Modifizierte MicroSecure Vitrifikation: Eine sichere, einfache und sehr effektive Kryokonservierung Verfahren für Human Blastozysten

Das übergeordnete Ziel der MicroSecure-Methode zur Vitrifizierung von Embryonen ist es, ein sicheres, einfaches, aber effektives aseptisches geschlossenes Vitrifikationsverfahren für menschliche Embryonen bereitzustellen. Diese Methode wurde entwickelt, um die Qualitätskontrollvariablen bei der Vitrifikation menschlicher Embryonen zu minimieren und so einen zuverlässigen und reproduzierbaren Erfolg zu gewährleisten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie darauf abzielt, technische Unterschiede zwischen Biologen und Laboratorien zu beseitigen.

Unsere Technik ist so einfach durchzuführen, dass wir feststellen, dass die größte Herausforderung für unsere Auszubildenden darin besteht, zu lernen, wie man Embryonen pipetiert, ohne sie zu verlieren. Die Idee hinter unserer Methode war es, den Bedarf an speziellen Geräten zu eliminieren, indem zwei häufig verwendete FDA-zugelassene Artikel angepasst wurden. Ein intern etikettierter Ionomer-Vorratshalm und ein steriles Flexipet.

visuelle Demonstration dieser Technik ist äußerst hilfreich, da sie die grundlegenden Tipps hervorhebt, die eine erfolgreiche Anwendung gewährleisten. Legen Sie vor Beginn des Eingriffs den sterilen 0,3-ml-Samenstrohhalm auf die Teflonoberfläche der Elektrode eines einfachen Tisch-Impulsversiegelungsgeräts, direkt vor dem Stopfen, um eine interne Versiegelung zu erzeugen. Drücken Sie den Griff, um die Heizung zu aktivieren, und lassen Sie den Griff los, wenn das rote Licht ausgeschaltet ist und ein Piepton zu hören ist.

Schieben Sie dann den Wattestopfen nach vorne gegen die innere Dichtung, bevor Sie die Einrichtung abschließen. Für die Kryoverdünnung und Blastozystenbeladung der Proben nehmen Sie die Patientenkulturschale aus dem Inkubator und bestätigen Sie alle Probenidentifikationen mit einer Sekundärquelle. Unter einem Stereomikroskop wird ein Vitrifikationsflexipet, das als Vit-Spitze bezeichnet wird, verwendet, um die Blastozysten in einzelne Haltetröpfchen in der obersten Reihe einer entsprechenden Kryoschale zu bewegen.

Füllen Sie anschließend das Flexipet mit 3 Mikrolitern V1-Lösung vor und geben Sie die Hälfte des Inhalts auf den ersten Embryo. Aspirieren Sie den Embryo und übertragen Sie ihn auf das erste V1-Waschtröpfchen. Pipettieren Sie dann den Embryo zwei- bis dreimal um den Rand des Tröpfchens herum und entfernen Sie den restlichen Pipetteninhalt außerhalb des Tröpfchens auf die Oberfläche der Schale.

Bewegen Sie dann die Blastozyste in einen einzelnen V1-Haltetropfen und laden Sie die V-Spitze mit der nächsten V2-Lösung vor, bevor Sie die zusätzlichen Embryonen mit einer neuen V-Spitze pipettieren. Nachdem Sie alle Blastozysten in den V2- und V3-Tröpfchen gewaschen haben, wie gerade gezeigt, entfernen Sie die restliche Lösung und die Blasen von der V-Spitze außerhalb des V3-Haltetröpfchens und füllen Sie die Spitze vollständig mit sauberer V3-Lösung aus der Umgebung des ersten Embryos. Stoßen Sie etwa 1 Mikroliter des Volumens aus und aspirieren Sie die Blastozyste und die restliche V3-Lösung vollständig in die Vit-Spitze.

Entfernen Sie nun die Spitze aus der Pipette und trocknen Sie mit einem sterilen Mullpad die restliche V3-Lösung von der Außenfläche der Vit-Spitze. Das Trocknen der Außenseite der Spitze ist entscheidend und birgt kein zusätzliches Risiko des Embryoverlusts. Führen Sie dann das Spitzenende zuerst in das offene Ende des vorversiegelten Strohhalms ein und drehen Sie den Strohhalm mit dem Etikettenende nach unten um.

Beobachten Sie die Spitze am inneren Stecker. Lassen Sie am offenen Ende einen Luftraum von 1 cm und schweißen Sie ihn dann sicher zu. Wenn alle Halme versiegelt sind, tauchen Sie sie direkt in flüssigen Stickstoff in einen Dewargefäß aus Edelstahl und bewahren Sie die Halme in dem offenen Becher auf, der am Stock des Patienten befestigt ist.

Für die Elution und Verdünnung der Kryolösung stellen Sie die entsprechende Verdünnungsschale mit sechs Vertiefungen in die Mitte eines Stereomikroskoptisches und eine 60-mm-Petrischale mit einem 37 Grad Celsius heißen Saccharose-Warmhaltebad auf eine Seite des Mikroskops. Isolieren Sie als Nächstes den zu erwärmenden Strohhalm und halten Sie die obere Strohhalmdichtung über den Flüssigkeitsspiegel, um die Identität der Probe zu bestätigen. Befestigen Sie den Strohhalm mit einer Mayo-Schere unter dem internen Stopfen, um die Vit-Spitze im flüssigen Stickstoff zu halten.

Klopfen Sie mit der Schere mehrmals fest gegen den Dewargefäß, um die Spitze aus der inneren Seitenwand des Strohhalms zu lösen, und heben Sie den Strohhalm in horizontaler Ausrichtung neben oder unter der Stereoskopoberfläche in die Umgebungsluft. Fassen Sie das unbeschriftete Ende des Strohhalms und schneiden Sie den Strohhalm am inneren Stöpsel ab. Heben Sie dann den Strohhalm über die wärmende Badeschale und gießen Sie die Vit-Spitze in einem 60-Grad-Winkel in die Badewanne, bis die Spitze vollständig extrudiert ist.

Der Boden des Flexipets sollte über der Seitenwand der Schüssel aufliegen. Übertragen Sie die Pipettenbasis nach 5 bis 10 Sekunden in ein Microcap-Pipettiergerät. Starten Sie einen Fünf-Minuten-Timer.

Während Sie das Mikroskop betrachten, bedecken Sie das Bulbusloch mit einem Zeigefinger und drücken Sie die Bulb vorsichtig zusammen, um die vitrifizierte Blastozyste aus der Vit-Spitze in die T1-Wäsche freizusetzen. Nachdem Sie die Freisetzung der Blastozyste bestätigt haben, reinigen Sie die restliche V3-Lösung und die Blasen durch Überdruck und evakuieren Sie den Inhalt in die Mitte einer unbenutzten Entwurfwanne. Übertragen Sie die Vit-Spitze auf eine Sterberpipette und bewegen Sie den Embryo für die restlichen vier Minuten in das zweite T1-Tröpfchen unter Öl.

Füllen Sie das Flexipet während der Inkubation mit der nächsten Lösung vor und verdünnen Sie dann die Blastozyste in den Tröpfchen T2, 3 und 4 im Abstand von drei Minuten. Zum Schluss äquilibrieren Sie die Blastozysten im T5-Tröpfchen fünf Minuten lang auf einer 37 Grad Celsius heißen Oberfläche, bevor Sie sie in den Inkubator zurückbringen. Das modifizierte Gardner-Blastozysten-Einstufungssystem geht davon aus, dass vollständige Blastozysten eine Herniation der Trophektodermzellen von weniger als 10 % aufweisen, während Blastozysten mit einer Herniation von bis zu 50 % als expandiert eingestuft werden.

Blastozysten, die eine Herniation von mehr als 50 % aufweisen, gelten als schlüpfend. Mit den demonstrierten Kryokonservierungs- und Erwärmungsmethoden wurden durchweg hohe Raten an Lebendgeburten pro Zyklusstart erreicht, mit oder ohne genetische Präimplantationstests. Obwohl diese Erfolge mit vorselektierten euploiden Blastozysten deutlich höher sind.

Bei der Bewertung einer guten Prognose der Patientenpopulation allein für kryokonservierte Zyklen zeigen diese Daten zum Transfer von gefrorenen Embryonen bessere Erfolgsraten als der nationale Durchschnitt sowohl für die Einnistungs- als auch für die Lebendgeburtenraten um über 30 %. Durch den Transfer von überwiegend einzelnen genetisch getesteten euploiden vitrifizierten Blastozysten gehören dies zu den höchsten Einnistungsraten und Lebendgeburtenraten in den Vereinigten Staaten. unabhängig vom Alter, wurden erreicht, verglichen mit den jüngsten nationalen Statistiken, die vom Center for Disease Control für zwei andere angesehene Fruchtbarkeitskliniken veröffentlicht wurden, und den von der Society for Assisted Reproductive Technologies veröffentlichten Daten. Die MicroSecure-Vitrifikation ist ein neuartiges aseptisches Verfahren, das im Hinblick auf technische Einfachheit, Zuverlässigkeit und Kryosicherheit entwickelt wurde. Dieses einfache, nicht-kommerzielle Vitrifikationssystem bietet eine hocheffektive, kostengünstige Alternative zu Vitrifikationsgeräten.

Seit ihrer Entwicklung hat die MicroSecure-Methode eine Embryogenesung von über 99,9 % und ein vollständiges Überleben der Blastozysten von über 95 % gewährleistet. Dies hat es ermöglicht, dass unsere klinische Praxis in den letzten drei Jahren auf nahezu alle kryokonservierten Embyro-Transferzyklen umgestellt wurde. Wir haben unser Verfahren effektiv dahingehend modifiziert, dass eine innere Dichtung vor dem Wattestopfen von ionomeren Samenhalmen angebracht ist, um immer noch zuverlässige Schweißnähte und hervorragende Ergebnisse nach der Erwärmung zu erzielen.

Es gibt viele verschiedene Gerätesysteme, die heute in der assistiven Reproduktionstechnologie eingesetzt werden, aber kein anderes Gerät bietet die Einfachheit und technische Wiederholbarkeit, um Benutzervariationen im Wesentlichen zu eliminieren und optimierte Sicherheit zu bieten, wie die MicroSecure-Vitrifikation.