Sezieren Host-Virus-Interaktion in Lytic Replikation von einem Modell Herpesvirus

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, mit verschiedenen virologischen und biochemischen Ansätzen die Rolle eines Wirtssignalwegs bei der lytischen Replikation eines Herpesvirusmodells zu untersuchen. Hier untersuchen wir beispielhaft die Rolle des mitochondrialen antiviralen Signalproteins Mavs während der Infektion mit dem Herpesvirus gamma HV 68. Um die Rolle von Mavs bei akuten Infektionen zu untersuchen, werden Wildtyp- und Mavs-Knockout-Mäuse nach einer akuten Virusinfektion mit gamma HV 68 infiziert.

Die Lunge der Maus wird entnommen und die Viruslast wird durch einen Plaque-Assay bestimmt, bei dem die Proben seriell verdünnt und plattiert werden. Auf Monolayern wird dann die Anzahl der Plaques gezählt. Die erhöhte Viruslast bei den Knockout-Mäusen deutet darauf hin, dass das interessierende Gen eine antivirale Rolle spielt.

Im Gegensatz dazu deutet eine reduzierte Viruslast bei Knockout-Mäusen darauf hin, dass das Gen für eine Virusinfektion erforderlich ist. Um diese Ergebnisse zu validieren. In vitro wird die mehrstufige Wachstumskinetik von Viren in embryonalen Fibroblasten der Maus untersucht, wobei embryonale Fibroblasten der Wildtyp- und MAVS-Knockout-Maus mit gamma HV 68 infiziert und zu verschiedenen Zeiten inkubiert werden. Die Zellen werden dann gesammelt und Plaque-Assays durchgeführt, um die mehrstufige Wachstumskinetik zwischen Wildtyp-Zellen und MAVS-defizienten Zellen zu vergleichen.

Um diese Ergebnisse weiter zu validieren, werden embryonale Fibroblastenzellen aus Wildtyp- und MAVS-Knockout-Mäusen mit gamma HV 68 infiziert. Dann werden DNA und RNA getrennt aus den infizierten Zellen extrahiert und die viralen genomischen Transkripte werden durch Echtzeit-PCR analysiert. Wir hatten die Idee zu diesem Protokoll, als wir die Rolle eines Immunitätswegs des Wirts während einer virusartigen Infektion untersuchten.

Dieses Protokoll kann möglicherweise angewendet werden, um die Regeln der Signalwege des Wirts während der Infektion durch andere Krankheitserreger zu untersuchen. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie sechs bis acht Wochen alte, geschlechtsspezifische Mäuse für einen Zeitraum von vier Tagen nach dem Versand akklimatisieren lassen. Das folgende Experiment wird in einer Biohazard-Anlage durchgeführt.

Ziehen Sie zur Vorbereitung eine persönliche Schutzausrüstung an, z. B. einen Laborkittel, Handschuhe, eine Maske und Stiefeletten, die in einem Schrank für biologische Sicherheit arbeiten. Stufe zwei. Bereiten Sie die Virussuspension mit 40 bis 10.000 PFU Gamma HV 68 und 30 Mikrolitern sterilem PBS für jede Maus vor, die infiziert wird.

Bewahren Sie die Virussuspension nach einer intraperitonealen Injektion von Ketamin Xylazin auf Eis auf. Stellen Sie sicher, dass die Mäuse sediert wurden, indem Sie eine Zehenkneifung durchführen. Geben Sie dann mit einer Pipette 30 Mikroliter der Virussuspension tropfenweise in das linke oder das rechte Nasenloch.

Legen Sie die Maus fünf bis 10 Minuten lang auf die Seite, um die Abgabe des Virus in die Lunge über die Atemwege zu erleichtern. Setzen Sie die Mäuse dann wieder in ihren Käfig und überwachen Sie sie, bis sie sich vollständig von der Sedierung erholt haben. Als nächstes wird Lungengewebe von den injizierten Mäusen entnommen, um ein Zelllysat zur Bestimmung des Virustiters an verschiedenen Tagen nach der Infektion herzustellen.

Legen Sie die Lungen von geopferten Mäusen in sterile 1,5-Milliliter-Röhrchen mit Schraubverschluss mit 500 Mikrolitern 1,0 Millimeter Zirkonoxid-Kieselsäurekügelchen auf Eis. Wenn nicht, fahren Sie am selben Tag mit dem nächsten Schritt fort. Lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius.

Andernfalls fügen Sie einen Milliliter kaltes serumfreies DMEM hinzu. Legen Sie das Röhrchen in einen Rührbesen und drücken Sie Start, um die Lunge 30 Sekunden lang zu homogenisieren. Um eine Überhitzung der Probe zu vermeiden, die das Virus inaktivieren kann.

Kühlen Sie das Röhrchen nach 30 Sekunden Homogenisierung mindestens eine Minute lang auf Eis. Wiederholen Sie dann diesen Vorgang. Als nächstes zentrifugieren Sie das homogenisierte Gewebe bei 16.000 RCF bei vier Grad Celsius für eine Minute.

Nach dem Spin befinden sich die Zelltrümmer am Boden des Röhrchens und die Lipide an der Oberfläche. Nehmen Sie sofort die Snat, wie hier gezeigt, um einen Plaque-Assay mit einer NIH-Monoschicht mit drei T-, Drei- oder BHK 21-Monolayern durchzuführen. Als nächstes wird ein Plaque-Assay durchgeführt. Um den in der Probe vorhandenen Virustiter zu bestimmen, beginnen Sie den Plaque-Assay, indem Sie eine serielle Verdünnung des Virusüberstands vornehmen.

Geben Sie zunächst mit einer Mehrkanalpipette 270 Mikroliter Medium auf eine 96-Well-Platte. Lassen Sie die erste Zeile leer. Geben Sie dann 200 Mikroliter Überstand in die erste Reihe der 96-Well-Plattenplatte, jede Probe in dreifacher Ausfertigung.

Übertragen Sie anschließend 30 Mikroliter der Probe von der ersten Reihe in die nächste Reihe und mischen Sie. Dann 30 Mikroliter der Mischung in die nächste Reihe geben und vermischen. Wiederholen Sie diesen Schritt mehrmals, um zehnfache serielle Verdünnungen zu erzielen.

Geben Sie anschließend den verdünnten Virusüberstand auf die Zellmonoschicht. In einer 24-Well-Platte. Stellen Sie die Platte in einen Inkubator und schütteln Sie die Platte alle 30 Minuten während einer zweistündigen Inkubation nach der Inkubation, um Zelltrümmer zu entfernen, und aspirieren Sie den Überstand von der Platte.

Waschen Sie die Zellen dann einmal mit frischem Medium. Geben Sie nach dem Waschen methylcellulosehaltiges Medium in die Zellen. Inkubieren Sie die Zellen vier bis sechs Tage lang.

Nach vier bis sechs Tagen sind vergangen. Verwenden Sie ein Mikroskop, um die Plaquenummer für jede Probe abzulesen. Notieren Sie die Anzahl der Plaques für jede Verdünnung.

Berechnen Sie dann den Mittelwert und die Standardabweichung. Vertiefungen, die zu viele oder zu wenige Plaques enthalten, können nicht zur genauen Berechnung des Titers verwendet werden. Verwenden Sie also für jede Probe eine Verdünnung, in der sich sieben bis 70 Plaques befinden.

Diese 1000-fach verdünnte Probe hat durchschnittlich 23 Plaques pro Well. Um den Virustiter in der unverdünnten Lösung zu berechnen, multiplizieren Sie den Verdünnungsfaktor mit der Anzahl der Plaques mit der Anzahl der Mikroliter in einem Milliliter. Teilen Sie dies dann durch das Volumen des verdünnten Überstands, das pro Vertiefung hinzugefügt wird.

In diesem Beispiel ergibt also 1000 mal 23 Plaques mal 1000 Mikroliter pro Milliliter geteilt durch 100 Mikroliter 2,3 mal 10 bis zur fünften bildenden Einheit pro Milliliter. Als nächstes wird eine virale Stammlösung mit einem bekannten Titer verwendet, um die Wachstumskinetik von gamma HV 68 in embryonalen Fibroblasten der Maus zu bestimmen. ORMs beginnen mit der Aufspaltung von Wildtyp-Mythen und solchen, die in einem Wirtsgen fehlen, in eine 24-Well-Platte mit 10.000 Zellen pro Well. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium in jeder Vertiefung durch 0,5 Milliliter einer Gamma-HV 68-Suspension mit niedrigem MOI-Gehalt.

Stellen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in den Inkubator und lassen Sie die Inkubation während der gesamten Inkubation zwei Stunden lang laufen. Schütteln Sie den Teller alle 30 Minuten nach der Inkubation. Entfernen Sie die Virussuspension mit einer Pipette und geben Sie 0,5 Milliliter frisches, vollständiges DM EM mit 8 % fötalem Rinderserum zu virusinfizierten Zellen.

Legen Sie die Zellen an verschiedenen Tagen nach der Infektion wieder in den Inkubator. Ernten Sie die Zellen mit mittlerem Ende, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren. Füllen Sie sie in sterile 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und frieren Sie die Röhrchen sofort bei minus 80 Grad Celsius ein, um gamma HV 68 aus den Mets freizusetzen.

Führen Sie drei Zyklen des Einfrierens und Auftauens durch. Tauen Sie die Zellen auf, indem Sie sie bei 37 Grad Celsius aufbringen. Dann vortexen und wieder in den minus 80 Grad Celsius Gefrierschrank legen.

Bestimmen Sie den Virustiter durch einen Plaque-Assay unter Verwendung einer NIH-, Drei-, T-, Drei- oder BHK 21-Monoschicht, wie zuvor gezeigt, um zu untersuchen, ob die DNA- oder RNA-Replikation durch einen Mangel an Wirtsgenen oder viralen Genen beeinflusst wird. Beginnen Sie mit infizierten Zellen an verschiedenen Tagen nach der Infektion, entsorgen Sie den Überstand, spülen Sie die Zellen mit kalten PBS- und Trypsin-Eiszellen. Pelletieren Sie dann die Zellen durch Zentrieren bei 1000 RCF bei Raumtemperatur für eine Minute nach dem Schleudern, entsorgen Sie den Überstand und lagern Sie die Zellen bei minus 80 Grad Celsius.

Extrahieren Sie die gesamte DNA und RNA, die aus dem Wirt und dem Virus stammt. Dann zentrifugieren Sie die Spin-Säulen. Führen Sie eine Echtzeit-PCR mit Gesamt-DNA und Primer durch, die spezifisch für virale lytische Transkripte sind.

Bestimmen Sie die relative Menge des intrazellulären gamma HV 68-Genoms in Bezug auf ein Wirts-Housekeeping-Gen wie Beta-Aktin. Bereiten Sie CDNA mit Gesamt-RNA und Oligo-DT-Primer vor. Führen Sie eine Echtzeit-PCR mit CD NA und Primern wie oben beschrieben durch, um die relative Menge der viralen Transkripte zu bestimmen.

In Bezug auf das Wirts-Housekeeping-Gen ist Mavs die Abkürzung für mitochondriale antivirale Signalwege, wie hier gezeigt. Das Mavs-Adaptermolekül leitet Signale von zytosolischen Rig-Auge-ähnlichen Rezeptoren weiter, um NF-Kappa, B- und Interferon-Regulationsfaktoren IRFs zu aktivieren, die wiederum die Genexpression von proinflammatorischen Zytokinen und Interferonen hochregulieren. Hier sind die Viruslasten in der Lunge von gamma-HV-infizierten Wildtyp-Mäusen und den Wurfgeschwistermäusen mit Mavs-Mangel dargestellt.

Ein Mangel an Mavs reduzierte die Viruslast in der Lunge 10 Tage nach der Infektion signifikant, was darauf hindeutet, dass Mavs für eine effiziente Virusinfektion in vivo erforderlich ist. Diese Abbildung zeigt eine mehrstufige Wachstumskurve von viralen Fibroblasten von Wildtyp-Mausen und solchen, die einen Mangel an Mavs-Mangel aufweisen, bei Mavs. Signifikant verzögertes Viruswachstum an embryonalen Fibroblasten der Maus, was darauf hindeutet, dass Mavs für eine effiziente virale Replikation erforderlich ist: In vitro wurden die mRNA-Spiegel viraler lytischer Gene in gamma HV 68-infizierten embryonalen Mausfibroblasten mittels Real-Time-PCR-Mangel in Mavs analysiert, was die mRNA-Spiegel von drei essentiellen lytischen Genen signifikant reduzierte.

Alle diese Ergebnisse stützen die Schlussfolgerung, dass Mavs für die Aktivierung der gamma HV 68-Transkription und die lytische Replikation erforderlich ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Interaktion zwischen Wirt und Erreger auf mehreren Ebenen abfragen können, sowohl in VO als auch in Vevo. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Krankheitserregern äußerst zögerlich sein kann.

Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen persönlicher Schutzausrüstung sollten während der Aufführungen getroffen werden.