Name: Kryokonservierung von Maus Embryonen durch Ethylen-Glykol-Based Vitrification (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Erfahren Sie eine Ethylenglykol-basierte Vitrifikationsmethode zur Kryokonservierung von Maus-Embryonen mit Überlebensraten über 90%. Diese Technik minimiert embryotoxische Effekte und eignet sich für verschiedene Mausstämme.

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Diese Studie wurde in Zusammenarbeit mit dem National BioResource Projekt durchgeführt, das Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie, Japan.

Die allgemeine Systematik des Experiments ist in Abb. dargestellt. 1. 1. Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Machen Sie den Basis-Medium (hier als PB1 bekannt) in einem 100 ml-Glasflasche nach der folgenden Tabelle unten: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> MW </td><td> mM </td><td> mg/100ml </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,4 </td><td> 136,98 </td><td> 800,0 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,6 </td><td> 2,68 </td><td> 20,0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 136,1 </td><td> 1,47 </td><td> 20,0 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 · 12 H 2 O </td><td> 358,14 </td><td> 8,04 </td><td> 288,1 </td></tr><tr><td> MgCl 2, 6H 2 O </td><td> 203,3 </td><td> 0,49 </td><td> 10,0 </td></tr><tr><td glucose></td><td> 180,2 </td><td> 5,56 </td><td> 100,0 </td></tr><tr><td> Na-Pyruvat </td><td> 110 </td><td> 0,33 </td><td> 3,6 </td></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H 2 O </td><td> 147 </td><td> 0,9 </td><td> 13,2 </td></tr><tr><td> Penicillin G </td><td></td><td></td><td> 6,0 (ca.) </td></tr></tbody></table></li><li> Machen Sie das Ficoll-Saccharose (FS)-Lösung: <ol><li> Fügen Sie den folgenden Chemikalien zu 14 ml PB1 Lösung in einer 50 ml Tube. <table border="1"><tbody><tr><td> Ficoll 70 </td><td> 6,0 g </td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> 3,424 g </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 42.0 mg </td></tr></tbody></table></li><li> Mix Ficoll 70 und Saccharose in PB1-Lösung und gut schütteln, bis sie vollständig gelöst ist. </li><li> Nach Prüfung der vollständigen Auflösung vor, fügen BSA auf der Oberfläche der Lösung und hält sie4 ° C bis BSA vollständig gelöst ist (&gt; 4 Stunden oder über Nacht). </li></ol></li><li> Machen Sie den Gleichgewichts-Lösung (EFS20) und die Verglasung Lösung (EFS40) in einem 50 ml-Tube: <ul><li> EFS20: 20% (v / v) Ethylenglykol, 24% (w / v) Ficoll und 0,4 mol / L Saccharose in PB1 mit BSA </li><li> EFS40: 40% (v / v) Ethylenglykol, 18% (w / v) Ficoll und 0,3 mol / L * Saccharose in PB1 mit BSA * Bei Embryonen aus der BALB / c oder ICR-Stamm, erhöhen die Konzentration von Saccharose zu 0,9 mol / L Saccharose, weil sie empfindlicher auf 6 cryodamage sind. </li></ul><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> EFS20 Lösung </td><td> EFS40 Lösung </td></tr><tr><td> Ethylenglykol </td><td> 1 ml </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> FS-Lösung </td><td> 4 ml </td><td> 3 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Sterilisation der Lösung durch Filtration mit einem 0,45 um filter. Machen Aliquots in 5 ml Polystyrol-Röhrchen und lagern bei 4 ° C. Sie können für ca. 6 Monate verwendet werden. </li><li> Vorbereitung der Embryo Auftauen Lösung mit 0,75 M Saccharose (TS1) <ol><li> Lösen Sie 7,7 g Saccharose in PB1 (hergestellt in Schritt 1,1) und bringen das Gesamtvolumen auf 30 ml. Mix durch leichtes Schütteln, bis Saccharose vollständig gelöst ist. </li><li> Add 90 mg BSA auf die Oberfläche der Lösung und lassen Sie es stehen bis zur vollständigen Auflösung. </li><li> Sterilisation der Lösung durch Filtration. </li><li> Aliquotieren und lagern bei 4 ° C. Sie können für etwa 1 Monat verwendet werden. </li></ol> Hinweis: TS1 kann auch aus kommerziell erhältlichen M2 vorbereitet werden. <ol start="6"><li> Lösen Sie 7,7 g Saccharose in M2 und bringen das Gesamtvolumen auf 30 ml. </li><li> Mix durch leichtes Schütteln, bis Saccharose vollständig gelöst ist. </li><li> Sterilisation der Lösung durch Filtration. </li><li> Aliquotieren und lagern bei 4 ° C. Sie können für etwa 1 Monat verwendet werden. </li></ol></li><li> TS2 (Auftauen Lösungmit 0,25 M Saccharose): <ol><li> 10 ml TS1 mit 20 ml Volumen von PB1 oder M2, als angemessen. </li><li> Aliquotieren und lagern bei 4 ° C. Sie können für etwa 1 Monat verwendet werden. </li></ol></li></ol> 2. Verglasung von 2-Zellen muriner Embryonen <ol><li> Bereiten Sie 2-Zellen-Maus-Embryonen durch natürliche Paarung oder konventionelle In-vitro-Fertilisation. </li><li> Aliquot 50 pl EFS40 in ein Kryoröhrchen. Jenseits, führen den Rest der Verglasung Verfahren bei der Raumtemperatur. </li><li> Aliquot 50 ul EFS20 auf dem Boden einer 35 mm oder 60 mm Kunststoff-Petrischale. </li><li> Übertragen Sie bis zu 30 Embryonen EFS20 mit einer Glaskapillare mit nur den Mindestbetrag des Kulturmediums. Starten Sie einen Timer für 2 min. Hinweis: Legen Embryonen auf der Unterseite des Tropfens. Dies macht eine effiziente Entwässerung von Embryonen. Überprüfen Sie die Morphologie der Embryonen, die durch ein Stereomikroskop. Dehydrated Embryonen zeigen eine geschrumpfte Morphologie, wie in Abb. gezeigt. 2A.Wenn sie nicht dehydriert genug sind, für mehr 1 oder 2 min warten. </li><li> Bei ca. 1,5 min, nehmen Sie den Embryonen aus dem EFS20 Tropfen nur mit der minimalen Menge der Lösung. Übertragen Sie sie auf EFS40 in der Kryoröhrchen in Schritt 2.1 vorbereitet. Hinweis: Für die besten Ergebnisse erzielen Sie, den Zeitpunkt der Abholung Embryonen, so dass alle Embryonen können in EFS40 bei rund 2 min übertragen werden. </li><li> Warten Sie 1 min. </li><li> Legen Sie die Kryoröhrchen direkt in flüssigen Stickstoff (LN 2). </li></ol> 3. Auftauen Vitrified 2-Zellen muriner Embryonen <ol><li> Vor dem Auftauen ein Gericht zubereiten, mit 10 ul Tropfen Embryo Nährboden für aufgefundenen Embryonen (siehe Schritt 3,13). Decken Sie die Schüssel mit Öl und in eine CO 2-Inkubator bis zur Verwendung. Hinweis: Obwohl alle Medien für die Routine Embryokultur in diesem Experiment verwendet werden können, empfehlen wir Medien mit höherer Osmolarität wie M16 Medium. </li><li> Warm TS1 bis 37 ° C. </li><li> Setzen Sie auf eine Gesichtsmaske und Kryo. Öffnen Sie die LN 2 tank und Abrufen einer Kryoröhrchen mit Embryonen. </li><li> Schnelles Öffnen der Spitze der Tube und entsorgen LN 2. Warten Sie 30 Sek. TS1 vor dem Einfrieren zu verhindern um den nächsten Schritt. </li><li> Verwenden Sie ein 1000ul Pipette auf 850 ul von TS1 (37 ° C) in die Röhre hinzu und mischen Sie die Lösung durch vorsichtiges Pipettieren (etwa zehnmal in 25 Sekunden), bis die Lösung gleichmäßig gelöst ist. </li><li> Übertragen Sie die gesamte Volumen der Röhre zu einem Kunststoff 60 mm Petrischale (oder einem Uhrglas) (Abb. 3A). Hinweis: Die Embryonen sollte bei Raumtemperatur (22-25 ° C) behandelt werden, bis sie in einem CO 2-Inkubator bei Step 3,14 platziert werden. </li><li> Starten Sie einen Timer für 3 min. </li><li> Mit rund 2 min in TS1, schütteln die Schale, bis das Medium mit Embryonen über die Oberfläche der Schale (Abb. 3B) verteilt ist. Hinweis: Dies wird dazu beitragen die Embryonen nach unten gehen, weil sie nahe an der Oberfläche schwimmen, wenn sie TS1 übertragen. </li><li> Legen Sie drei 50 ul Tropfen TS2 auf the-Spiegel (Abb. 3C). </li><li> Nach 3 min in TS1, überprüfen Sie die Morphologie der Embryonen, die durch ein Stereomikroskop, sie sollten leicht geschrumpft sein. Siehe die Morphologie der Embryonen in den früheren (Abb. 2B) und später (Abb. 2C) in TS1. Hinweis: Wenn die Embryonen noch geschwollen, halten sie in TS1 mehr 1 bis 3 min. </li><li> Nehmen Sie den Embryonen und übertragen Sie sie auf den ersten Tropfen TS2 (Abb. 3D). Starten Sie einen Timer für 3 min </li><li> Nach 3 min-Embryonen in die zweite und dann die dritte Tropfen (Abb. 3E). </li><li> Übertragen Sie die Embryonen in das Kulturmedium in Schritt 3.1 vorbereitet. Die Embryonen werden in die Form der Abb.. 2D. </li><li> Legen Gericht in einem CO 2-Inkubator. Etwa 10 min später-Embryonen in die nächste Tropfen Kulturmedium zu waschen Saccharose, übernommen wurde von TS2 durchgeführt. </li><li> Weiter Kultur in einem CO2-Inkubator bis Embryotransfer. Hinweis: Transfer Embryos zu den Eileitern des Empfängers Weibchen am Tag nach dem Auftauen. Lange Kultur in vitro zu einem Rückgang der Lebensfähigkeit der Embryonen in einigen Stämmen von Mäusen. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: In vitro - und In-vivo-Entwicklung von Embryonen nach dem Auftauen ist in den Tabellen 1 und 2 dargestellt. Die Vorteile dieses Protokolls sind die hohe Überlebensfähigkeit der Embryonen nach dem Auftauen und der breiten Anwendbarkeit auf verschiedene Stämme von Mäusen. <table border="1"><tbody><tr><td> Belastung </td><td> Gesamtzahl der Röhren </td><td> Anzahl der Embryonen verglaste </td><td> Recovered (Nr. (%)) </td><td> Morphologisch normalen (Nr. (%)) </td><td> Entwicklung zu Blastozysten (Nr. (%)) </td></tr><tr><td> C57BL/6J </td><td> 20 </td><td> 400 </td><td> 397 (99) </td><td> 394 (99) </td><td> 342 (87) </td></tr><tr><td> BALB / cA </td><td> 15 </td><td> 300 </td><td> 296 (99) </td><td> 282 (95) </td><td> 238 (84) </td></tr><tr><td> ICR </td><td> 24 </td><td> 480 </td><td> 474 (99) </td><td> 443 (93) </td><td> 398 (90) </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. In vitro-Entwicklung von keramisch aufgetauten Embryonen in gemeinsamen Mausstämme <table border="1"><tbody><tr><td> Zustand von Embryonen </td><td> Anzahl der Empfänger Weibchen </td><td> Anzahl der transferierten Embryonen </td><td> Nidationsstellen (Nr. (%)) </td><td> Live-Nachkommen (Nr. (%)) </td></tr><tr><td> Frisch </td><td> 12 </td><td> 180 </td><td> 141 (78.3) </td><td> 110 (61.1) </td></tr><tr><td> Verglaste </td><td> 16 </td><td> 242 </td><td> 202 (83.5) </td><td> 125 (51.7) </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. In vivo-Entwicklung von keramisch aufgetauten Embryonen in C57BL/6J-Mäuse. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Die allgemeine Systematik des Versuchs einschließlich der Äquilibrierung Verglasung und Auftauen von Embryonen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Die Morphologie der Embryonen bei jedem Schritt nach dem Auftauen. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Auftauen von Embryonen. Alle Vorgänge werden bei Raumtemperatur durchgeführt. (A), hinzufügen 850 ul von TS1 (37 ° C) in eine Kryoröhrchen und Transfer das gesamte Volumen der Lösung in die Kryoröhrchen auf einer Plastikschale. Zu diesem Zeitpunkt sehen die Embryonen geschwollen wie in Abb. gezeigt. 2B. (B), Spread der Lösung über die Oberfläche der Schale durch leichtes Schütteln. (C), Place drei 50 ul Tropfen TS2 auf der Plastikschale. (D), Transfer der Embryonen in den ersten Tropfen TS2. Nach 3 min, sehen die Embryonen shurunken wie in Abb. gezeigt. 2C. (E), Transfer ihnen seriellely in den verbleibenden TS2 Tropfen und dann in das Kulturmedium.

<ol><li>Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+mouse+embryos+frozen+to+-196%C2%B0+and+-269%C2%B0C%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Survival of mouse embryos frozen to -196° and -269°C.</a> Science. 187, 411-414 (1972).</li>
<li>Rall, W. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice-free+cryopreservation+of+mouse+embryos+at+-196%C2%B0C+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196°C by vitrification.</a> Nature. 313, 573-575 (1985).</li>
<li>Yoshiki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+resources+at+the+RIKEN+BioResource+center%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Anim%22%5BJournal%5D)">The mouse resources at the RIKEN BioResource center.</a> Exp. Anim. 58, 85-96 (2009).</li>
<li>Mochida, K., Ogura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+embryos+in+laboratory+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mamm.+Ova.+Res%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of embryos in laboratory species.</a> J. Mamm. Ova. Res. 27, 87-92 (2010).</li>
<li>Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+mouse+embryos+cryopreservation+in+a+low+toxicity+vitrification+solution%2C+without+appreciable+loss+of+viability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fert%22%5BJournal%5D)">A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability.</a> J. Reprod. Fert. 89, 91-97 (1990).</li>
<li>Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+genotype+on+the+efficiency+of+mouse+embryo+cryopreservation+by+vitrification+or+slow+freezing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing methods.</a> Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).</li>
<li>Kasai, M., Mukaida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+animal+and+human+embryos+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biomed.+Online%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification.</a> Reprod. Biomed. Online. 9, 164-170 (2004).</li>
<li>Miyake, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+mouse+oocytes+and+embryos+at+various+stages+of+development+in+an+ethylene+glycol-based+solution+by+a+simple+method%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stages of development in an ethylene glycol-based solution by a simple method.</a> Theriogenology. 40, 121-134 (1993).</li>
<li>Han, M. S., Niwa, K., Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+rat+embryos+at+various+developmental+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Vitrification of rat embryos at various developmental stages.</a> Theriogenology. 59, 1851-1863 (2003).</li>
<li>Jin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibrium+vitrification+of+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Equilibrium vitrification of mouse embryos.</a> Biol. Reprod. 82, 444-450 (2010).</li>
</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Seit dem ersten Bericht des Maus-Embryo Verglasung von Rall und Fahy in 1985 2 wurden mehrere technische Verbesserungen vorgenommen, um die Überlebensfähigkeit der Embryonen nach dem Auftauen zu erhöhen. Einer der erfolgreichsten Modifikationen wurde durch Verwendung von Ethylenglykol als Frostschutzmittel wegen ihrer geringen Toxizität und hohe Membran-Permeabilität erreicht. Solche Vorteile ermöglichen es uns, das Einfrieren von Embryonen bei Raumtemperatur 4 Griff, andere Verglasung Methoden erfordern Embryo Übergabe bei kühleren Temperaturen und sind nicht immer für einige Stämme von Mäusen mit BALB / c 6. Die erste Ethylenglykol-Basis Verglasung wurde von Kasai et al. im Jahr 1990 5,7. Da die ursprüngliche Methode für Kunststoff-Strohhalme als Container optimiert wurde, haben wir etwas das Protokoll für Kryoröhrchen, die leichter zugänglich in den Laboratorien und widerstandsfähiger gegen körperliche Schäden sind modifiziert. Daher kann die Verglasung hier beschriebene Methode applicable zu vielen Labors mit Mäusen als wissenschaftlicher Modelle. Die gleiche Methode kann auch für Maus-Embryonen im Morula und Blastozyste Stufen 8 und Rattenembryonen 9 verwendet werden. Allerdings haben wir vor kurzem festgestellt, dass die Qualität der Kryoröhrchen kann die Überlebensrate von Embryonen nach dem Einfrieren und Auftauen zu beeinflussen. Daher ist es wichtig, die Innenseite der Kryoröhrchen für seine Glätte vor Verglasen Embryonen (z. B., siehe Tabelle auf der spezifischen Reagenzien und Geräte) zu untersuchen. Vitrification Methoden haben viele Vorteile gegenüber herkömmlichen langsamen Einfrieren Methoden, aber sie inhärent haben einen Nachteil in Bezug auf Transport-Zweck. Als verglaste Embryonen bei unter -120 gehalten werden sollten ° C, um ihre Lebensfähigkeit zu erhalten, sind trocken Verlader in der Regel für ihre sicheren Transport verwendet. Dry Verlader sind schwer und sperrig, und ihre Hin-und Rückfahrt ist teuer, vor allem für internationale Transporte. Wir sind jetzt entwickelt derzeit eine neue Verglasung Methodedie verglaste Embryonen können auf Trockeneis gelagert werden (ca. -80 ° C) für mindestens 7 Tage 10. Diese Methode sollte die Verglasung der nächsten Generation werden.

<table border="1"><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Rinderserumalbumin </td><td> Merck Biosciences (Calbiochem) </td><td> 12657 </td><td></td></tr><tr><td> Ethylenglykol </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 058-00986 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll 70 </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0310-10 </td><td></td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 041-00595 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 191-01665 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 163-03545 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 169-04245 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 · 12H 2 </sub&gt; O </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 500-04195 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 · 6 H 2 O </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 135-00165 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H2O </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 031-00435 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin G </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-4687 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumpyruvat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-8574 </td><td></td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 196-00015 </td><td></td></tr><tr><td> M16-Medium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7292 </td><td></td></tr><tr><td> M2-Medium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7167 </td><td></td></tr><tr><td> Cryotube </td><td> Sumitomo Bakelite </td><td> MS-4501 </td><td> &quot;Kryo-Vial&quot; </td></tr></table>

kryokonservierung von maus embryonen durch ethylen-glykol-based vitrification

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Kryokonservierung von Maus-Embryonen ist eine technologische Basis, die biomedizinischen Wissenschaften unterstützt, da viele Stämme von Mäusen durch genetische Modifikationen hergestellt worden sind und die Zahl ist konstant steigt von Jahr zu Jahr. Seine technische Entwicklung begann mit langsamen Einfrieren Methoden in den 1970er Jahren 1, dann durch Verglasung Methoden in den späten 1980er Jahren 2 entwickelt gefolgt. Im Allgemeinen ist die letztere Technik den Vorteil, ihre Schnelligkeit, Einfachheit und hohe Überlebensfähigkeit der Embryonen gewonnen. Allerdings sind die Frostschutzmitteln enthaltene hochgiftige und können nachfolgende Entwicklung des Embryos beeinflussen. Daher wurde die Technik nicht für bestimmte Stämme von Mäusen, auch wenn die Lösungen bis 4 ° C abgekühlt, um die toxische Wirkung beim Embryo Handling zu mildern. Am RIKEN BioResource Center, sind mehr als 5000 Mausstämme mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen und Phänotypen 3 gehalten, und deshalb haben wir eine Verglasung te optimiertchnique, mit denen wir Embryonen aus vielen verschiedenen Stämmen von Mäusen Kryokonservierung, mit den Vorteilen der hohen Embryo Überleben nach Verglasung und Auftauen (oder Verflüssigung, genauer gesagt) bei Umgebungstemperatur Temperatur 4. Hier präsentieren wir eine Verglasung Methode zur Maus-Embryonen, die erfolgreich an unserem Zentrum eingesetzt. Die Kryokonservierung Lösung enthält Ethylenglykol anstelle von DMSO, um die Toxizität von Embryonen 5 zu minimieren. Es enthält auch Ficoll und Saccharose für die Prävention von Entglasung und osmotische Anpassung, bzw.. Embryonen können bei Raumtemperatur behandelt und übertragen in flüssigen Stickstoff innerhalb von 5 min. Da die ursprüngliche Methode für Kunststoff-Strohhalme als Container optimiert wurde, haben wir etwas das Protokoll für Kryoröhrchen, die leichter zugänglich in den Laboratorien und widerstandsfähiger gegen körperliche Schäden sind modifiziert. Wir beschreiben auch die Verfahren nach dem Auftauen verglaste Embryonen im Detail, weil es eine kritische ste istp für eine effiziente Rückgewinnung von lebenden Mäusen. Diese Methoden wäre es hilfreich, Forscher und Techniker, die Erhaltung der Mausstämme für den späteren Gebrauch müssen in einem sicheren und kostengünstige Weise.

Eine Ethylenglykol-Basis Verglasung Methode zur Maus-Embryonen beschrieben. Es ist vorteilhaft, andere Methoden in ihrer Einfachheit und niedrigen embryonalen Toxizität, und kann daher weitgehend auf viele Stämme von Mäusen, einschließlich Inzucht-und Gen-veränderten Mäusen.

Kryokonservierung von Maus Embryonen durch Ethylen-Glykol-Based Vitrification

Die Kryokonservierung von Mäuseembryonen ist eine technologische Grundlage, die die biomedizinischen Wissenschaften unterstützt, da viele Mäusestämme durch genetische ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Maus-Embryonen in flüssigem Stickstoff einzufrieren und sie anschließend aufzutauen, um lebende Mäuse zu erhalten. Dies wird erreicht, indem Mausembryonen zunächst in ein Equilibrationsmedium getaucht, dann in ein Vitrifikationsmedium in einer Kryoröhre überführt und schließlich in einen flüssigen Stickstofftank gegeben werden. Später können die Embryonen in einem hochosmotischen Medium aufgetaut und in Kulturmedium inkubiert werden, bis sie in empfängliche Weibchen transferiert werden. Letztendlich zeigen die Ergebnisse eine Überlebensrate von mehr als 90 % der Embryonen nach Vitrifizierung und Auftauen sowie Geburtenraten zwischen 30 und 70 % nach Embryotransfer. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das permeable Kryoprotektivum Glykol für die Embryonen weniger toxisch ist als herkömmliche Kryoprotektiva. Die Durchführung des Verfahrens wird von einer Technikerin aus meinem Labor demonstriert, bevor mit diesem Protokoll begonnen wird.Bereiten Sie zwei Zell-Maus-Embryonen, die durch natürliche Paarung oder konventionelle IVF-Techniken gewonnen wurden, in einer Kryoröhre zur späteren Lagerung vor und geben Sie 50 µL Embryo-Einfrierlösung EF S 40 hinzu. Bereiten Sie dann eine 35 mm oder 60 mm große Plastik-Petri-Schale mit 50 µL Raumtemperatur-EFS 20 vor.Überführen Sie mit einer Glaskapillare bis zu 30 Embryonen in die Schale. Achten Sie darauf, das Kulturmedium nicht mitzuübertragen. Um eine Austrocknung der Embryonen zu gewährleisten, platzieren Sie sie am Boden des Tropfens.Nach etwa 60 bis 90 Sekunden verwenden Sie ein Kapillarrohr, um dehydrierte Embryonen aufzusaugen, die eine geschrumpfte Morphologie aufweisen. Überführen Sie diese Embryonen in die EFS-Lösung im Kryoröhrchen, wobei möglichst wenig EFS 20 transferiert werden sollte.Nachdem die Embryonen übertragen wurden, lassen Sie sie sich eine Minute lang in der EFS 40 absetzen, bevor sie in flüssigem Stickstoff eingefroren werden. Vor dem Auftauen der Embryonen geben Sie mindestens zwei Tropfen mit je 10 Mikroliter hochosmolarem Embryokulturmedium, wie beispielsweise M 16 Medium, in eine Kulturschale. Bedecken Sie die Tropfen anschließend vollständig mit Silikon- oder Mineralöl und stellen Sie die Schale bis zur Verwendung in einen Kohlendioxid-Inkubator.Als Nächstes erwärmen Sie die TS-One-Lösung unter Verwendung einer Gesichtsmaske und Kryohandschuhe auf 37 Grad Celsius. Entnehmen Sie die Embryonen aus dem flüssigen Stickstoffbehälter. Öffnen Sie nun schnell das Kryoröhrchen und entsorgen Sie jeglichen flüssigen Stickstoff in den Behälter oder einen geeigneten Auffangbehälter.Dann 30 Sekunden warten. Nun 850 µL der warmen TS-eins-Lösung in das Kryoröhrchen geben. Die Lösung etwa 10-mal vorsichtig aufsaugen und wieder ausstoßen, damit sie gleichmäßig gelöst wird.Überführen Sie dann das gesamte Volumen in eine plastische 60 Millimeter große Petrischale. Oder lassen Sie die Embryonen auf einer Uhrglasunterlage drei Minuten lang auf Raumtemperatur akklimatisieren, bei der sie für den Rest des Verfahrens verbleiben sollten. Verwenden Sie kein Erwärmungsgerät.Untersuchen Sie die Embryonen in der Petrischale unter einem Stereomikroskop, um ihr Aussehen zu Beginn der Inkubation zu beurteilen. Nach etwa zwei Minuten Inkubation versenken Sie die Embryonen, indem Sie die Schale vorsichtig schütteln, bis das Medium gleichmäßig über die Oberfläche verteilt ist. In der letzten Minute der Inkubation geben Sie drei separate Tropfen je 50 Mikroliter TS-two-Lösung in die Schale ab. Wenn die drei Minuten abgelaufen sind, verwenden Sie ein Stereomikroskop, um zu überprüfen, ob die Embryonen leicht geschrumpft sind. Falls die Embryonen noch geschwollen sind, fahren Sie mit der Inkubation für weitere ein bis drei Minuten fort. Heben Sie nun die Embryonen mit einer Glaskapillare auf und überführen Sie sie in den ersten Tropfen TS zwei.Warten Sie drei Minuten und überführen Sie die Embryonen in den zweiten Tropfen. Danach in den dritten Tropfen. Schließlich holen Sie die vorbereitete Embryonenmediumschale aus dem Inkubator und überführen die Embryonen mit einer Glaskapillare in den ersten Tropfen des Mediums.Unter einem Stereomikroskop betrachtet, sollten die Embryonen langsam ihre normale Morphologie zurückgewinnen. Stellen Sie die Petrischale nun etwa 10 Minuten lang in den Inkubator zurück. Anschließend wird die Saccharose ausgespült, die aus TS zwei übertragen wurde.Versetzen Sie die Embryonen in den nächsten Tropfen Kulturmedium. Kultivieren Sie die Embryonen weiterhin im CO2-Inkubator, bis sie in die Uterus der empfänglichen Weibchen transferiert werden. Nach der Vitrifizierung und Wiedererlangung von 300 bis 480 Embryonen aus drei verschiedenen Mausstämmen war die Überlebensfähigkeit sehr hoch.Nach dem Auftauen lag der Anteil der Embryonen mit normaler Morphologie zwischen 93 und 99 %, und mindestens 84 % dieser Embryonen entwickelten sich zu Blastozysten. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit austretendem Stickstoff äußerst gefährlich sein kann, und ergreifen Sie Vorsichtsmaßnahmen, um direkten Kontakt zu vermeiden und die Exposition in geringer Distanz gegenüber austretendem Stickstoff zu minimieren. Stickstoff sollte stets unter Durchführung dieses Verfahrens entnommen werden.

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In diesem Video-Artikel präsentieren wir Ihnen eine Schritt-für-Schritt-Demonstration von Möglichkeiten zur Sammlung und Kryokonservierung Hamster-Oozyten mit hoher post-Tau-Überlebensraten. Das gleiche Verfahren kann auch angewendet werden, um erfolgreich einfrieren und auftauen Maus-Embryonen in verschiedenen Stadien der Präimplantationsdiagnostik Entwicklung sein.

Sammlung und Kryokonservierung von Oozyten Hamster und Maus Embryonen

Präimplantationsdiagnostik Embryonen können nach der Platzierung in eine hypertonische Lösung kryoprotektive kryokonserviert werden, um zelluläre Dehydratation führen. Nach Äquilibrierung, ist die Bildung von Eiskristallen in der Lösung um den Embryo induziert. Die weitere Entwässerung erfolgt wie der Embryo wird langsam auf Temperaturen unter Null vor dem Eintauchen in flüssigen Stickstoff für die Lagerung gekühlt.

Kryokonservierung von Präimplantationsembryonen von Rindern, Schafen und Ziegen

Hier zeigen wir den neu entwickelten I • Cryo-Kit für Mausspermien Kryokonservierung. Zwei-Zell-Stadium der Embryonalentwicklung mit aufgetauten Sperma wurde konsequent in 5 Mausstämme mit dem Einsatz dieses Kits verbessert. Über einen 1,5 Jahre Zeitraum wurden 49 genetisch veränderte Mauslinien durch Spermien Kryokonservierung mit dem I • Cryo-Kit archiviert und später erfolgreich durch IVF gewonnen.

Maus Sperma Kryokonservierung und Recovery mit der I · Cryo-Kit

In diesem Video beschreiben wir das Verfahren zur Vitrifizierung von entnommenen Kaninchenembryonen im gewünschten Entwicklungsstadium unter Verwendung von Ethylenglykol und Dimethylsulfoxid als Kryoprotektiva und kryogenem Stroh als Trägersystem. Die vitrifizierten Embryonen haben eine hohe Überlebensrate und können über einen längeren Zeitraum bis zur Verwendung gelagert werden.

Vitrifizierung von Kaninchenembryonen mit kryogenem Strohhalm: eine ultraschnelle Kühltechnik zur Konservierung von Kaninchenembryonen für die Langzeitlagerung

Dieses Video zeigt das Verfahren zum Auftauen von vitrifizierten Kaninchenembryonen und die vorsorglichen Messschritte für eine optimale Embryonenrückgewinnung.

Auftauen von Kaninchenembryonen: Ein Erwärmendes Verfahren zur Gewinnung kryokonservierter Kaninchenembryonen für den Embryotransfer

Utero-Eileiter-Embryo-Transfer verwendet die utero-Eileiter-Kreuzung als Barriere, um den Embryo Abfluss, die bei der Durchführung von Uterus Übertragung auftreten können, zu verhindern. Vasektomierten Männchen sind erforderlich, um pseudo-Empfänger für Embryotransfer erhalten. Beide Techniken werden diskutiert.

Utero-Tubenembryotransfer und Vasektomie im Maus-Modell

MicroSecure Vitrification wurde als nicht-kommerzielles, aseptisches, geschlossenes Vitrifikationssystem entwickelt, das den guten Herstellungs- und Gewebehandhabungspraktiken der FDA entspricht. Aufgrund der Rücknahme von hydrophoben verstopften Embryonalhalmen aus der Industrie wurde das Vitrifikationsverfahren dahingehend geändert, dass eine innere Versiegelung vor dem standardmäßigen internen Baumwollstopfen vorgesehen ist.

Modifizierte MicroSecure Vitrifikation: Eine sichere, einfache und sehr effektive Kryokonservierung Verfahren für Human Blastozysten

Die assistierten Reproduktionstechniken (ARTs) werden kontinuierlich bewertet, um die Ergebnisse zu verbessern und die damit verbundenen Risiken zu reduzieren. Dieses Manuskript beschreibt ein minimal-invasives Embryotransfer-Verfahren mit einem effizienten Kryokonservierungsprotokoll, das die Verwendung von Kaninchen als ideales Tiermodell der menschlichen Fortpflanzung ermöglicht.

Minimal invasiven Embryotransfer und Embryo-Vitrifizierung auf der Optimal-Botn-Bühne im Kaninchenmodell

Hier präsentieren wir ein Time-Lapse morphometrische-Protokoll, um die Intensität der Blastozyste Schrumpfung und Re-Expansion während Previtrification Interventionen und Post-wärmende Erholung folgen. Die Anwendung des Protokolls ist möglich in in-vitro- Befruchtung Labors mit Zeitraffer Mikroskopen ausgestattet und wird bei der Entwicklung einer optimalen Blastozyste-Verglasung-Methode empfohlen.

Morphometrische Protokoll für die objektive Beurteilung der Blastozyste Verhalten während der Verglasung und wärmenden Schritte

Hier stellen wir eine modifizierte Methode zur Kryokonservierung von Einzellembryonen sowie ein Protokoll vor, das die Verwendung von gefriergetauten Embryonen und Elektroporation für die effiziente Erzeugung genetisch veränderter Mäuse koppelt.

Verwendung von gefriergetauten Embryonen für die hocheffiziente Produktion von gentechnisch veränderten Mäusen

Hier stellen wir das Spatel-Montevideo-Protokoll für die Vitrifizierung von Präimplantationsembryonen von Mäusen und Schafen vor, das aus einem hausgemachten Spatel und der Verwendung hausgemachter Lösungen besteht. Die Embryonen werden schnell in zwei Kryoprotektiva-Lösungen mit zunehmender Konzentration äquilibriert, auf den Spatel geladen, in flüssigen Stickstoff getaucht und schließlich mit einem 0,5-ml-Strohhalm versiegelt.

Spatel Montevideo Gerät für die Vitrifizierung von Säugetierembryonen

Erfahren Sie eine Ethylenglykol-basierte Vitrifikationsmethode zur Kryokonservierung von Maus-Embryonen mit Überlebensraten über 90%. Diese Technik minimiert embryotoxische Effekte und eignet sich für verschiedene Mausstämme.

Kryokonservierung von Maus Embryonen durch Ethylen-Glykol-Based Vitrification

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