Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Untersuchung der Anziehungskraft des Mikroglia-Prozesses auf eine Verbindung in einem Maushirnschnitt

Platzieren Sie ein Hirnschnitt einer Maus in einer Perfusionskammer, die aCSF enthält, unter einem Zwei-Photonen-Mikroskop.

Die Maus ist gentechnisch so verändert, dass sie GFP in Mikroglia exprimiert und so die Verfolgung von Mikroglia-Bewegungen ermöglicht.

Sichern Sie die Scheibe mit einer Halterung.

Lokalisieren Sie mithilfe der Hellfeldbeleuchtung den interessierenden Bereich.

Schalten Sie auf Fluoreszenzbeleuchtung um, um die Mikroglia sichtbar zu machen.

Füllen Sie eine Mikropipette mit der Testmasse, montieren Sie sie auf einen Spritzenhalter und senken Sie sie ab, um die Scheibe zu berühren.

Aktivieren Sie den Zwei-Photonen-Bildgebungsmodus, der niederenergetisches Nahinfrarotlicht in das Gewebe fokussiert.

Im Brennpunkt des Lasers bündeln zwei Photonen ihre Energie, um GFP anzuregen und dabei Fluoreszenz zu emittieren.

Nehmen Sie Bilder in mehreren Z-Ebenen auf, um sich auf die Mikrogliaprozesse zu konzentrieren.

Zeichnen Sie die Grundaktivität auf, injizieren Sie dann die Verbindung und setzen Sie die Aufzeichnung fort.

Die Substanz bindet an Mikrogliarezeptoren und löst Signalwege aus, die die Ausdehnung des Mikrogliaprozesses in Richtung der Verbindungsquelle vorantreiben.

Überwachen Sie den Fluoreszenzanstieg in der Nähe der Injektionsstelle im Laufe der Zeit, um die Bewegung zu verfolgen.

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p style='background-color:#ffffff;line-height:1.38;margin-bottom:0pt;margin-top:0pt;padding:0pt 0pt 12pt;' dir='ltr'>30 Minuten bevor Sie die Aufnahme starten, schließen Sie die Peristaltikpumpe an eine angepasste Aufnahmekammer mit oberer und unterer Perfusion an, um die Sauerstoffversorgung und Lebensfähigkeit der Gewebeschnitte zu optimieren und reinigen Sie das gesamte Perfusionssystem mit 50 Millilitern Reinstwasser. Am Ende des Reinigungszyklus wird die Perfusion der Aufnahmekammer mit 50 Millilitern aCSF in einem Glasbecherglas unter konstanter Auffrischung gestartet und die erste abzubildende Scheibe mit einer Einweg-Weithalspipette in das Becherglas übertragen, um das Linsenpapier zu entfernen.

Wenn der Schnitt auf den Boden des Becherglases gesunken ist, übertrage den Schnitt in die Aufnahmekammer und positioniere den Scheibenhalter auf dem Schnitt, um die durch den Perfusionsfluss verursachte Bewegung zu minimieren. Verwenden Sie Hellfeldbeleuchtung, um die interessierende Gehirnregion unter einer 5- bis 10-fachen Vergrößerung anzuvisieren. Verwenden Sie dann ein 25-fach-Objektiv mit einer 0,35-fachen Wasserimmersionslinse, um die Position des Sichtfelds anzupassen.

Verwenden Sie Fluoreszenzbeleuchtung, um die fluoreszierenden Mikrogliazellen zu lokalisieren und die Pipette mit 10 Mikrolitern aCSF zu füllen, die die interessierende Verbindung in ihrer endgültigen Konzentration enthalten. Richten Sie die Spitze durch leichtes Schütteln nach unten, um alle in der Spitze eingeschlossenen Luftblasen zu entfernen, und montieren Sie die gefüllte Pipette in einen Pipettenhalter, der mit einer 5-Milliliter-Spritze verbunden ist, wobei ein Kolben in der 5-Milliliter-Position positioniert und auf einem dreiachsigen Mikromanipulator montiert ist.

Senken Sie die Pipette vorsichtig in Richtung der Scheibe, wobei Sie das Objektiv gleichzeitig steuern und einstellen, bis die Pipettenspitze die Oberfläche der Scheibe leicht berührt. Stimmen Sie nun den Laser ab und schalten Sie das Mikroskop in den Multiphotonen-Modus. Stellen Sie sicher, dass die Kammer von jeder Lichtquelle abgeschirmt ist, und schalten Sie die nicht degescannten Detektoren ein. Stellen Sie die Verstärkung ein und verwenden Sie eine Nachschlagetabelle mit einer farbcodierten Obergrenze, um eine Sättigung der Pixel im Bild zu vermeiden.

Starten Sie dann die Aufnahme für eine Gesamtdauer von mindestens 30 Minuten, indem Sie den Spritzenkolben nach fünf Minuten über einen Zeitraum von 5 Sekunden langsam von der 5- auf die 1-Milliliter-Position drücken, um die Verbindung auf den Schnitt aufzutragen. Führen Sie für die Bildanalyse zunächst die Z-Projektion und die Driftkorrektur mit ImageJ für die gewünschte Datei durch. Öffnen Sie dann die geänderte Datei in Icy und zeichnen Sie einen kreisförmigen Bereich mit einem Durchmesser von 35 Mikrometern, der über der Injektionsstelle zentriert ist.

Führen Sie den Film erneut mit dem ROI aus, um sicherzustellen, dass er gut positioniert ist. Verwenden Sie dann das Plugin "Region of Intensity Evolution", um die mittlere Intensität im Zeitverlauf im Bereich of Interest zu messen und die Ergebnisse als .xls Datei zu speichern.