, transplantierte neurale Vorläuferzellen im Gehirn der Maus mit Hilfe der In-vivo-Biolumineszenzbildgebung längsschnittlich zu verfolgen und die transplantierten Zellen in der anschließenden histologischen Analyse zu identifizieren (Abbildung 1A). Daher werden neurale Vorläuferzellen mit einem lentiviralen Vektor transduziert, der aus EF1α-rFluc-eGFP besteht. Vor der Transplantation wurden die Zellen auf eine erfolgreiche Transduktion durch Expression von eGFP in vitro getestet (Abbildung 1B). Die erfolgreich transduzierten Zellen wurden im Gehirn der Maus an den gewünschten Koordinaten (z.B. im sensomotorischen Kortex) stereotaktisch transplantiert. Nach der Transplantation wurde den Mäusen systemisch D-Luciferin, das Substrat für rFluc, injiziert und die Signalintensitäten der transplantierten Zellen wurden gemessen, um eine erfolgreiche Transplantation zu bestätigen (Abbildung 1C).
Um die Nachweisgrenze der in vivo Biolumineszenzbildgebung zu bewerten, wurde ein Bereich von 6.000-180.000 Zellen in den rechten sensomotorischen Kortex der Maus transplantiert (Abbildung 2A). Wir detektierten &lt;6.000 Zellen und ein Biolumineszenzsignal proportional zur transplantierten Zellzahl direkt nach der Transplantation (Abbildung 2B). Da menschliche Zellquellen immunogen zu immunkompetenten Mäusen sind, wurden immunodefiziente NOD scid gamma (NSG) Mäuse verwendet, um das langfristige Überleben der Zelltransplantate zu beobachten. Das Langzeitüberleben und der Nachweis eines Biolumineszenzsignals für bis zu 5 Wochen wurden nach der Zelltransplantation bestätigt (Abbildung 2C,D). Die transplantierten Zellen wurden in einer anschließenden histologischen Analyse durch den eGFP-Reporter und die Immunfärbung mit antimenschlichen Kernen und antihumanen mitochondrialen Antikörpern erfolgreich ex vivo nachgewiesen (Abbildung 2E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63102/63102fig01.jpg"> Abbildung 1: Transplantation von neuralen Vorläuferzellen . (A) Schematische Übersicht über die Erzeugung und Transplantation von rFluc-eGFP-NPCs. (B) Repräsentatives Immunfluoreszenzbild von transduzierten NPCs (GFP-Reporter, grün), die mit DAPI (blau) konterfärbt sind; Skalenbalken = 5 μm. (C) In-vivo-Nachweis des Biolumineszenzsignals in transplantierten Zellen; Farbbalken = blau (0, min, kein Signal), rot (4 Fluss, p/s × 105, max. Signal) Abkürzungen: NPCs = neurale Vorläuferzellen; GFP = grün fluoreszierendes Protein; rFluc-eGFP = rotes Glühwürmchen-Luciferase und verbessertes grün fluoreszierendes Protein; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol; p/s = Photonen/s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63102/63102fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63102/63102fig2v2.jpg"> Abbildung 2: Zeitlicher Verlauf der transplantierten Zellen. (A) Schematische Darstellung der Zellnummern für die Transplantation. (B) Nachweisgrenze der transplantierten Zellen 1 h nach der Transplantation. (C, D) Zeitlicher Verlauf der Transplantation (180.000 Zellen) für bis zu 35 Tage bei NSG-Mäusen ; Farbbalken = blau (0, min, kein Signal), rot (4 Fluss, p/s × 105, max Signal) Die Daten sind Mittelwert ± SEM (n = 3). (E) Repräsentative Fluoreszenzbilder von histologischen Schnitten und transplantierten Zellen 5 Wochen nach der Transplantation. Maßstabsleiste = 10 μm. Abkürzungen: D = Tag nach der Transplantation; NSG = immundefizientes NOD scid gamma; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol; GFP = grün fluoreszierendes Protein; HuNu = Anti-Human Nuclei Antikörper, Klon 235-1; p/s = Photonen/s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63102/63102fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

Wir beschreiben die intraparenchymale Transplantation von humanen neuralen Vorläuferzellen, die mit einem dualen Reportervektor transduziert werden, der Luciferase-grün fluoreszierendes Protein (GFP) im Gehirn der Maus exprimiert. Nach der Transplantation wird das Luciferase-Signal wiederholt mit In-vivo-Biolumineszenz und GFP-exprimierenden transplantierten Zellen gemessen, die in Hirnschnitten mittels Fluoreszenzmikroskopie identifiziert wurden.

Intracerebrale Transplantation und In Vivo Biolumineszenz-Tracking von menschlichen neuralen Vorläuferzellen im Gehirn der Maus

Cell therapy has long been an emerging treatment paradigm in experimental neurobiology. However, cell transplantation studies often rely on end-point ...

Die zellbasierte Therapie hat ein enormes Potenzial für die Regeneration des Gehirns. Das Protokoll, das wir hier demonstrieren, ist wertvoll, da es eine longitudinale In-vivo-Bildgebung von transplantierten Zellen im Gehirn der Maus ermöglicht. Dieses Protokoll ist besonders nützlich, um Erkenntnisse über die Migration und das Überleben des Transplantats im selben Tier über einen bestimmten Zeitraum zu gewinnen.Dieses Verfahren kann auf jede Luciferase-exprimierende Zelllinie angewendet werden, die in das Gehirn der Maus transplantiert wird. Die Signalstärke kann jedoch je nach Tiefe der Transplantation oder der Luciferase-Expression in der jeweiligen Zelllinie variieren. Demonstriert wird das Verfahren von Rebecca Weber, einer exzellenten Doktorandin in unserem Labor.Beginnen Sie mit dem Sammeln einer Durchstechflasche mit Zellen aus dem Lager von minus 150 Grad Celsius und bringen Sie sie ins Labor. Bringen Sie die Durchstechflasche schnell für zwei bis drei Minuten in ein bei 37 Grad Celsius temperiertes Wasserbad, bis sich Eiskristalle auflösen. Übergeben Sie dann die Durchstechflasche in die Biosicherheitskabine und pipettieren Sie den gesamten Inhalt in ein steriles 15-Milliliter-Konusröhrchen.Fügen Sie neun Milliliter steriles PBS hinzu und zentrifugieren Sie bei 300 G für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand durch Aspiration, ohne das Pellet zu stören, und zählen Sie die Zellen vor dem endgültigen Spin mit einem automatisierten Zellzähler. Transportieren Sie das Tier von der Induktionskammer zum stereotaktischen Rahmen und halten Sie die Anästhesie mit einer Gesichtsmaske aufrecht.Tragen Sie ophthalmisches Gleitmittel auf, um ein Austrocknen der Augen zu verhindern. Rasieren Sie die Kopfhaut der Maus mit einem elektrischen Rasierer und desinfizieren Sie die Haut mit 5% Betadinlösung mit Wattestäbchen. Befestigen Sie den Mauskopf und setzen Sie die Ohrstangen in den äußeren Meatus ein.Bohren Sie mit einem chirurgischen Zahnbohrer ein Loch mit einem Durchmesser von zwei bis drei Millimetern durch den Schädel. Suspendieren Sie die vorbereiteten Zellen im Röhrchen und ziehen Sie zwei Mikroliter Zellsuspension in eine Spritze. Platzieren Sie die Spritze über der Zielstelle und bewegen Sie die Nadel langsam an die Oberfläche der Dura und berechnen Sie die Tiefenkoordinaten.Doppelklicken Sie auf das Symbol der Living Image-Software und wählen Sie eine Benutzer-ID aus der Dropdown-Liste aus. Klicken Sie dann in der angezeigten Systemsteuerung auf Initialisieren. Aktivieren Sie in der Living Image-Software die Kontrollkästchen "Lumineszierend" und "Fotografieren" in der Systemsteuerung und wählen Sie "Automatische Belichtung".Wählen Sie ein Sichtfeld aus. Geben Sie die Betreffhöhe ein und wählen Sie die Option Motivhöhe-Fokus verwenden aus. Stellen Sie die Filterparameter manuell ein, einschließlich Large Binning, F / Stop, blockierter Erregungsfilter und offener Emissionsfilter.Injizieren Sie das Luciferin intraperitoneal und betäuben Sie die Tiere nach fünf Minuten mit einer kontinuierlichen Isofluranversorgung. Rasieren Sie die sedierten Tiere auf der Kopfregion mit einem herkömmlichen Haarrasierer. Legen Sie das Tier in die Bildgebungskammer und beginnen Sie 15 Minuten nach der Luciferin-Injektion mit der Bildgebung, indem Sie in der Systemsteuerung auf Erfassen klicken.Vor der Transplantation neuronaler Vorläuferzellen im Gehirn der Maus wurden die Zellen auf eine erfolgreiche Transduktion durch Expression von EGFP in vitro getestet. Die erfolgreiche Transplantation wurde durch das Vorhandensein des roten Firefly-Luciferase-Signals bestätigt. Nach der Transplantation von 6.000 bis 180.000 Zellen in den rechten sensomotorischen Kortex der Maus war das Biolumineszenzsignal in allen Konzentrationen nachweisbar.Die Zellen überlebten nach der Transplantation mindestens fünf Wochen. Die transplantierten Zellen wurden in einer anschließenden histologischen Analyse durch den EGFP-Reporter und die Immunfärbung mit antimenschlichen Kernen ex vivo erfolgreich nachgewiesen. Es ist sehr wichtig, die Injektionskoordinaten sorgfältig zu berechnen, um zu vermeiden, dass die Zielstelle verfehlt wird.Lassen Sie die Spritze nach der Transplantation mindestens fünf Minuten an Ort und Stelle, um Reflux zu vermeiden. Nach der in vivo biolumineszenten Bildgebung kann das Hirngewebe entweder für die histologische Analyse vorbereitet werden, oder die transplantierten Zellen können mittels FACS isoliert und mit verschiedenen oder gemischten Technologien charakterisiert werden. Insgesamt bietet diese Technik eine quantitative und kontinuierliche Verfolgung von transplantierten Zellen im Gehirn und kann auf eine Vielzahl von neurologischen Erkrankungen wie Schlaganfall und traumatische Hirnverletzung angewendet werden.

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Mit dem wachsenden Interesse an Stammzelltherapien, sind molekulare Bildgebungsverfahren ideal für die Überwachung Stammzellen Verhalten nach der Transplantation. Luciferase Reporter Gene nicht-invasive, repetitive Beurteilung der das Überleben der Zelle, den Standort und Verbreitung in vivo ermöglicht. Dieses Video wird gezeigt, wie man hESC Proliferation in einer lebenden Maus zu verfolgen.

In vitro und in vivo Biolumineszenz Reporter Gene Imaging von humanen embryonalen Stammzellen

Luciferase-modifizierten menschlichen Gehirns Tumorxenotransplantaten können intrakraniell in athymischen Mäusen festgestellt werden, mit anschließender Überwachung des Tumorwachstums und Ansprechen auf die Therapie mit Biolumineszenz-Bildgebung. In Kombination mit dem Überleben Analyse wird Biolumineszenz Überwachung ein wesentliches Recherche-Tool für die präklinische Prüfung von Therapien, zur Behandlung von Gehirntumoren betrachtet.

Gründung Intrakranielle Brain Tumor Xenografts mit anschließender Analyse des Tumorwachstums und Ansprechen auf die Therapie mit Biolumineszenz-Bildgebung

Intrakranielle Implantation von GL261-Zellen in C57BL / 6 Mäusen produziert maligne Gliome, dass viele Merkmale der menschlichen Glioblastoma multiforme zu rekapitulieren. Wir verwendeten GL261-Zellen stabil exprimiert Luziferase, damit wir...

Intrakranielle Implantation mit anschließender 3D In Vivo Bioluminescent Imaging von Murine Gliome

Dieser Artikel beschreibt eine optimierte Abfolge der Ereignisse für multimodale Bildgebung von zellulären Transplantaten im Gehirn von Nagetieren mit: (i) In-vivo-Biolumineszenz-und Kernspintomographie, und (ii) post mortem histologische Analyse. Die Kombination dieser bildgebenden Verfahren auf einem einzigen Tier erlaubt zelluläre Transplantat Auswertung mit hoher Auflösung, Empfindlichkeit und Spezifität.

Multimodale Bildgebung von Stem Cell Implantation in das zentrale Nervensystem der Mäuse

Quelle: Weber, R. Z., et al. Intrazerebrale Transplantation und In-vivo-Biolumineszenzverfolgung von humanen neuralen Vorläuferzellen im Gehirn der Maus. J. Vis. Exp. (2022)Dieses Video zeigt die stereotaktische Transplantation von genetisch veränderten humanen neuralen Vorläuferzellen (NPCs) in das Gehirn von Mäusen. Die Forscher injizieren NPCs, die Luziferase und fluoreszierende Proteine exprimieren, und ermöglichen so in vivo Biolumineszenz-Bildgebung und postmortale Fluoreszenzmikroskopie,...

Transplantation von humanen neuralen Vorläuferzellen in das Gehirn von Mäusen

Quelle: Weber, R. Z., et al., Intracerebral Transplantation and In Vivo Bioluminescence Tracking of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (2022)Dieses Video zeigt die Methode zur in vivo Biolumineszenz-Bildgebung von genetisch veränderten humanen neuralen Vorläuferzellen, die in ein Mausgehirn injiziert werden. Der Prozess umfasst die Injektion von Luciferin, die Vorbereitung der Bildgebung und den Nachweis von Biolumineszenzsignalen der transplantierten Zellen an der...

In vivo Biolumineszenz-Bildgebung von humanen neuralen Vorläuferzellen in einem Mausgehirn

Basierend auf der in vitro lentiviralen Entwicklung neuronaler Vorläufer, ihrer Co-Transplantation in Wilde-Gehirne und der gepaarten morphometrischen Auswertung von "Test"- und "Kontrollderivaten" ermöglicht diese Methode eine genaue Modellierung der In-vivo-Genkontrolle neokortikaler Neuronenmorphologie auf einfache und erschwingliche Weise.

Intraventrikuläre Transplantation von engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Dieses Protokoll zeigt Methoden für ein Mausmodell der traumatischen Hirnverletzung mit offenem Schädel und die Transplantation kultivierter, humaninduzierter pluripotenter Stammzellen-abgeleiteter Zellen in die Verletzungsstelle. Verhaltens- und histologische Tests der Ergebnisse dieser Verfahren werden ebenfalls kurz beschrieben.

Kontrolliertes kortikales Wirkungsmodell der Maushirnverletzung mit therapeutischer Transplantation von humaninduzierten Pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Neuralzellen

Diese Studie zeigt die Verabreichung eines wiederholten Schädel-Hirn-Traumas an Mäuse und die gleichzeitige Implantation eines kranialen Fensters für die anschließende intravitale Bildgebung eines neuronenexprimierten EGFP mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie.

Intravitale Bildgebung der fluoreszierenden Proteinexpression bei Mäusen mit Schädel-Hirn-Trauma und Schädelfenster mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Transplantation und Verfolgung markierter Nervenzellen in menschliche Hirnorganoide.

Ein menschliches zerebrales Organoidmodell der neuronalen Zelltransplantation

Erfahren Sie die intrazerebrale Transplantation und das In-Vivo-Biolumineszenz-Tracking menschlicher neuraler Vorläuferzellen im Mausgehirn. Diese Methode ermöglicht die quantitative Langzeitbeobachtung von Zellmigration und Überleben.

Intracerebrale Transplantation und In Vivo Biolumineszenz-Tracking von menschlichen neuralen Vorläuferzellen im Gehirn der Maus

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