Kryokonservierung von Maus Embryonen durch Ethylen-Glykol-Based Vitrification

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Mausembryonen in flüssigem Stickstoff zu kryokonservieren und für die Gewinnung lebender Mäuse aufzutauen. Dies wird erreicht, indem Mausembryonen zunächst in Äquilibrierungsmedium getaucht, in einem Kryoröhrchen in Vitrifikationsmedium überführt und dann in einen Flüssigstickstofftank gegeben werden. Spätere Embryonen können in einem hochosmotischen Medium aufgetaut und in Kulturmedium inkubiert werden, bis sie in Empfängerweibchen übertragen werden.

Letztendlich zeigen die Ergebnisse ein Überleben von mehr als 90% der Embryonen nach dem Auftauen der Vitrifikation und eine Geburtenrate zwischen 30 und 70% nach dem Embryotransfer. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das durchlässige Kryoprotektivum Glykol für Embryonen weniger toxisch ist als herkömmliches Kryoprotektivum. Das Verfahren wird von einem Techniker aus meinem Labor demonstriert, bevor mit diesem Protokoll begonnen wird.

Bereiten Sie zweizellige Mausembryonen in Kultur, die durch natürliche Paarung oder konventionelle IVF-Techniken gewonnen wurden, für die eventuelle Lagerung in ein Kryoröhrchen vor und fügen Sie 50 Mikroliter Embryo-Einfrierlösung EF S 40 hinzu. Bereiten Sie dann eine 35 Millimeter oder 60 Millimeter große Petrischale aus Kunststoff mit 50 Mikrolitern Raumtemperatur vor. EFS 20.

Verwenden Sie eine Glaskapillare, um bis zu 30 Embryonen in die Schale zu übertragen. Achten Sie darauf, dass Sie das Kulturmedium nicht übertragen. Um die Dehydrierung der Embryonen zu gewährleisten, legen Sie sie in den Boden des Tropfens.

Nach etwa 60 bis 90 Sekunden entnehmen Sie mit einem Kapillarröhrchen dehydrierte Embryonen. Mit einer geschrumpften Morphologie. Bringen Sie diese Embryonen in die EFS-Lösung im Kryoröhrchen und übertragen Sie so wenig EFS 20 wie möglich.

Sobald die Embryonen übertragen sind, lassen Sie sie eine Minute lang im EFS 40 ruhen, bevor Sie sie in flüssigem Stickstoff einfrieren. Vor dem Auftauen der Embryonen werden mindestens zwei Tropfen 10 Mikroliter Embryokulturmedium mit hoher Osmolarität, wie z. B. M 16-Medium, in eine Kulturschale gegeben. Bedecken Sie dann die Tropfen vollständig mit Silikon oder Mineralöl und stellen Sie die Schale bis zur Verwendung in einen Kohlendioxid-Inkubator.

Erwärmen Sie anschließend die TS one-Lösung auf 37 Grad Celsius, während Sie eine Gesichtsmaske und Kryohandschuhe tragen. Entnehmen Sie die Embryonen aus dem Flüssigstickstofftank. Öffnen Sie nun schnell das Kryoröhrchen und entsorgen Sie den flüssigen Stickstoff in den Tank oder einen geeigneten Behälter.

Warten Sie dann 30 Sekunden. Geben Sie nun 850 Mikroliter warme TS one Lösung in das Kryoröhrchen. Saugen Sie die Lösung vorsichtig auf und werfen Sie sie etwa 10 Mal ab, damit sie sich gleichmäßig auflöst.

Übertragen Sie dann das gesamte Volumen in eine 60 Millimeter große Petrischale aus Kunststoff. Oder beobachten Sie, wie Sie drei Minuten warten, bis sich die Embryonen auf Raumtemperatur ausballibriert haben, wo sie für den Rest des Eingriffs bleiben sollten. Verwenden Sie kein Wärmegerät.

Untersuchen Sie schnell die Embryonen in der Schale unter einem Stereomikroskop, um zu erfahren, wie sie zu Beginn dieser Inkubation aussehen. Nach etwa zwei Minuten Inkubation versenken Sie die Embryonen, indem Sie die Schale vorsichtig schütteln, bis das Medium auf der Oberfläche der Schale verteilt ist. In der letzten Minute der Inkubation drei separate 50-Mikroliter-Tropfen TS-Zwei-Lösung in eine Schale ausstoßen.

Wenn die drei Minuten vorbei sind, bestätige mit einem Stereomikroskop, dass die Embryonen leicht geschrumpft sind. Wenn die Embryonen noch geschwollen sind, setzen Sie die Inkubation für ein bis drei weitere Minuten fort. Nehmen Sie nun die Embryonen mit einer Glaskapillare auf und übertragen Sie sie auf den ersten Tropfen TS two.

Warten Sie drei Minuten und übertragen Sie die Embryonen auf den zweiten Tropfen. Gefolgt vom dritten Tropfen. Nehmen Sie schließlich die vorbereitete Embryomedienschale, die im Inkubator aufbewahrt wird, und verwenden Sie eine Glaskapillare, um die Embryonen in den ersten Tropfen des Mediums zu übertragen.

Bei der Untersuchung unter einem Stereoskop sollten die Embryonen langsam ihre normale Morphologie wiedererlangen. Stellen Sie die Schale nun für ca. 10 Minuten wieder in den Inkubator. Dann zum Auswaschen der Saccharose, die von TS zwei mitgebracht wurde.

Bringen Sie die Embryonen in den nächsten Tropfen Kultursubstrat. Kultivieren Sie die Embryonen weiter im CO2-Inkubator, bis sie in den uc der Empfängerweibchen übertragen werden. Nach der Vitrifizierung und Gewinnung von 300 bis 480 Embryonen von drei verschiedenen Mausstämmen war die Überlebensrate sehr hoch.

Nach dem Auftauen lag der Anteil der Embryonen mit normaler Morphologie zwischen 93 und 99 %, und von diesen Embryonen entwickelten sich mindestens 84 % zu Blastenzysten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Leckstickstoff äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen, um direkten Kontakt zu vermeiden und die Exposition gegenüber Lecks über kurze Entfernungen zu minimieren. Stickstoff sollte immer durch die Durchführung dieses Verfahrens entnommen werden.