Calcium-Bildgebung in einzelnen Neuronen zur Regulierung des Eiablageverhaltens bei Caenorhabditis elegans

Nehmen wir transgene Caenorhabditis elegans-Würmer, die auf einem Agarblock wachsen.

Diese Würmer exprimieren einen Kalziumindikator, GCaMP5, und ein Kalzium-unempfindliches fluoreszierendes Protein, mCherry, in Neuronen, die das Eiablageverhalten regulieren.

Montieren Sie die Würmer auf einem inversen Mikroskoptisch.

Visualisieren Sie GCaMP5- und mCherry-Fluoreszenz.

Vor der Freisetzung der Eizellen werden die Neuronen aktiviert und öffnen spannungsgesteuerte Kalziumkanäle, die den Kalziumeinstrom ermöglichen.

Intrazelluläres Kalzium bindet an GCaMP5, verändert dessen Konformation und erhöht die Fluoreszenz.

In der Zwischenzeit bleibt die mCherry-Fluoreszenz unverändert, was die Verfolgung des Neurons ermöglicht.

Die aktivierten Neuronen setzen Neurotransmitter frei, die an bestimmte Muskelrezeptoren binden und die Freisetzung von Eizellen auslösen.

Nach der Freisetzung schließen sich die Kalziumkanäle, wodurch der Kalziumeinstrom und die GCaMP5-Fluoreszenz reduziert werden.

Nehmen Sie als Nächstes Hellfeldbilder auf, um die Bewegung der Wurme zu beobachten.

Eine verminderte Bewegung tritt aufgrund von Muskelkontraktionen vor der Freisetzung der Eizelle auf.

Nach der Freisetzung der Eizellen entspannen sich die Muskeln und stellen die normale Bewegung wieder her.

Messen Sie das GCaMP5-mCherry-Fluoreszenzverhältnis und die Wurmgeschwindigkeit, um Eifreisetzungsereignisse zu erkennen.

Klicken Sie für die ratiometrische Kalziumbildgebung auf der Registerkarte Sequenz auf Start, um die Aufzeichnung zu starten, und verfolgen Sie den Wurm mit dem Joystick, wobei die interessierenden Zellen und Synapsen in der Mitte des Sichtfelds scharf bleiben. In dem Moment, in dem die Fluoreszenzaufzeichnung gestartet wird, werden Trigger an die wartende Hellfeldkamera und den Stage-Controller gesendet, die mit der Erfassung synchronisierter Bilder und der Tischposition beginnen.

Klicken Sie im Histogramm-Fenster auf die Schaltfläche Statistiken, um Pixelstatistiken für jeden Kanal anzuzeigen. Passen Sie die LED-Leistung an, um eine maximale Einzelpixel-mCherry-Fluoreszenz am präsynaptischen Terminus von mindestens 8.000 Zählungen im roten Kanal zu gewährleisten, was einen Dynamikbereich von etwa 12 Bit über dem Hintergrund ergibt. Die Kalzium-Reportersignale am präsynaptischen Terminus während der Ruhephase oder eines niedrigen Kalziumgehalts sollten im grünen Kanal etwa 2.500 Zählungen betragen.

Zeichnen Sie das Verhalten auf, bis ein aktiver Zustand der Eiablage erreicht ist. Speichern Sie dann eine 10-minütige Teilmenge mit 6.000 Frames vor und 6.001 Frames nach dem ersten Eiablageereignis. Achten Sie darauf, dass die gleiche Teilmenge von Hellfeldbildern des Wurmverhaltens und der Zeitpunkte der XY-Tischposition beibehalten wird, da sonst die genaue Synchronisation der Datenströme verloren geht.