Name: Nachweis der Transkripte von Genom und einem Persistent DNA-Virus in einem neuronalen Gewebe Fluorescent In situ Hybridisierung Kombination mit Immunfärbung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-23T14:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: Lernen Sie die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung zur Detektion des Herpes-simplex-Virus-Genoms in Neuronen der Trigeminusganglien von Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung viraler DNA und RNA auf Einzelzellebene.

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Wir danken N. Sawtell (Cincinnati Children s Hospital Medical Center, Cincinnati, Ohio, USA), S. Efstathiou (University of Cambridge, Großbritannien) und James Hill (LSU Health Sciences Center, New Orleans, USA) für die Bereitstellung von Proben von HSV-1 -infizierten Mäusen und Kaninchen sind, und für Reagenzien, H. Masumoto (Kazusa DNA Research Institute, Chiba, Japan) und S. Khochbin (Institut Albert Bonniot, Grenoble, Frankreich) für hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) (ATIP Programm, PL, http://www.cnrs.fr), der Französisch Nationale Forschungsagentur (ANR) (ANR-05-MIIM finanzierten 008-01, CENTROLAT, <a href="http://www.agencenationale-recherche.fr">http://www.agencenationale-recherche.fr</a> ), der FINOVI Foundation ( <a href="http://www.finovi.org/:fr:start">http://www.finovi.org/:fr:start</a> ), der LABEX DEVweCAN (ANR-10-61-LABX ) der Université de Lyon, im Rahmen des Programms &quot;Investissements d&#39;Avenir &quot;(ANR-11-IDEX-0007) von der ANR betrieben ( <a href="http://www.agence-nationale-recherche.fr">http://www.agence-nationale-recherche.fr</a> ), L&#39;Association pour la Recherche contre le Cancer (ARC-7979 und ARC- 4910, <a href="http://www.arc-cancer.net">http://www.arc-cancer.net</a> ), la Ligue Nationale Contre le Cancer (LNCC, <a href="http://www.ligue-cancer.net">http://www.ligue-cancer.net</a> ) und Inca (EPIPRO Programm <a href="http://www.e-cancer.fr">http://www.e -cancer.fr</a> ). FC und PL sind CNRS-Forscher.

Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht den Nachweis von HSV-1-Genom latent in Neuronen des neuronalen Mausgewebeschnitten. Unser Verständnis der Wege Regel virale Genexpression wurde durch den Mangel an Verfahren zu HSV-1-Genom-DNA in situ in neuronalen Geweben erkennen beschränkt. Informationen über Genom-Kopienzahl und der Anteil der infizierten Nervenzellen kamen vor allem aus PCR-Analyse auf dissoziiert Neuronen 11,12. Bei der Aufklärung der Rolle der Wirtszellkernarchitektur auf HSV-1-Latenz...

<html> Herpes-simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) ist eine persistente menschlichen neurotropen Viren, eine langfristige latente Infektion in den Neuronen des trigeminalen Ganglien (TG) des peripheren Nervensystems, von dem es periodisch reaktiviert zu replizieren und zu verbreiten. Die HSV-1-Genom ist ein 150 kb dsDNA Lokalisierungs im Zellkern der Wirts Neuron, wo es bleibt, wie Mehrfach chromatinized Plasmide, die nicht in das Wirtszellgenom integrieren 1,2 haben. Während der Wartezeit wird der HSV-1-Replikationszyklus genetische Programm stark unterdrückt, und die Genexpression der Latenz-assoziierten Transkript (LAT) Ort, aus der Latenz Einrichtung Beginn der Reaktivierung 3 beschränkt. LAT erzeugt einen langen nicht-kodierenden RNA 8,5 kb zu einem großen 2 kb Lasso stabil verarbeitet und mehrere miRNA 4-7. HSV-1-Latenz wird somit durch die Anwesenheit der viralen genomischen DNA-, RNA-LAT, und das Fehlen von nachweisbaren Replikationszyklus Proteine ​​gekennzeichnet. NHALT &quot;&gt; Tiermodelle, vor allem Maus und Kaninchen, sind experimentelle Modelle rekapituliert einige Features der Latenz in der menschlichen. Eines der Hauptinteressen dieser Modelle ist, dass sie das Studium physiologische Aspekte der HSV-1-Latenz bei immunkompetenten Wirten. In den vergangenen Jahrzehnten Viele experimentelle Werkzeuge, wie beispielsweise gentechnisch veränderte Viren und Mäusen, wurden entwickelt, um die Physiologie, Genetik und Zellbiologie der HSV-1-Latenz, aus tierischem Gewebe zu untersuchen. Bisher wurde viraler genomischer DNA nachgewiesen und durch Southern-Blot quantifiziert und qPCR von TGs dissoziiert. gibt es jedoch noch kein Verfahren zur Verfügung, um HSV-1-Genoms von Gewebeschnitten auf 8. Folglich Latenz wird routinemäßig bei der histologischen Schnitte durch den Nachweis von LAT-RNA durch RNA-in situ-Hybridisierung nicht bewertet erkennen in-situ-Hybridisierung Virusgenom-Nachweis. Da es nicht möglich war, infizierten Zellen zu charakterisieren, basierend auf der Anwesenheit von viralen Genomen, this technische Beschränkung hat einen großen Nachteil für die Analyse von vielen Aspekten der Wirt-Virus-Wechselwirkungen, wie die Beziehung zwischen dem viralen Genom und zelluläre und virale Genexpression oder den Host-Zell-vermittelten Immunantwort 9,10. Am wichtigsten ist, bleibt die Zelle-zu-Zelle Heterogenität der latenten Infektion relativ unerforscht und gezeigt wurde, ein Schlüsselmerkmal der Latenz in Mäusen und in menschlichen sensorischen Ganglienneuronen in SCID-Mäuse implantiert 11-17 sein. Typischerweise wurde durch qPCR gezeigt, dass die HSV-1-Genom Kopienzahl pro Zelle variiert von 5 bis mehrere hundert. Obwohl LAT wird als Schlüsselregulator der Latenz und Reaktivierung qPCR Daten an isolierten Neuronen und in-situ-PCR zeigte, dass nur eine Teilmenge von latent infizierten Neuronen, so niedrig wie 30%, drückt die LAT-Locus 11,12,18-21. Wie die Wirtszelle und die zelluläre Umgebung innerhalb des Gewebes Auswirkung auf die Virus-Latenz Einrichtung undvirale Genexpression, bleibt unklar. Hier beschreiben wir eine stabile Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)-Verfahren für die effiziente Detektion von niedriger Kopien HSV-1-Genom-DNA in tierischen neuronalen Gewebeschnitten. Diese Methode wurde von uns entworfen und für den Zugriff auf hochauflösende Mikroskopie, die notwendig ist, um die Interaktion des viralen Genoms mit den Wirtszell intra-Kernkomponenten 22 studieren zu bekommen. Zusätzlich beschreiben wir eine Mehrfachfärbung Verfahren zum gleichzeitigen Nachweis der viralen DNA mit RNA und Proteinen, die ein einzigartiges Werkzeug, um die Virus-Wirt-Wechselwirkungen, die virale Genexpression regulieren beschreiben. Das Verfahren kann auch für eine Vielzahl von Analysen den Nachweis von HSV-1-Genom latent, wie die Quantifizierung infizierten Neuronen in zahlreiche Abschnitte erforderlich angewendet werden. Ein wichtiger Schritt ist, um Antigen-Retrieval-Behandlung gelten die virale DNA-Hybridisierung zugänglich zu machen. Somit könnte das Protokoll auch effizient auf die Detektion seinandere dsDNA-Viren, die derzeit von herkömmlichen DNA-FISH Ansätze in tierischen Geweben nachweisbar sind es nicht.

<table><tbody><tr><td>Balb/c Mäuse</td><td>Janvier, Frankreich</td><td></td><td>6 Wochen alte Weibchen</td></tr><tr><td>HSV-1 Stämme</td><td>SC16 Stamm (Wildtyp)</td><td></td><td>Siehe Labetoule, M. et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci 44, 217&ndash; 225 (2003) für Einzelheiten zur Vorbereitung des HSV-1-Stammes und des Virusstammes.</td></tr><tr><td>Ketaminhydrochlorid</td><td>Sigma</td><td>K2753</td><td>Intraperitoneale Injektion einer Lösung, die Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg)</td></tr> <tr><td>enthältXylazinhydrochlorid</td><td>Sigma</td><td>X1251</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>4 g PFA in 90 ml Wasser suspendieren. Addieren Sie 50 &micro; l von 1N NaOH und Hitze bei 60 μg; C in einem Wasserbad mit Rührung. PFA löst sich in ca. 30 min. Fügen Sie 10 ml 10x PBS hinzu. Diese Lösung kann im Voraus zubereitet und bei -20 Grad gelagert werden; C in 5 ml Tuben. Vorsicht. Manipulieren Sie unter einem Abzug.</td></tr><tr><td>Physiologische Kochsalzlösung</td><td>Sigma</td><td>07982-100TAB-F</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS, pH 7,4 (steril)</td><td>Life Technologies</td><td>10010-015</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>84100</td><td>Bereiten Sie eine 20%ige Saccharoselösung in 1x PBS vor.</td></tr><tr><td>Einbettungsmedium für Kryosektionen - Tissue-Tek OCT Compound</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DNA-Aufreinigungskit für große Vektoren</td><td>Qiagen</td><td>12462</td><td>Zur Aufreinigung von Cosmid- oder BAC-Vektoren, die das HSV-1-Genom enthalten, und Lagerung bei -20 μg; C</td></tr><tr><td>Nick Übersetzungskit</td><td>Roche Applied Sciences</td><td>10 976 776 001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cy3-dCTP</td><td>GE Healthcare PA53021</td><td></td><td>Schutz vor Licht</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>G50 Mini-Spin-Säule</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5330-01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Lachssperma DNA 10 mg/ml</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>15632-011</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ethanol Molekularbiologie</td><td>Sigma</td><td>87047</td><td>Bereiten Sie eine 70%ige Lösung</td></tr> für <tr><td>Lachsspermien vor DNA</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>15632-011</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Formamid Molekularbiologie Klasse</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td>Vorsicht. Unter Abzug manipulieren.</td></tr><tr><td>HSV-1 biotinylierte kommerzielle Sonde</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ENZ-40838</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ImmEdge hydrophober Stift</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>20x Kochsalzlösung Natriumcitrat (SSC)</td><td>Sigma</td><td>S6639</td><td>Bereiten Sie eine 2x SSC-Lösung in ddH20 vor.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Bereiten Sie eine 10%ige Stammlösung in Wasser vor und lagern Sie sie bei +4 °C. Bereiten Sie die 0,5%ige Lösung unmittelbar vor Gebrauch in 1x PBS vor.</td></tr><tr><td>10 mM Natriumcitrat pH 6,0</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td>Bereiten Sie eine 100 mM Stammlösung (10x) vor. 10,5 g Zitronensäure (MW 210.14) einwiegen. Vorsicht, reizend und giftig, geeignete Maske und Handschuhe tragen) und in 400 ml Wasser auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,0 mit 1 N NaOH ein (Vorsicht, reizend, Handschuhe tragen). Mit destilliertem Wasser auf 500 ml einstellen. Vor Gebrauch 10x in destilliertem Wasser verdünnen.</td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma</td><td>320099</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Methanol, Molekularbiologie</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dextransulfat - MW 500.000</td><td>Euromedex</td><td>EU0606-A</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Denhardt-Lösung (100x)</td><td>Euromedex</td><td>1020-A</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Gummizement "FixoGum"</td><td>Marabut</td><td>290110000&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>DNA-Aufreinigungskit&nbsp; - Qiaquick PCR-Aufreinigungskit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Transkriptionskit T7 in vitro</td><td>Ambion Life Technologies</td><td>AM1314</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Biotin-16-UTP</td><td>Roche Applied Sciences</td><td>11388908910</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Minisäule für RNA-Aufreinigung</td><td>Qiagen</td><td>73404</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ribonukleosid-Vanadyl-Komplex</td><td>New England Biolabs</td><td>S1402S</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma</td><td>H3410</td><td>Bereiten Sie eine 3%ige Lösung in destilliertem Wasser vor. Bei +4 Grad lagern; C und vor Licht schützen.</td></tr><tr><td>Hefe tRNA</td><td>Invitrogen</td><td>15401011</td><td>Herstellung einer 10 mg/ml Lösung in RNAse freiem Wasser</td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Invitrogen</td><td>PCN5000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Primärantikörper</td><td>beliebiger Lieferant</td><td></td><td>Die folgenden Primärantikörper wurden im Ergebnisteil verwendet: Anti-Maus-CENP-A (Kaninchen-mAb C51A7, Cell Signaling Technologies) und Anti-ATRX H-300 (Santa Cruz Biotechnology)</td></tr><tr><td>Sekundäre fluoreszierende Antikörper</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td></td><td>Die fluoreszierenden Sekundärantikörper, die routinemäßig in unserem Protokoll verwendet werden, sind Alexa Fluor-markierte Ziegenantikörper (IgG H+L). Bei dem im Ergebnisteil verwendeten Antikörper handelt es sich um einen Anti-Kaninchen-Ziegen-Antikörper, der mit Alexa Fluor 488 (Referenz A11001)</td></tr><tr><td>Tyramide Signal Amplification (TSA) Kit - Streptavidin + Alexa Fluor 350 (blaue Fluoreszenz)</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>#T20937</td><td>TSA-Kits sind auch erhältlich von Perkin Elmer</td></tr><tr><td>Tyramide Signal Amplification (TSA) Kit - Streptavidin + Alexa Fluor 488 (grüne Fluoreszenz)</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>#T20932</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>H3570</td><td>Bereiten Sie ein 0,5 & Mikro zu; g/ml Lösung in 1x PBS unmittelbar vor der Anwendung. Verwerfen Sie die restliche Lösung.</td></tr><tr><td>22 mm x 50 mm Deckglas. n&deg; 1,5 Glas</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaften</td><td>72204-04</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Eindeckmedium mit Antifading-Mittel - VECASHIELD</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>Ein weiteres konventionelles Produkt ist Fluoromount G von Electron Microscopy Science</td></tr><tr><td>Superfrost Objektträger</td><td>FisherScientific</td><td>12-550-15</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ausrüstung/Material</td><td>Firma</td><td>Referenz</td><td></td></tr><tr><td>Hinweis Nadel für Infektionen</td><td></td><td></td><td>Mikropipette aus Glas, heißgezogen. Sonderanfertigung.</td></tr><tr><td>Seziergeräte</td><td>Moria, Frankreich</td><td></td><td>Mikrochirurgische Scheren und Pinzetten</td></tr><tr><td>Schlauchpumpe</td><td>Cole Palmer Instruments</td><td></td><td>Easyload Masterflex</td></tr><tr><td>Mikrospritzen-Pumpengerät (Nano-Pumpe)</td><td>kdScientific</td><td>KDS310</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kryostat</td><td>Leica Frankreich</td><td>CM 1510-1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>-80 Grad C Gefrierschrank</td><td>Sanyo</td><td></td><td>Ultra Low -80 &Grad; C</td></tr><tr>Mikrowelle <td></td><td></td><td>für den Hausgebrauch</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Trockenblockheizung</td><td>Eppendorf</td><td>022670204</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Inkubator Slide moat</td><td>Boekel Scientific</td><td>240000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Coplin Dose</td><td>Dominique Dutscher</td><td>68512</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Behälter für Malerglas</td><td>Dominique Dutscher</td><td>68506</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Die im Ergebnisteil gezeigten Bilder wurden mit einem Zeiss AxioObserver mit Objektiv 40X LD NeoFluor N.A 0.6 und 100X PlanApochromat N.A 1.3 aufgenommen. Filterset #38, #43 und #43. HXP 120 Fluoreszenz-Lichtquelle. Photometrie CoolSNAP HQ2 CCD-Kamera. Das Signal kann mit einem neueren hocheffizienten Mikroskop wie der Zeiss AxioImager/AxioObserver-Serie, der Nikon Ti-E/Ni-E-Serie oder der Leica DM/DMI6000-Serie leichter beobachtet werden</td></tr></tbody></table>

nachweis der transkripte von genom und einem persistent dna-virus in einem neuronalen gewebe fluorescent in situ hybridisierung kombination mit immunfärbung

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Einzelzell codetection eines Gens ist seine RNA-Produkt und zellulären Regulatorproteinen kritisch Genregulation zu studieren. Dies ist eine Herausforderung auf dem Gebiet der Virologie, insbesondere für die Kern replizierende DNA-Viren, die anhaltende Tiermodellen für ihre Studie einzubeziehen. Herpes-simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) wurde eine lebenslange latente Infektion in peripheren Neuronen. Latenten Virus dient als Reservoir, aus dem es reaktiviert und induziert eine neue Herpes-Episode. Die Zellbiologie der HSV-1-Latenz vor schlecht verstanden, teilweise aufgrund des Fehlens von Methoden zur HSV-1-Genoms in situ in Tiermodellen zu erkennen. Wir beschreiben eine DNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)-Ansatz effizient Erfassung geringer Kopien viralen Genomen innerhalb der Abschnitte der neuronalen Gewebe von infizierten Tiermodellen. Die Methode beruht auf Wärmebasis Antigen Demaskierung und direkt markiert hausgemachten DNA-Sonden, oder im Handel erhältliche Sonden. Wir haben eine Dreifach staining Ansatz, der DNA-FISH mit RNA-FISH und Immunfluoreszenz, mit Peroxidase-basierte Signalverstärkung, um jede Anforderung zu erfüllen Färbung. Eine wesentliche Verbesserung ist die Möglichkeit, innerhalb von 10 um Gewebeschnitte, Low-Hintergrundsignale, die bei hoher Auflösung durch konfokale Mikroskopie und konventionellen Weitfeld-Epifluoreszenz abgebildet werden kann, zu erhalten. Zusätzlich war die Dreifachfärbung mit einer Vielzahl von Antikörpern gegen zelluläre und virale Proteine ​​gerichtet. Das komplette Protokoll dauert 2,5 Tage, um Antikörper und Penetration der Sonde im Gewebe unterzubringen.

Nach mehreren Monaten umfangreicher Tests, entdeckten wir, dass die Wärme-basierte chemische Demaskierung in-situ-Hybridisierung gemacht latente HSV-1-Genom vorhanden für Leuchtstofflampen. Während des Prozesses haben wir versucht, verschiedene Demaskierung Verfahren und nur Wärme-basierte Behandlungen (dh Erhitzen der Schnitte bis Unter Siedetemperatur in einem Mikrowellenherd) erschien effizient. Wir haben dann testete mehrere Salzpuffern, die routinemäßig in der Immunhistochemie (IHC) und Elektronen...

Wir haben eine Fluoreszenz-in situ-Hybridisierungsprotokoll für den Nachweis eines persistenten DNA-Virus-Genom in Gewebeschnitten von Tiermodellen. Dieses Protokoll ermöglicht das Studium Infektionsprozess von codetection des viralen Genoms, dessen RNA-Produkte, und viralen oder zellulären Proteinen in einzelnen Zellen.

Nachweis der Transkripte von Genom und einem Persistent DNA-Virus in einem neuronalen Gewebe Fluorescent In situ Hybridisierung Kombination mit Immunfärbung

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das Genom des Herpes-simplex-Virus Typ 1 in Schnitten von Trigeminusganglien von latent infizierten Mäusen mittels fluoreszierender in-situ-Hybridisierung nachzuweisen. Dies wird erreicht, indem das Virus zunächst in die Tierlippe injiziert wird, gefolgt von einer 28-tägigen Inkubationsphase, in der sich das Virus in den Trigeminusganglien etabliert. Anschließend werden die Trigeminusganglien entnommen, eingebettet und kryosekzioniert.Die Schnitte werden mehreren Vorbereitungsschritten unterzogen, einschließlich des entscheidenden Schritts, sie in einem Natriumcitrat-Puffer zu erhitzen. Abschließend wird die fluoreszenzmarkierte in-situ-Hybridisierung mit herpes-spezifischen fluoreszierenden Sonden durchgeführt. Letztendlich können die Ergebnisse die Lokalisation des viralen Genoms innerhalb des Kerns einzelner infizierter Neurone mittels konfokaler Mikroskopie aufzeigen.In vielen Fällen erfordert die Untersuchung eines verschiedenen Lebenszyklus die Verwendung von Tiermodellen. Der Hauptvorteil der hier dargestellten Technik besteht darin, dass sie Daten auf Einzelzellniveau mithilfe eines institutsinternen Fluoreszenzanreicherungsansatzes bereitstellt. Das Royal-Killer-Modell von HS-Infektionen reproduziert die meisten Aspekte der natürlichen Geschichte der HSV-1-Infektion beim Menschen.Das ist der natürliche Wirt des Virus. Die Primärinfektion erfolgt in den Mundgeweben, und anschließend breitet sich das Virus von den Lippen bis zu den beiden Ganglien aus. Dies ist der Hauptort der HS-V-Latenz bei Menschen. Kombinierte immunhistochemische Färbung.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Latenz des Herpesvirus zu beantworten, beispielsweise wie das Virus mit nukleären Komponenten interagiert und wie diese Wechselwirkungen die Aufrechterhaltung der Latenz und schließlich die Reaktivierung des Virus beeinflussen würden. Beginnen Sie damit, einen anästhesierten Maus und eine HSV-1-Virus-Stammlösung vorzubereiten, die in phenolfreiem Medium resuspendiert ist.Unter Verwendung eines binokularen Stereomikroskops die Nadel in die subepitheliale Schicht der linken Oberlippe an der Schleimhauthaut-Grenze einführen. 0,5 µL Virenlösung über einen Zeitraum von fünf Sekunden injizieren und anschließend eine zweite Injektion des Virus an derselben Stelle vornehmen. Die Maus in einen 37 °C warmen Inkubator oder auf eine Heizplatte bringen, bis sie das Bewusstsein wiedererlangt. Danach in den Heimkäfig setzen und die erforderliche Erholungszeit abwarten, bevor die Perfusionsfixierung gemäß dem Textprotokoll durchgeführt wird. Schnitt auf jeder Seite des Unterkiefers anlegen. Anschließend die Nasenspitze direkt hinter den Schneidezähnen abschneiden, um die Nasenhöhle freizulegen.Schneiden Sie das Gaumendach mit einer Schere der Länge nach in zwei Hälften und legen Sie es beiseite. Die Ganglia des Nervus trigeminus befinden sich unterhalb des Gaumens. Es handelt sich um weiße, längliche Gebilde von zwei bis drei Millimetern Länge, die mit dem Nervus trigeminus verbunden sind.Schneiden Sie die Äste des Nervus trigeminus auf jeder Seite des Ganglions ab, um sie vom Hirnstamm zu lösen. Entfernen Sie mithilfe einer chirurgischen Pinzette die Ganglien und überführen Sie sie in 20 % Saccharose in PBS; lassen Sie sie 24 Stunden lang inkubieren. Am nächsten Tag bei Raumtemperatur werden beide Ganglia trigemina in einen einzigen Block für die Kryoschnitteinbettung eingebettet.Einbettungsmedium, den Block bei minus 80 Grad Celsius einfrieren, bis er an einem Kryostaten geschnitten wird. Die Ganglia trigemina längs in 10 µm dicke Schnitte schneiden und sie auf auf 30 Grad Celsius erwärmten Superfrost-Objektträgern auffangen. Auf einen Objektträger passen vier bis fünf Schnitte. Die Vergabe mehrerer Serienbezeichnungen für den Objektträger kann nützlich sein. Wenn mehrere nachgeschaltete Anwendungen geplant sind, lassen Sie die Schnitte vor der Lagerung bei minus 80 Grad Celsius fünf bis 10 Minuten trocknen. Für dieses Protokoll wird die Sonde hergestellt, indem Cosmide, die 30 Kilobasen-Abschnitte des HSV-1-Genoms enthalten, mittels NIC-Translation mit SI 3D CTP markiert werden.Es fällt aus und bleibt in deionisierter Formamid suspendiert und sollte am ersten Tag aufgrund der Einbindung von S SI drei rosa erscheinen. Legen Sie die Objektträger auf einen Objektträgerhalter bei Raumtemperatur und lassen Sie die Schnitte 10 Minuten lang trocknen. Anschließend hydratisieren Sie die Schnitte in 1× PBS für 10 Minuten erneut.Als Nächstes wird das Gewebe 20 Minuten lang in 0,5 % Triton X-100 in 1× PBS permeabilisiert. Anschließend werden die Objektträger dreimal je 10 Minuten mit 2× SSC gewaschen und danach bis zur Erwärmung des Enmaskierungspuffers in 2× SSC aufbewahrt. Zum Enmaskieren wird der Citratpuffer in einer Mikrowelle vorgewärmt, bis der Puffer kocht.Dies erfolgt, indem eine Objektträger-Schale mit 200 Millilitern des Puffers gefüllt wird. Stellen Sie die Schale in einen größeren Behälter, der mit 500 Millilitern destilliertem Wasser gefüllt ist, und erwärmen Sie den Puffer bis zum Sieden vor. Anschließend werden die Objektträger in die Schale überführt.Überprüfen Sie, ob die Objektträger im Mikrowellenofen vollständig mit Puffer bedeckt sind. Erhitzen Sie die Objektträger im Puffer etwa 20 Sekunden lang, bis der Puffer siedet. Achten Sie darauf, dass der Puffer nicht überkocht.Danach die Objektträger bei Raumtemperatur zwei Minuten lang abkühlen lassen und den Erhitzungszyklus noch sechsmal wiederholen. Es ist entscheidend, die Anzahl und Dauer der Erhitzungszyklen empirisch zu bestimmen, um die Reproduzierbarkeit des Enthüllungsschritts zu gewährleisten. Die Mikrowelle, das Tablett, der Behälter, das Puffervolumen im Tablett.Das Volumen des Wassers im Behälter sollte nach Beendigung des Erhitzens unverändert bleiben. Überführen Sie die Objektträger für fünf Minuten in zwei XSSC unter einem Abzug, inkubieren Sie die Objektträger anschließend 15 Minuten in einer drei zu eins zu vier Lösung aus Methanol, Essigsäure und PBS. Danach inkubieren Sie die Objektträger 15 Minuten in einer frisch zubereiteten drei zu eins-Methanol-zu-Essigsäure-Mischung.Dehydrieren Sie die Schnitte nun durch sukzessive 10-minütige Inkubationen in 70 % Ethanol, gefolgt von zwei 10-minütigen Inkubationen in reinem Ethanol. Lassen Sie die Objektträger 10 Minuten lang bei Raumtemperatur trocknen, um sie für die Sonde vorzubereiten. Geben Sie 80 Mikroliter der Sondierungslösung tropfenweise auf die getrockneten Schnitte und bedecken Sie diese mit einem Deckglas.Überprüfen Sie, ob die Probelösung die gesamte Oberfläche der Deckglasplatte benetzt und ob keine Blasen vorhanden sind. Versiegeln Sie anschließend das Deckglas mit Kautschukkleber und lassen Sie es trocknen. Fahren Sie mit der Denaturierung fort, indem Sie die Objektträger fünf Minuten lang bei 80 Grad Celsius inkubieren.Überführen Sie die Objektträger anschließend rasch auf ein metallisches Tablett auf Eis für fünf Minuten. Darauf folgt eine Übernacht-Hybridisierung bei 37 Grad Celsius am nächsten Tag. Entfernen Sie den Gummizement mit einer Pinzette, während die Objektträger auf einem Wärmeblock bei 37 Grad Celsius liegen.Entfernen Sie die Deckglasabdeckung vorsichtig mit der Spitze einer Skalpellklinge. Waschen Sie die Schnitte anschließend wiederholt mit SSC. Färben Sie die Proben nun 10 Minuten lang mit dem geeigneten Farbstoff, beispielsweise DAPI oder Hoechst 33342, bei einer Konzentration von 0,5 Mikrogramm pro Milliliter in 1× PBS.Waschen Sie die Objektträger anschließend dreimal mit jeweils 1 XPBS, wobei jeder Waschschritt 10 Minuten dauert. Nach dem dritten Waschgang entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich vom Objektträger. Geben Sie danach am Ende jedes Objektträgers 80 Mikroliter Eindeckmedium mit einem Anti-Fading-Agens auf.Decken Sie das Medium langsam mit einem Deckglas von hoher optischer Qualität ab und vermeiden Sie die Bildung von Blasen. Versiegeln Sie die Probe anschließend mit Nagellack und lagern Sie sie im Dunkeln bei vier Grad Celsius. Bei der Entwicklung dieses Protokolls wurden mehrere Salzpuffer zum Enthüllen getestet.Während EDTA-Puffer dazu neigten, das Gewebe zu schädigen, eigneten sich Natriumcitrat-Tris, HCL und destilliertes Wasser zur Detektion von HSV Typ 1, um zu überprüfen, ob das Protokoll mit kommerziellen Sonden funktioniert. Die Detektion des latenten HSV-Typ-1-Genoms wurde mit einer biotinylierten PAN-HSV-Typ-1-Sonde von Enzobiochem durchgeführt, wobei sowohl einzelne als auch mehrfache Fleckenmuster für das HSV-Typ-1-Genom nachgewiesen werden konnten.Außerdem wurde das DNA-FISH-Protokoll an Mäusen und Kaninchen getestet, die mit drei gängigen Stämmen von HSV-1 infiziert waren. In allen Fällen zeigten die HSV-1-Genome ein fleckiges Signal mit variabler Helligkeit und Intensität. Zusätzlich wurde die Anwendbarkeit des Protokolls im Replikationszyklus von HSV-1 überprüft, indem DNA-FISH an Gewebeproben von Mäusen durchgeführt wurde, die eine allgemeine Herpesinfektion durchliefen.Bei diesen Tieren wurden große und helle Aggregate von HSV-1-Genomen in verschiedenen Geweben nachgewiesen, einschließlich der DRG, Augen und des Gehirns. Das DNA-FISH-Protokoll ist sehr vielseitig einsetzbar. Es ermöglicht die gleichzeitige Detektion des HSV-1-Genoms sowie viraler oder zellulärer RNAs und Proteine.Zum Beispiel ist die gleichzeitige Nachweisung des HSV-1-Genoms zusammen mit der HSV-1-Lat-RNA möglich. Die kombinierte Detektion des HSV-1-Genoms mit zellulären Proteinen wie dem zentromerischen Protein CENP-A wurde genutzt, um die Assoziation von HSV-1 mit Chromatin und PML-Kernkörperchen nachzuweisen. Das assoziierte Protein A TRX wurde mittels einer Dreifachfärbung sichtbar gemacht, wobei HSV-1-DNA rot, das RNA-Produkt Lat blau und A TRX grün dargestellt wurde.Einmal eingerichtet, ist die DNA-FISH-Prozedur sehr robust. Sie kann in weniger als 24 Stunden in Chargen von 20 oder mehr Objektträgern durchgeführt werden. Die Entwicklung dieser Technik wird es Forschern, die Herpesviren und andere persistente Viren untersuchen, ermöglichen, auf Einzelzell-Ebene zu erforschen, wie zelluläre Komponenten und die nukleäre Architektur die Biologie dieser Viren beeinflussen könnten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Eine Technik, die Kombination von in situ-Tetramer-Färbung und in situ-Hybridisierung (ISTH) ermöglicht die Visualisierung, Kartierung und Analyse der räumlichen Nähe von Virus-spezifischen CD8 + T-Zellen, um ihre Virus-infizierte Zielzellen, und die Bestimmung der quantitativen Beziehungen zwischen diesen Immunsystem Effektoren und Targets auf eine Infektion Ergebnisse.

Eine Technik, um gleichzeitig zu visualisieren Virus-spezifische CD8 + T-Zellen und Virus-infizierten Zellen In situ</em

Nachweis viraler RNA durch Fluoreszenz<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung (FISH)

In diesem Video wurden die mit MCPyV-Virionen infizierten Zellen einer in situ Hybridisierungskettenreaktion unterzogen, um MCPyV-spezifische Genome nachzuweisen. Darüber hinaus wurde die DNA-HCR-Technik mit FISH kombiniert, um die MCPyV-DNA in infizierten menschlichen Hautzellen sichtbar zu machen.

HCR-DNA FISH: Eine Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierungstechnik zum Nachweis viraler DNA in infizierten Zellen

Dieses Video zeigt eine Methode zur Überwachung des transportierten infizierten Zellproteins 0, ICP0 bei einer Herpes-simplex-Virus-1-Infektion. Nach der De-novo-Synthese transloziert ICP0 in den Zellkern und wandert später während des Fortschreitens der Infektion in das Zytoplasma. Die Immunfluoreszenzmikroskopie enthüllt und analysiert die subzelluläre Lokalisation des Proteins und bietet Einblicke in seinen Transport über Infektionsphasen hinweg.

Eine Immunfluoreszenztechnik zur Lokalisierung viraler Proteine in infizierten Zellen

Quelle: Baleriola, J., et. al., Nachweis axonal lokalisierter mRNAs in Hirnschnitten mittels hochauflösender In-situ-Hybridisierung.  J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video zeigt den Nachweis von mRNA in cholinergen Axonen in fixierten Maus-Hippocampus-Schnitten mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung und Antikörperfärbung. Die Fluoreszenzmikroskopie zeigt die räumliche Lokalisierung von sondenmarkierten mRNAs und Cholinacetyltransferase in cholinergen Neuronen.

Immunfärbung von Neuronen in Hirnschnitten von Mäusen nach Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung

Die Lokalisierung der Genexpression auf bestimmte Zelltypen kann aufgrund des Mangels an spezifischen Antikörpern eine Herausforderung darstellen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur gleichzeitigen dreifachen Detektion der Genexpression durch Kombination von Doppelfluoreszenz-RNA-in-situ-Hybridisierung mit Immunfärbung.

Die Kombination von Doppel-Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Die Hybridisierung mit Immunmarkierung für Nachweis der Expression von drei Gene in Mäusehirnschnitten

Virale transkriptionelle Fabriken sind diskrete Strukturen, die mit zellulären RNA-Polymerase II, virale Gentranskription bei Reaktivierung erhöhen angereichert sind. Hier ist eine Methode, um Seiten der Transkription aktiv viral Chromatin im 3D-Raum nuklearen durch eine Kombination von Immunfluoreszenz-Färbung und in Situ -RNA-Hybridisierung zu finden.

Funktionelle Bildgebung der virale Transkription Fabriken mit 3D Fluoreszenz-Mikroskopie

Wir beschreiben ein Protokoll, das fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) verwendet, um mehrere herpesvirale RNAs in lytisch infizierten menschlichen Zellen zu visualisieren, entweder in Suspension oder anhaftend. Dieses Protokoll enthält die Quantifizierung der Fluoreszenz, die ein nukleozytoplasmatisches Verhältnis erzeugt, und kann für die gleichzeitige Visualisierung von Wirts- und viralen Proteinen mit Immunfluoreszenz (IF) erweitert werden.

Quantitative Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (FISH) und Immunfluoreszenz (IF) spezifischer Genprodukte in KSHV-infizierten Zellen

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Kombination von Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und Fluoreszenz-Immunhistochemie (IHC) sowohl in frisch gefrorenen als auch in fixierten Maus-Hirnschnitten, mit dem Ziel, Multilabel-FISH und Fluoreszenz-IHC-Signal zu erreichen. IHC zielte auf zytoplasmatische und membrangebundene Proteine ab.

Kombination von Multiplex-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung mit fluoreszierender Immunhistochemie an frischen, gefrorenen oder fixierten Mäusehirnschnitten

Hier wird ein Protokoll für einen Fluoreszenzbildgebungsansatz vorgestellt, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), eine Methode, die in der Lage ist, gleichzeitig Fluoreszenz-Einzelzellvisualisierung von viralen Proteinen und Nukleinsäuren unterschiedlicher Art und Strandung zu visualisieren. Dieser Ansatz kann auf eine Vielzahl von Systemen angewendet werden.

Einzelzell-Multiplex-Fluoreszenzbildgebung zur Visualisierung viraler Nukleinsäuren und Proteine und zur Überwachung von HIV-, HTLV-, HBV-, HCV-, Zika-Virus- und Influenza-Infektionen

Lernen Sie die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung zur Detektion des Herpes-simplex-Virus-Genoms in Neuronen der Trigeminusganglien von Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung viraler DNA und RNA auf Einzelzellebene.

Nachweis der Transkripte von Genom und einem Persistent DNA-Virus in einem neuronalen Gewebe Fluorescent In situ Hybridisierung Kombination mit Immunfärbung (Video) | JoVE Journal

Nachweis der Transkripte von Genom und einem Persistent DNA-Virus in einem neuronalen Gewebe Fluorescent In situ Hybridisierung Kombination mit Immunfärbung

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