Nachweis der Transkripte von Genom und einem Persistent DNA-Virus in einem neuronalen Gewebe Fluorescent In situ Hybridisierung Kombination mit Immunfärbung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das Genom des Herpes-simplex-Virus Typ 1 in Schnitten von Trigeminusganglien von latent infizierten Mäusen mittels fluoreszierender in-situ-Hybridisierung nachzuweisen. Dies wird erreicht, indem das Virus zunächst in die Tierlippe injiziert wird, gefolgt von einer 28-tägigen Inkubationsphase, in der sich das Virus in den Trigeminusganglien etabliert. Anschließend werden die Trigeminusganglien entnommen, eingebettet und kryosekzioniert.

Die Schnitte werden mehreren Vorbereitungsschritten unterzogen, einschließlich des entscheidenden Schritts, sie in einem Natriumcitrat-Puffer zu erhitzen. Abschließend wird die fluoreszenzmarkierte in-situ-Hybridisierung mit herpes-spezifischen fluoreszierenden Sonden durchgeführt. Letztendlich können die Ergebnisse die Lokalisation des viralen Genoms innerhalb des Kerns einzelner infizierter Neurone mittels konfokaler Mikroskopie aufzeigen.

In vielen Fällen erfordert die Untersuchung eines verschiedenen Lebenszyklus die Verwendung von Tiermodellen. Der Hauptvorteil der hier dargestellten Technik besteht darin, dass sie Daten auf Einzelzellniveau mithilfe eines institutsinternen Fluoreszenzanreicherungsansatzes bereitstellt. Das Royal-Killer-Modell von HS-Infektionen reproduziert die meisten Aspekte der natürlichen Geschichte der HSV-1-Infektion beim Menschen.

Das ist der natürliche Wirt des Virus. Die Primärinfektion erfolgt in den Mundgeweben, und anschließend breitet sich das Virus von den Lippen bis zu den beiden Ganglien aus. Dies ist der Hauptort der HS-V-Latenz bei Menschen. Kombinierte immunhistochemische Färbung.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Latenz des Herpesvirus zu beantworten, beispielsweise wie das Virus mit nukleären Komponenten interagiert und wie diese Wechselwirkungen die Aufrechterhaltung der Latenz und schließlich die Reaktivierung des Virus beeinflussen würden. Beginnen Sie damit, einen anästhesierten Maus und eine HSV-1-Virus-Stammlösung vorzubereiten, die in phenolfreiem Medium resuspendiert ist.

Unter Verwendung eines binokularen Stereomikroskops die Nadel in die subepitheliale Schicht der linken Oberlippe an der Schleimhauthaut-Grenze einführen. 0,5 µL Virenlösung über einen Zeitraum von fünf Sekunden injizieren und anschließend eine zweite Injektion des Virus an derselben Stelle vornehmen. Die Maus in einen 37 °C warmen Inkubator oder auf eine Heizplatte bringen, bis sie das Bewusstsein wiedererlangt.

Danach in den Heimkäfig setzen und die erforderliche Erholungszeit abwarten, bevor die Perfusionsfixierung gemäß dem Textprotokoll durchgeführt wird. Schnitt auf jeder Seite des Unterkiefers anlegen. Anschließend die Nasenspitze direkt hinter den Schneidezähnen abschneiden, um die Nasenhöhle freizulegen.

Schneiden Sie das Gaumendach mit einer Schere der Länge nach in zwei Hälften und legen Sie es beiseite. Die Ganglia des Nervus trigeminus befinden sich unterhalb des Gaumens. Es handelt sich um weiße, längliche Gebilde von zwei bis drei Millimetern Länge, die mit dem Nervus trigeminus verbunden sind.

Schneiden Sie die Äste des Nervus trigeminus auf jeder Seite des Ganglions ab, um sie vom Hirnstamm zu lösen. Entfernen Sie mithilfe einer chirurgischen Pinzette die Ganglien und überführen Sie sie in 20 % Saccharose in PBS; lassen Sie sie 24 Stunden lang inkubieren. Am nächsten Tag bei Raumtemperatur werden beide Ganglia trigemina in einen einzigen Block für die Kryoschnitteinbettung eingebettet.

Einbettungsmedium, den Block bei minus 80 Grad Celsius einfrieren, bis er an einem Kryostaten geschnitten wird. Die Ganglia trigemina längs in 10 µm dicke Schnitte schneiden und sie auf auf 30 Grad Celsius erwärmten Superfrost-Objektträgern auffangen. Auf einen Objektträger passen vier bis fünf Schnitte.

Die Vergabe mehrerer Serienbezeichnungen für den Objektträger kann nützlich sein. Wenn mehrere nachgeschaltete Anwendungen geplant sind, lassen Sie die Schnitte vor der Lagerung bei minus 80 Grad Celsius fünf bis 10 Minuten trocknen. Für dieses Protokoll wird die Sonde hergestellt, indem Cosmide, die 30 Kilobasen-Abschnitte des HSV-1-Genoms enthalten, mittels NIC-Translation mit SI 3D CTP markiert werden.

Es fällt aus und bleibt in deionisierter Formamid suspendiert und sollte am ersten Tag aufgrund der Einbindung von S SI drei rosa erscheinen. Legen Sie die Objektträger auf einen Objektträgerhalter bei Raumtemperatur und lassen Sie die Schnitte 10 Minuten lang trocknen. Anschließend hydratisieren Sie die Schnitte in 1× PBS für 10 Minuten erneut.

Als Nächstes wird das Gewebe 20 Minuten lang in 0,5 % Triton X-100 in 1× PBS permeabilisiert. Anschließend werden die Objektträger dreimal je 10 Minuten mit 2× SSC gewaschen und danach bis zur Erwärmung des Enmaskierungspuffers in 2× SSC aufbewahrt. Zum Enmaskieren wird der Citratpuffer in einer Mikrowelle vorgewärmt, bis der Puffer kocht.

Dies erfolgt, indem eine Objektträger-Schale mit 200 Millilitern des Puffers gefüllt wird. Stellen Sie die Schale in einen größeren Behälter, der mit 500 Millilitern destilliertem Wasser gefüllt ist, und erwärmen Sie den Puffer bis zum Sieden vor. Anschließend werden die Objektträger in die Schale überführt.

Überprüfen Sie, ob die Objektträger im Mikrowellenofen vollständig mit Puffer bedeckt sind. Erhitzen Sie die Objektträger im Puffer etwa 20 Sekunden lang, bis der Puffer siedet. Achten Sie darauf, dass der Puffer nicht überkocht.

Danach die Objektträger bei Raumtemperatur zwei Minuten lang abkühlen lassen und den Erhitzungszyklus noch sechsmal wiederholen. Es ist entscheidend, die Anzahl und Dauer der Erhitzungszyklen empirisch zu bestimmen, um die Reproduzierbarkeit des Enthüllungsschritts zu gewährleisten. Die Mikrowelle, das Tablett, der Behälter, das Puffervolumen im Tablett.

Das Volumen des Wassers im Behälter sollte nach Beendigung des Erhitzens unverändert bleiben. Überführen Sie die Objektträger für fünf Minuten in zwei XSSC unter einem Abzug, inkubieren Sie die Objektträger anschließend 15 Minuten in einer drei zu eins zu vier Lösung aus Methanol, Essigsäure und PBS. Danach inkubieren Sie die Objektträger 15 Minuten in einer frisch zubereiteten drei zu eins-Methanol-zu-Essigsäure-Mischung.

Dehydrieren Sie die Schnitte nun durch sukzessive 10-minütige Inkubationen in 70 % Ethanol, gefolgt von zwei 10-minütigen Inkubationen in reinem Ethanol. Lassen Sie die Objektträger 10 Minuten lang bei Raumtemperatur trocknen, um sie für die Sonde vorzubereiten. Geben Sie 80 Mikroliter der Sondierungslösung tropfenweise auf die getrockneten Schnitte und bedecken Sie diese mit einem Deckglas.

Überprüfen Sie, ob die Probelösung die gesamte Oberfläche der Deckglasplatte benetzt und ob keine Blasen vorhanden sind. Versiegeln Sie anschließend das Deckglas mit Kautschukkleber und lassen Sie es trocknen. Fahren Sie mit der Denaturierung fort, indem Sie die Objektträger fünf Minuten lang bei 80 Grad Celsius inkubieren.

Überführen Sie die Objektträger anschließend rasch auf ein metallisches Tablett auf Eis für fünf Minuten. Darauf folgt eine Übernacht-Hybridisierung bei 37 Grad Celsius am nächsten Tag. Entfernen Sie den Gummizement mit einer Pinzette, während die Objektträger auf einem Wärmeblock bei 37 Grad Celsius liegen.

Entfernen Sie die Deckglasabdeckung vorsichtig mit der Spitze einer Skalpellklinge. Waschen Sie die Schnitte anschließend wiederholt mit SSC. Färben Sie die Proben nun 10 Minuten lang mit dem geeigneten Farbstoff, beispielsweise DAPI oder Hoechst 33342, bei einer Konzentration von 0,5 Mikrogramm pro Milliliter in 1× PBS.

Waschen Sie die Objektträger anschließend dreimal mit jeweils 1 XPBS, wobei jeder Waschschritt 10 Minuten dauert. Nach dem dritten Waschgang entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich vom Objektträger. Geben Sie danach am Ende jedes Objektträgers 80 Mikroliter Eindeckmedium mit einem Anti-Fading-Agens auf.

Decken Sie das Medium langsam mit einem Deckglas von hoher optischer Qualität ab und vermeiden Sie die Bildung von Blasen. Versiegeln Sie die Probe anschließend mit Nagellack und lagern Sie sie im Dunkeln bei vier Grad Celsius. Bei der Entwicklung dieses Protokolls wurden mehrere Salzpuffer zum Enthüllen getestet.

Während EDTA-Puffer dazu neigten, das Gewebe zu schädigen, eigneten sich Natriumcitrat-Tris, HCL und destilliertes Wasser zur Detektion von HSV Typ 1, um zu überprüfen, ob das Protokoll mit kommerziellen Sonden funktioniert. Die Detektion des latenten HSV-Typ-1-Genoms wurde mit einer biotinylierten PAN-HSV-Typ-1-Sonde von Enzobiochem durchgeführt, wobei sowohl einzelne als auch mehrfache Fleckenmuster für das HSV-Typ-1-Genom nachgewiesen werden konnten.

Außerdem wurde das DNA-FISH-Protokoll an Mäusen und Kaninchen getestet, die mit drei gängigen Stämmen von HSV-1 infiziert waren. In allen Fällen zeigten die HSV-1-Genome ein fleckiges Signal mit variabler Helligkeit und Intensität. Zusätzlich wurde die Anwendbarkeit des Protokolls im Replikationszyklus von HSV-1 überprüft, indem DNA-FISH an Gewebeproben von Mäusen durchgeführt wurde, die eine allgemeine Herpesinfektion durchliefen.

Bei diesen Tieren wurden große und helle Aggregate von HSV-1-Genomen in verschiedenen Geweben nachgewiesen, einschließlich der DRG, Augen und des Gehirns. Das DNA-FISH-Protokoll ist sehr vielseitig einsetzbar. Es ermöglicht die gleichzeitige Detektion des HSV-1-Genoms sowie viraler oder zellulärer RNAs und Proteine.

Zum Beispiel ist die gleichzeitige Nachweisung des HSV-1-Genoms zusammen mit der HSV-1-Lat-RNA möglich. Die kombinierte Detektion des HSV-1-Genoms mit zellulären Proteinen wie dem zentromerischen Protein CENP-A wurde genutzt, um die Assoziation von HSV-1 mit Chromatin und PML-Kernkörperchen nachzuweisen. Das assoziierte Protein A TRX wurde mittels einer Dreifachfärbung sichtbar gemacht, wobei HSV-1-DNA rot, das RNA-Produkt Lat blau und A TRX grün dargestellt wurde.

Einmal eingerichtet, ist die DNA-FISH-Prozedur sehr robust. Sie kann in weniger als 24 Stunden in Chargen von 20 oder mehr Objektträgern durchgeführt werden. Die Entwicklung dieser Technik wird es Forschern, die Herpesviren und andere persistente Viren untersuchen, ermöglichen, auf Einzelzell-Ebene zu erforschen, wie zelluläre Komponenten und die nukleäre Architektur die Biologie dieser Viren beeinflussen könnten.