Isolierung sensorischer Neuronen und Co-Kultivierung mit natürlichen Killerzellen

Nehmen Sie ein Spinalganglion oder DRG, eine Ansammlung sensorischer Neuronen, in ein kaltes, serumhaltiges Medium, um die Neuronen während der nachfolgenden Verarbeitung zu schützen.

Zentrifuge, dann den Überstand entfernen.

Fügen Sie einen Phosphatpuffer hinzu, der Verdauungsenzyme enthält, und inkubieren Sie unter leichtem Rühren.

Die Enzyme dissoziieren die extrazelluläre Matrix (EZM) und das DRG-Gewebe und lockern die Zellen.

Fügen Sie ein serumhaltiges Medium hinzu, um die Enzyme zu inaktivieren.

Zentrifugieren Sie und entsorgen Sie dann den Überstand.

Resuspendieren Sie das DRG und dissoziieren Sie das Gewebe mechanisch mit immer kleineren Pipetten, um eine Zellsuspension zu erhalten.

Schichten Sie die Zellen auf einen Dichtegradienten aus Rinderserumalbumin.

Zentrifuge. Die Neuronen setzen sich am Boden ab und bilden ein Kügelchen.

Entsorgen Sie die Schichten, die Gewebereste enthalten.

Resuspendieren Sie die Neuronen in einem Kulturmedium.

Geben Sie die Neuronen in eine mit EZM beschichtete Kulturschale und inkubieren Sie.

Entfernen Sie das Medium und fügen Sie natürliche Killer- oder NK-Zellen hinzu.

Fügen Sie ein Medium zur Co-Kultur hinzu und untersuchen Sie die Interaktion zwischen diesen Zellen.

Ernten Sie die DRGs in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen, das mit 10 Millilitern eiskaltem, zugesetztem DMEM gefüllt ist. Dann zentrifugieren Sie das Präparat 5 Minuten lang bei 200 g bei Raumtemperatur und entfernen den Überstand. Fügen Sie 250 Mikroliter PBS hinzu, die 1 Milligramm pro Milliliter Kollagenase IV und 2,4 Einheiten pro Milliliter Dispase enthalten. Inkubieren Sie dieses DRG 80 Minuten lang mit Kollagenase-Dispase-Lösung unter leichtem Rühren.

Um die Enzyme zu inaktivieren, fügen Sie 5 Milliliter zugesetztes DMEM-Medium hinzu und zentrifugieren Sie die Lösung bei 200 g. Entfernen Sie nach 5 Minuten vorsichtig den Überstand mit einer Pipette und lassen Sie etwa 100 Mikroliter des Überstands übrig, um unerwünschten Zellverlust zu vermeiden. Geben Sie anschließend 1 Milliliter supplementiertes DMEM in die Zellen und verwenden Sie eine Pipettenpistole und drei Pasteur-Glaspipetten mit abnehmender Größe, um das DRG vorsichtig zu einer Einzelzellpräparation zu zerkleinern.

Geben Sie mit einer P200-Pipette die verreibte Gangliensuspension, die die Neuronen enthält, auf die Seite des Röhrchens in den BSA-Gradienten. Stellen Sie dann die Beschleunigung und Verzögerung auf das Minimum ein, um das Neuron mit dem BSA-Gradienten 12 Minuten lang bei 200 g zu zentrifugieren. Entfernen Sie nach der Zentrifugation den gesamten Überstand mit einer Pipette und resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern neurobasalem Material.

Platte 10.000 Neuronen pro Well in einer mit Laminin beschichteten 96-Well-Platte mit flachem Boden. Um die Anheftung der Neuronen zu ermöglichen, inkubieren Sie die 96-Well-Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius. Um mit der Co-Kultivierung zu beginnen, entfernen Sie langsam das Neurobasal aus der Neuronenkultur und fügen Sie der Neuronenkultur 10⁵ NK-Zellen pro Vertiefung hinzu.