Maus Sperma Kryokonservierung und Recovery mit der I · Cryo-Kit

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Kryokonservierung von Mausspermien. Dies wird erreicht, indem zunächst Spermien von Maus-EPIs mit Kryo-Konservierungshalmen gesammelt werden. Die Strohhalme werden dann in flüssigem Stickstoff eingefroren, wo sie gelagert werden, bis sie durch Auftauen in warmem Wasser zurückgewonnen werden.

Die gewonnenen Mausspermien werden schließlich für die In-vitro-Fertilisation verwendet. Der Hauptvorteil dieses Kits gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass das Kit alle notwendigen Materialien enthält, die zur Kryokonservierung und Rückgewinnung von Mausspermien benötigt werden. Im Allgemeinen können Personen, die neu in dieser Methode sind, beim Hantieren und Laden von Strohhalmen ersticken. Beginnen Sie mit dem Zusammenstellen von 15 Kryokonservierungshalmen für Spermien pro Linie von Mäusen, die kryokonserviert werden sollen.

Verbinden Sie zunächst jeden 0,25-Milliliter-Strohhalm mit einer Ein-Milliliter-Spritze, wobei der Wattestopfen der Spritze am nächsten ist. Zweitens: Füllen Sie acht Zentimeter IVF-Medium in jeden Strohhalm, gefolgt von einem Zentimeter Luft. Drittens: Beschriften Sie jeden der 15 Halme mit dem Namen der Linie, die für jede zu kryokonservierende Linie aufbewahrt werden soll.

Füllen Sie eine Vertiefung einer Vier-Well-Schale mit 240 Mikrolitern Kryo-Schutzmittel. Befestigen Sie eine Ein-Milliliter-Pipette am Griff des Gefrierbehälters, um den Griff zu verlängern. Füllen Sie zuletzt die mit dem Kit gelieferte Schaumstoff-Isolierbox mit 15 Zentimetern flüssigem Stickstoff und schließen Sie den Deckel, um einzuschläfern.

Zwei fruchtbare erwachsene männliche Mäuse. Für jede Linie, die kryokonserviert und chirurgisch werden soll, entfernen Sie ihre codalen EPIs. Platzieren Sie die Maus in der dorsalen Recu und öffnen Sie die ventrale Körperwand.

Ziehen Sie sanft an der großen Ehrerbietung und entfernen Sie überschüssiges Fett. Lokalisieren Sie als Nächstes den Nebenhoden und entfernen Sie ihn intakt mit einem kleinen Stück schneller Ehrerbietung. Legen Sie die EPIs in eine Vertiefung der vorbereiteten Vier-Well-Schale, die mit CPA unter einem Präparierfernrohr beladen ist.

Machen Sie fünf bis sieben Längsschnitte in jedem Nebenhoden. Drücken Sie dann mit einer Pinzette vorsichtig auf jede schnelle Differenz. Um das Sperma herauszudrücken, inkubieren Sie die Mischung aus CPA und Nebenhoden drei bis fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.

Rühren Sie das Gericht während der Inkubation zwei- bis dreimal vorsichtig mit der Hand um. Dies ermöglicht es den Spermien, durch Aspiration herauszuschwimmen. Beladen Sie jeden vorbereiteten Strohhalm mit fünf Millimetern der Spermiensuspension, gefolgt von einem Zentimeter Luft.

Für den Gefrierprozess ist es wichtig, dass alle Strohhalme gleichmäßig beladen werden. Nachdem Sie alle 15 Strohhalme geladen haben, verschließen Sie vorsichtig beide Enden jedes Strohhalms. Um das Überleben der Spermien zu gewährleisten, schließen Sie den Vorgang für alle 15 Halme innerhalb von 10 Minuten ab.

Sobald alle Strohhalme vorbereitet sind, lade sie in die Spermiensäule des Gefrierbehälters. Legen Sie zuerst den Kanister in die Schaumstoffbox und lassen Sie ihn senkrecht im flüssigen Stickstoff schwimmen. Für 10 Minuten muss der Kanister vertikal schwimmen, sonst wird die Gefrierrate der Spermien beeinflusst.

Tauchen Sie dann den Kanister in den flüssigen Stickstoff. Das Sperma ist somit kryokonserviert und bereit für die Langzeitlagerung von flüssigem Stickstoff. Etwa 60 Stunden vor einer geplanten Spermiengewinnung.

Befolgen Sie das schriftliche Protokoll für den Supereisprung von Frauen vor der IVF. Für jeden Strohhalm, der aufgetaut werden soll, alle Medien vorbereiten und mindestens eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid äquilibrieren. Zu diesen Materialien gehört eine 35-Millimeter-Petrischale mit einem 90-Mikroliter-Tropfen Spermienbehandlungsmedium, das mit Öl bedeckt ist.

Eine 35-Millimeter-Petrischale mit drei Millilitern IVF-Medium, die als Schneideschale dient und pro fünf superovulierte Frauen eine IVF-Schale zubereitet, die eine Vertiefung einer Vier-Well-Schale ist, die mit 500 Mikrolitern IVF-Medium beladen ist. Bereiten Sie für jede IVF-Schale eine Waschschale vor, bei der es sich um eine 35-Millimeter-Petrischalen mit drei Millilitern KSOM handelt, und eine Embryokulturschale, eine 35-Millimeter-Petrischale, bei der es sich um eine 35-Millimeter-Petrischale handelt, in der 50 Mikroliter KSOM-Medium mit Öl bedeckt sind. Wenn Sie alle erforderlichen Materialien vorbereitet haben, nehmen Sie schnell einen Strohhalm aus dem Lager und legen Sie ihn für zwei bis drei Minuten in ein 37 Grad Celsius warmes Wasserbad.

Trocknen Sie den Strohhalm ab. Machen Sie dann einen schrägen Schnitt in der Luftsäule unterhalb des Watteplugs. Machen Sie am anderen Ende des Strohhalms einen weiteren schrägen Schnitt über eine andere Luftsäule.

Vermeide es, die Spermiensäule zu durchtrennen. Aspirieren Sie nun die Spermiensuspension mit einer 200-Mikroliter-Pipette aus dem Ende des Strohhalms und legen Sie sie in der Mitte des Spermienbehandlungsmediums ab. Tropfen. Dann das Gericht 45 bis 60 Minuten lang inkubieren.

Isolieren Sie während der Spermieninkubation die UCS der superovulierten Weibchen und geben Sie sie in die Steckschale. Verwenden Sie eine 30-Gauge-Nadel oder eine Pinzette, um jeden Eileiter zu zerreißen und die Kumuluszyt-Komplexe freizusetzen. Übertragen Sie die C Cs von fünf Frauen in jede IVF.

Nun, mit einem Minimum an Medien. Vermeiden Sie die Übertragung von Fett und Blut, da verschmutzte Medien die Befruchtungseffizienz beeinträchtigen. Sammeln Sie nach der Inkubation 10 bis 15 Mikroliter der Spermiensuspension aus der Peripherie des STM-Tropfens und geben Sie die Suspension in eine IVF.

Nun, jetzt co-kulturieren Sie die Zellen für vier bis sechs Stunden für die Befruchtung. Nach der Befruchtung durchlaufen Sie die Embryonen mindestens 2K SOM-Waschungen in der Spülschüssel. Dann Kultur.

Die Embryonen befinden sich in KSOM, bis das gewünschte Entwicklungsstadium erreicht ist. Spermien von fünf Inzuchtmausstämmen aus dem Charles River wurden eingefroren. Die Schutzverhältnisse der Spermienmotilität und der schnell fortschreitenden Motilität reichten von 81 % bis 47 % bei fünf Stämmen dieser Spermien.

Die IVF-Raten mit gefrorenen, aufgetauten Spermien schwankten in verschiedenen Stämmen zwischen 26 und 88% über eineinhalb Jahre. Insgesamt wurden 49 gentechnisch veränderte Mauslinien durch Kryokonservierung von Spermien archiviert und später durch IVF in vier verschiedenen weiblichen Stämmen wiederhergestellt. C 57 black, six BC DBA one und 1 29 SV Einmal gemeistert, kann die Kryokonservierungstechnik für Spermien in 30 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Für dieses Verfahren ist es wichtig, vertikal in den Kanister zu fließen und flüssigen Stickstoff zu erzeugen.