Nachweis der Transkripte von Genom und einem Persistent DNA-Virus in einem neuronalen Gewebe Fluorescent In situ Hybridisierung Kombination mit Immunfärbung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das Genom des Herpes-simplex-Virus, Typ eins, in Abschnitten von Trigeminusganglien von latent infizierten Mäusen durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung nachzuweisen. Dies wird erreicht, indem das Virus zuerst in der Lippe des Tieres geimpft wird, gefolgt von einer 28-tägigen Inkubationszeit, in der sich das Virus in den Trigeminusganglien festsetzt. Als nächstes werden die Trigeminusganglien entnommen, eingebettet und kryogeschnitten.

Die Schnitte werden mehreren vorbereitenden Behandlungen unterzogen, einschließlich des Schlüsselschritts des Erhitzens in einem Natriumcitratpuffer. Schließlich wird die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung unter Verwendung von Herpes-spezifischen fluoreszierenden Roben durchgeführt. Letztendlich können die Ergebnisse die Positionierung des viralen Genoms im Zellkern von individuell infizierten Neuronen mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie zeigen.

In vielen Fällen erfordert die Untersuchung eines verschiedenen Lebenszyklus die Verwendung von Tiermodellen. Der Hauptvorteil der hier dargestellten Technik besteht darin, dass sie Daten auf Einzelzellebene unter Verwendung eines institutsüblichen Fluent-ization-Ansatzes liefert. Das königliche Killermodell der HS-Infektionen reproduziert die meisten Aspekte des natürlichen Verlaufs der HSV-1-Infektion beim Menschen.

Das ist der natürliche Wirt des Virus. Die Primärinfektion findet im Mundgewebe statt, und dann schreitet das Virus von den Lippen zu den beiden Al-Ganglien fort. Das ist die Hauptseite der HS V-Latenz beim Menschen Kombiniert zwei Immun und Färbung.

Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen zur Latenz des Herpesvirus zu beantworten, z. B. wie das Virus mit nuklearen Komponenten interagiert und wie diese Wechselwirkungen die Aufrechterhaltung der Latenz und schließlich die Reaktivierung des Virus beeinflussen würden. Nehmen Sie zu Beginn eine betäubte Maus und eine HSV-Ein-Virus-Stammlösung. Resuspendiert in phenolrotfreiem Medium.

Führen Sie die Nadel mit einem binokularen Stereoskop in die subepitheliale Schicht der linken Oberlippe am mukokutanen Rand ein. Injizieren Sie 0,5 Mikroliter Viruslösung über einen Zeitraum von fünf Sekunden und führen Sie dann eine zweite Injektion des Virus an derselben Stelle durch. Bringen Sie die Maus in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator oder ein Heizkissen, bis sie erwacht.

Setzen Sie es dann für die erforderliche Erholungszeit in seinen Heimatkäfig, bevor Sie es gemäß dem Textprotokoll reparieren. Schneiden Sie auf jeder Seite des Unterkiefers. Schneiden Sie dann die Nasenspitze direkt hinter den Schneidezähnen ab, um die Nasenhöhle freizulegen.

Schneiden Sie den Gaumen mit einer Schere in zwei Hälften und legen Sie ihn dann zur Seite. Die Trigeminusganglien befinden sich unter dem Gaumen. Es handelt sich um weiße, längliche Massen, die zwei bis drei Millimeter lang sind und mit dem Nervus trigeminus verbunden sind.

Schneiden Sie die Äste des Trigeminusnervs auf jeder Seite der Ganglien ab, um sie aus dem Hirnstamm zu lösen. Entfernen Sie mit einer chirurgischen Zange die Ganglien und übertragen Sie sie auf 20% Saccharose in PBS, damit sie 24 Stunden lang inkubieren können. Am nächsten Tag bei Raumtemperatur beide Trigeminusganglien in einen einzigen Kryosektionsblock einbetten.

Einbetten des Mediums, frieren Sie den Block bei minus 80 Grad Celsius ein, bis er auf einem Kryostaten geschnitten wird. Schneiden Sie die Trigeminusganglien der Länge nach in 10-Mikrometer-Abschnitte und sammeln Sie sie auf Superfrost-Objektträgern, die auf 30 Grad Celsius erwärmt werden. Vier bis fünf Abschnitte passen auf eine einzige Folie.

Es kann nützlich sein, der Folie mehrere Reihenbeschriftungen zuzuweisen. Sind mehrere Downstream-Anwendungen geplant, lassen Sie die Scheiben fünf bis 10 Minuten trocknen, bevor Sie sie bei minus 80 Grad Celsius lagern. Für dieses Protokoll wird die Sonde präpariert, indem Kosmen, die 30 Kilobasenteile des HSV-1-Genoms enthalten, mit SI 3D CTP durch NIC-Translation markiert werden.

Es wird in deionisierter Form Amid ausgefällt und suspendiert und sollte aufgrund des Einbaus von S SI drei am ersten Tag rosa erscheinen. Legen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur auf einen Objektträgerhalter und lassen Sie die Abschnitte 10 Minuten trocknen. Anschließend rehydrieren Sie die Abschnitte in einem XPBS für 10 Minuten.

Als nächstes permieren Sie das Gewebe in 0,5 % Triton X 100 in einem XPBS für 20 Minuten. Waschen Sie die Objektträger dann dreimal für 10 Minuten pro Waschgang mit zwei XSS und bewahren Sie sie in zwei XSSC auf, bis der Demaskierungspuffer erhitzt ist. Zum Demaskieren den Citratpuffer in der Mikrowelle vorheizen, bis der Puffer kocht.

Dies geschieht durch das Befüllen einer Glasschiebeschale mit 200 Millilitern des Puffers. Stellen Sie das Tablett in einen größeren Behälter, der mit 500 Millilitern destilliertem Wasser gefüllt ist, und heizen Sie den Puffer bis zum Kochen vor. Übertragen Sie dann die Dias in das Fach.

Vergewissern Sie sich, dass sie vollständig mit Puffer in der Mikrowelle bedeckt sind. Erhitzen Sie die Objektträger im Puffer etwa 20 Sekunden lang, bis der Puffer zum Sieden kommt. Lassen Sie den Puffer nicht überkochen.

Kühlen Sie dann die Objektträger zwei Minuten lang bei Raumtemperatur ab und wiederholen Sie den Heizzyklus noch sechs weitere Male. Es ist entscheidend, die Anzahl und Dauer der Esszyklen empirisch zu bestimmen, um die Reproduzierbarkeit des Entlarvungsschritts zu gewährleisten. Die Mikrowelle, das Tablett, der Behälter, das Volumen des Puffers im Tablett.

Das Wasservolumen im Behälter sollte gleich gehalten werden, wenn die Heizung beendet ist. Übertragen Sie die Objektträger in zwei XSSC für fünf Minuten unter einen Abzug, inkubieren Sie die Objektträger 15 Minuten lang in einer drei bis vier Lösungen aus Methanol, Essigsäure und PBS. Dann inkubieren Sie die Objektträger 15 Minuten lang in einer frisch zubereiteten Mischung aus drei zu eins Methanol und Essigsäure.

Dehydrieren Sie nun die Schnitte durch aufeinanderfolgende 10-minütige Inkubationen in 70%igem Ethanol, gefolgt von zwei 10-minütigen Inkubationen in reinem Ethanol. Lassen Sie die Objektträger 10 Minuten bei Raumtemperatur trocknen, um sie für die Sonde vorzubereiten. Geben Sie 80 Mikroliter Sondierungslösung tropfenweise auf die getrockneten Abschnitte und decken Sie sie mit einem Deckglas ab.

Prüfen Sie, ob sich die Sondierungslösung über die gesamte Oberfläche des Deckglases verteilt und keine Blasen vorhanden sind. Versiegeln Sie dann den Deckglas mit Gummikleber und lassen Sie ihn trocknen. Fahren Sie mit der Denaturierung fort, indem Sie die Objektträger fünf Minuten lang bei 80 Grad Celsius inkubieren.

Übertragen Sie die Objektträger dann schnell für fünf Minuten auf ein Metalltablett auf Eis. Darauf folgt eine Hybridisierung über Nacht bei 37 Grad Celsius am nächsten Tag. Entfernen Sie den Gummizement mit einer Pinzette, wobei die Objektträger auf einem 37 Grad Celsius heißen Block liegen.

Entfernen Sie den Deckglas vorsichtig mit der Spitze einer Skalpellklinge. Waschen Sie anschließend die Abschnitte wiederholt mit SSC. Färben Sie nun die Proben 10 Minuten lang mit dem entsprechenden Farbstoff wie DAPI oder Haken 3 3 3 4 2 bei 0,5 Mikrogramm pro Milliliter in einem XPBS.

Waschen Sie die Objektträger dann dreimal mit einem XPBS für 10 Minuten pro Waschgang. Lassen Sie nach der dritten Wäsche so viel Flüssigkeit wie möglich von der Schiene ab. Tragen Sie dann am Ende jedes Objektträgers 80 Mikroliter Einbettmittel mit einem Antifading-Mittel auf.

Decken Sie das Medium langsam mit einem Deckglas von hoher optischer Qualität ab und vermeiden Sie dabei Blasenbildung. Anschließend versiegeln Sie die Folie mit Nagellack und lagern Sie sie im Dunkeln bei vier Grad Celsius. Bei der Entwicklung dieses Protokolls wurden mehrere Salzpuffer auf Demaskierung getestet.

Während EDTA-Puffer dazu neigten, das Gewebe zu schädigen. Natriumcitrat Tris, HCL und destilliertes Wasser waren für den HSV-Eins-Nachweis geeignet, um zu überprüfen, ob das Protokoll mit kommerziellen Sonden funktioniert. Der Nachweis des latenten HSV-Genoms wurde mit einer biotinylierten Sonde PAN HSV one von Enzo Biochem durchgeführt, wobei sowohl Einzel- als auch Mehrpunktmuster für HSV-1-Genom nachgewiesen werden konnten.

Darüber hinaus wurde das DNA-Fischprotokoll an Mäusen und Kaninchen getestet, die mit drei häufig verwendeten HSV-1-Stämmen infiziert waren. In allen Fällen zeigten die HSV-1-Genome ein fleckiges Signal mit variabler Helligkeit und Intensität. Darüber hinaus wurde die Anwendbarkeit des Protokolls im replikativen Zyklus von HSV one getestet, indem DNA-Fische an Geweben von Mäusen durchgeführt wurden, die sich einer allgemeinen Herpesinfektion unterzogen hatten.

Bei diesen Tieren wurden große und helle Aggregate von HSV-1-Genomen in verschiedenen Geweben nachgewiesen, einschließlich der DRG-Augen und des Gehirns. Das DNA-Fischprotokoll ist sehr vielseitig. Es ermöglicht die gemeinsame Detektion von HSV, einem Genom und viralen oder zellulären RNAs und Proteinen.

Zum Beispiel ist die Co-Detektion des HSV-1-Genoms zusammen mit der HSV-One-Lat-RNA möglich. Die Co-Detektion des HSV-One-Genoms mit zellulären Proteinen, wie dem Centro-MERIC-Protein CE, NPA, A wurde zur Co-Detektion von HSV One mit den Chromatin- und PML-Kernkörpern verwendet. Das assoziierte Protein A TRX wurde mit einer Dreifachfärbung visualisiert, die HSV 1D NA in Rot zeigte. Sein RNA-Produkt lat in blau und ein TRX in grün.

Sobald die Demaskierung eingerichtet ist, ist das DNA-Fischverfahren sehr robust. Es kann in weniger als 24 Stunden in Chargen von 20 Folien oder mehr durchgeführt werden. Die Entwicklung dieser Technik wird es Forschern, die Herpesviren und andere persistente Viren untersuchen, ermöglichen, auf Einzelzellebene zu untersuchen, wie zelluläre Komponenten und die Kernarchitektur die Biologie dieser Viren beeinflussen könnten.