Maus Sperma Kryokonservierung und Recovery mit der I · Cryo-Kit
12. Dezember 2011
Hier zeigen wir den neu entwickelten I • Cryo-Kit für Mausspermien Kryokonservierung. Zwei-Zell-Stadium der Embryonalentwicklung mit aufgetauten Sperma wurde konsequent in 5 Mausstämme mit dem Einsatz dieses Kits verbessert. Über einen 1,5 Jahre Zeitraum wurden 49 genetisch veränderte Mauslinien durch Spermien Kryokonservierung mit dem I • Cryo-Kit archiviert und später erfolgreich durch IVF gewonnen.
Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Mäusesperma einzufrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Sperma aus Mäuse-EPIs unter Verwendung von Kryokonservierungsrohrchen gesammelt wird. Die Röhrchen werden anschließend in flüssigem Stickstoff eingefroren und dort gelagert, bis sie durch Auftauen in warmem Wasser wiederhergestellt werden.
Die gewonnenen Mausspermien werden letztendlich für die In-vitro-Fertilisation verwendet. Der Hauptvorteil dieses Kits im Vergleich zu bestehenden Methoden liegt darin, dass es alle notwendigen Materialien zur Kryokonservierung und Wiedergewinnung von Mausspermien enthält. In der Regel haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten beim Handhaben und Befüllen der Strohhalme. Beginnen Sie damit, 15 Spermien-Kryokonservierungs-Strohhalme pro Mauslinie vorzubereiten, die kryokonserviert werden soll.
Verbinden Sie zunächst jeden 0,25-Milliliter-Strohhalm mit einer Ein-Milliliter-Spritze, wobei der Wattepfropfen am nächsten zur Spritze liegt. Laden Sie danach acht Zentimeter IVF-Medium in jeden Strohhalm, gefolgt von einem Zentimeter Luft. Kennzeichnen Sie anschließend jeden der 15 Strohhalme mit dem Namen der Linie, die für jede zu kryokonservierende Linie erhalten werden soll.
Füllen Sie eine Vertiefung einer Vier-Vertiefungs-Schale mit 240 Mikrolitern kryoschützendem Mittel. Bringen Sie eine Ein-Milliliter-Pipette am Griff des Gefriermessings an, um diesen zu verlängern. Füllen Sie schließlich die mit dem Kit bereitgestellte schaumstoffisolierte Box mit 15 Zentimetern flüssigem Stickstoff und schließen Sie den Deckel.
Zwei fruchtbare erwachsene männliche Mäuse. Entfernen Sie für jede zu kryokonservierende Linie chirurgisch deren kaudalen EPIs. Legen Sie die Maus in dorsale Rekumbenz und öffnen Sie die ventrale Körperwand.
Ziehen Sie vorsichtig am großen Samenstrang und entfernen Sie überschüssiges Fett. Suchen Sie danach den Nebenhoden und entfernen Sie ihn zusammen mit einem kleinen Stück des kurzen Samenstrangs vollständig. Geben Sie die EPIs in eine Vertiefung der vorbereiteten Vier-Vertiefungs-Schale, die mit CPA gefüllt ist, unter dem Stereomikroskop.
Führen Sie fünf bis sieben Längsschnitte in jedem Nebenhoden durch. Drücken Sie dann mit einer Pinzette vorsichtig jeden Schnittabschnitt aus, um die Spermien herauszudrücken. Inkubieren Sie die Mischung aus Kälteschutzmittel und Nebenhoden bei Raumtemperatur für drei bis fünf Minuten.
Bewegen Sie die Schale während der Inkubation von Hand sanft zwei bis drei Mal. Dadurch können die Spermien durch Aspiration austreten. Füllen Sie jedes vorbereitete Röhrchen mit fünf Millimetern der Spermien-Suspension, gefolgt von einem Zentimeter Luft.
Es ist wichtig für den Einfrierprozess, dass alle Strohhalme gleichmäßig befüllt werden. Nachdem alle 15 Strohhalme befüllt sind, sorgfältig beide Enden jedes Strohhalms verschweißen. Um das Überleben der Spermien sicherzustellen, den gesamten Vorgang für alle 15 Strohhalme innerhalb von 10 Minuten abschließen.
Nachdem alle Strohhalme vorbereitet wurden, laden Sie sie in die Spermakolonne des Einfrierbehälters. Stellen Sie zunächst den Behälter in die Schaumstoffbox und lassen Sie ihn senkrecht im flüssigen Stickstoff schwimmen. Der Behälter muss 10 Minuten lang senkrecht schwimmen, da sonst die Einfriergeschwindigkeit der Spermien beeinträchtigt wird.
Danach das Gefäß in flüssigen Stickstoff tauchen. Die Spermien werden auf diese Weise kryokonserviert und sind bereit für die Langzeitlagerung in flüssigem Stickstoff. Ungefähr 60 Stunden vor einer geplanten Spermienentnahme.
Befolgen Sie die schriftliche Anleitung zur Superovulation von Weibchen vor der IVF. Für jeden aufzutauenden Strohhalm bereiten Sie alle Medien mindestens eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid vor und äquilibrieren Sie diese. Zu diesen Materialien gehört eine 35 Millimeter große Petrischale mit einem 90 Mikroliter großen Tropfen Spermiensuspensionsmedium, der mit Öl bedeckt ist.
Eine 35-Millimeter-Petri-Schale mit drei Millilitern IVF-Medium dient als Schneideschale. Pro fünf superovulierte Weibchen bereiten Sie eine IVF-Schale vor, die aus einem Brunnen einer Vier-Brillen-Schale mit 500 Mikrolitern IVF-Medium besteht. Für jede IVF-Schale bereiten Sie eine Waschschale vor, bestehend aus einer 35-Millimeter-Petri-Schale mit drei Millilitern KSOM, sowie eine Embryokulturschale, bestehend aus einer 35-Millimeter-Petri-Schale mit 50-Mikroliter-Tropfen KSOM-Medium, die mit Öl bedeckt sind. Nachdem alle erforderlichen Materialien vorbereitet sind, entnehmen Sie rasch einen Strohhalm aus der Lagerung und legen ihn für zwei bis drei Minuten in ein Wasserbad mit 37 Grad Celsius.
Trocknen Sie den Strohhalm ab. Dann führen Sie einen schrägen Schnitt in der Luftsäule unterhalb des Wattepfropfens durch. Am anderen Ende des Strohhalms führen Sie einen weiteren schrägen Schnitt über einer weiteren Luftsäule durch.
Vermeiden Sie es, die Spermienkolonne zu durchtrennen. Aspirieren Sie nun die Spermien-Suspension mit einer 200-Mikroliter-Pipette vom Ende des Strohhalmes und geben Sie sie in die Mitte des Spermienbehandlungsmediums ab. Anschließend inkubieren Sie die Petrischale 45 bis 60 Minuten lang.
Während der Spermieninkubation isolieren Sie die Uterus-Hornkanäle (ucs) der superovulierten Weibchen und überführen sie in die Schneidenschale. Benutzen Sie eine 30-Gauge-Nadel oder eine Pinzette, um jeden Eileiter aufzutrennen und so die Cumulus-Zell-Komplexe freizusetzen. Überführen Sie die CCs von fünf Weibchen in jedes IVF-Gerät.
Nun, mit einem minimalen Mediumsvolumen. Vermeiden Sie die Übertragung von Fett und Blut, da verunreinigtes Medium die Befruchtungseffizienz hemmt. Sammeln Sie nach der Inkubation 10 bis 15 Mikroliter der Spermien-Suspension vom Rand des STM-Tropfens und geben Sie die Suspension in eine IVF.
Ko-kultivieren Sie die Zellen nun vier bis sechs Stunden lang zur Befruchtung. Nach der Befruchtung lassen Sie die Embryonen mindestens zwei 2K-SOM-Waschungen in der Waschschale durchlaufen. Danach kultivieren.
Die Embryonen verbleiben in KSOM, bis der gewünschte Entwicklungsstadium erreicht ist. Spermien aus fünf inzüchtigen Mausstämmen von Charles River wurden eingefroren. Die Schutzraten für Spermienmotilität und rasch progressive Motilität lagen bei diesen Spermien über die fünf Stämme hinweg zwischen 81 % und 47 %.
Die IVF-Raten mit gefrorenen und aufgetauten Spermien variierten über eineinhalb Jahre hinweg zwischen verschiedenen Stämmen von 26 bis 88 %. Insgesamt wurden 49 gentechnisch modifizierte Mauslinien durch Spermienkryokonservierung archiviert und später mittels IVF in vier verschiedenen weiblichen Stämmen wiederhergestellt. C57BL/6, DBA/1 und 129/Sv. Sobald die Technik der Spermienkryokonservierung beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von 30 Minuten durchgeführt werden.
Für dieses Verfahren ist es wichtig, dass die Strömung vertikal zum Kolben und flüssigem Stickstoff erfolgt.
Übersicht
Diese Studie stellt das I•Cryo-Kit für die effektive Kryokonservierung von Mäusesperma vor und zeigt eine verbesserte Embryonalentwicklung bei mehreren Mausstämmen. Das Kit ermöglicht die Archivierung genetisch veränderter Mauslinien durch Kryokonservierung von Sperma und anschließende Wiederherstellung mittels IVF.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Reproduktionsbiologie
- Kryokonservierungstechniken
- In-vitro-Fertilisation (IVF)
Hintergrund
- Die Kryokonservierung von Mäusespermien ist entscheidend für die genetische Forschung.
- Bestehende Methoden weisen möglicherweise Mängel hinsichtlich Effizienz und Benutzerfreundlichkeit auf.
- Mit dem I•Cryo-Kit soll der Kryokonservierungsprozess vereinfacht werden.
- Eine erfolgreiche Gewinnung der Spermien ist für die Ergebnisse der In-vitro-Fertilisation unerlässlich.
Zweck der Studie
- Beurteilung der Wirksamkeit des I•Cryo-Kits zur Kryokonservierung von Mäusesperma.
- Beurteilung des Einflusses von kryokonserviertem Sperma auf die Embryonalentwicklung.
- Archivierung genetisch veränderter Mauslinien für zukünftige Forschungsvorhaben.
Verwendete Methoden
- Sammlung von Spermien aus dem Maus-Epididymis unter Verwendung von Kryokonservierungsrohrchen.
- Einfrieren der Spermien in flüssigem Stickstoff für die Langzeitlagerung.
- Auftauen der Spermien zur Verwendung in IVF-Verfahren.
- Beurteilung der Spermienmotilität und der IVF-Erfolgsraten über verschiedene Stämme hinweg.
Hauptergebnisse
- Verbesserte Embryonalentwicklung bei 5 Mausstämmen mit dem I•Cryo-Kit beobachtet.
- 49 genetisch veränderte Mauslinien erfolgreich archiviert und wiederhergestellt.
- Die Spermienbeweglichkeit lag zwischen 81 % und 47 % je nach Stamm.
- Die IVF-Raten lagen zwischen 26 % und 88 % mit eingefrorenem und aufgetautem Sperma.
Schlussfolgerungen
- Das I•Cryo-Kit verbessert die Effizienz der Spermakryokonservierung erheblich.
- Die erfolgreiche Wiederherstellung genetisch modifizierter Linien unterstreicht seine Nützlichkeit in der Forschung.
- Eine weitere Optimierung des Verfahrens kann die Bearbeitungszeit verkürzen.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Die Kryokonservierung von Maussperma bietet eine kostengünstige und skalierbare Lösung zur Archivierung genetisch veränderter Stämme, verringert die Abhängigkeit von lebenden Tierkolonien und mindert das Risiko des Verlusts von Linien. Das I•Cryo-Kit erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Stammkonservierung, indem es die Spermienmotilität nach dem Auftauen sowie die Entwicklung von IVF-embryonalen Stadien über mehrere inzüchtige Hintergründe hinweg verbessert. Dies unterstützt das strategische Portfolio-Management in der präklinischen Forschung, indem es eine zuverlässige Langzeitlagerung und bedarfsgerechte Wiederherstellung wertvoller Krankheitsmodelle ermöglicht.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die funktionelle Validierung genetischer Modelle, indem die Gewinnbarkeit von Spermien für die auf IVF basierende phänotypische Untersuchung sichergestellt wird.
- Operativer Wert: Verringert den Aufwand und die Kosten für die Tierhaltung, die mit der Aufrechterhaltung lebender Kolonien von Modellen mit geringer Durchsatzleistung oder induzierbaren Modellen verbunden sind.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Stellt eine standardisierte Spermienquelle für konsistente IVF-Assays bereit und unterstützt die reproduzierbare Bewertung von Substanzeffekten bei der Befruchtung und der frühen embryonalen Entwicklung.
- Operationaler Wert: Erleichtert die Bereitschaft für Assays durch kryokonservierte Spermien und eliminiert Variabilität durch Unterschiede zwischen Männchen oder zwischen Chargen bei der Gewinnung frischer Proben.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Bewahrt die genetische Integrität von Krankheitsmodellen über die Zeit hinweg und ermöglicht langfristige Studien sowie experimentelle Kontinuität über Generationen hinweg.
- Operationaler Wert: Unterstützt die Zusammenarbeit an mehreren Standorten, indem kryokonservierte Spermien statt lebender Tiere verteilt werden können, wodurch der Transportaufwand und biosicherheitsrelevante Bedenken verringert werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsworkflow von der frühen Modellerstellung bis zur präklinischen Validierung und dient als Brücke zwischen genetischer Ingenieurtechnik und funktioneller Phänotypisierung mittels IVF.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem die Wiedergewinnung von kryokonserviertem Sperma für die In-vitro-Fertilisation ermöglicht wird, wodurch die Auswirkungen genetischer Modifikationen auf Fruchtbarkeit und frühe Embryogenese bewertet werden können.
- Screening: Ermöglicht standardisierte, auf In-vitro-Fertilisation basierende Assays unter Verwendung aufgetauten Spermas und verbessert so die Reproduzierbarkeit bei der Beurteilung von Spermienfunktion, Kapazitation und Befruchtungsfähigkeit.
- Analytik: Erzeugt quantitative Messgrößen wie Spermienmotilität (% progressiv), schnell progressiv bewegliche Spermien und Raten der Embryonalentwicklung, die Entscheidungen über die Weiterentwicklung oder Einstellung eines Modells hinsichtlich dessen Stabilität unterstützen.
- Translationale Forschung: Verbindet genetische Modifikation mit Entwicklungsergebnissen, indem die In-vitro-Fertilisation mit kryokonserviertem Sperma ermöglicht wird und somit phänotypisches Screening, verknüpft mit Biomarkern, in präimplantatorischen Embryonen unterstützt wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Kryobank-Plattform für die kontinuierliche Archivierung und Wiederherstellung genetisch modifizierter Linien und reduziert so redundante Neuentwicklungen über verschiedene Projekte hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bezüglich der Modellerhaltung, indem eine verbesserte Beweglichkeit und Embryonalentwicklung im Vergleich zu grundlegenden CPA-Methoden nachgewiesen wird.
- Operationaler Wert: Standardisiert den Kryokonservierungs-Workflow durch komponentenbasierte Kits und verringert so die Variabilität zwischen Anwendern sowie die Schulungsdauer.
- Strategischer Wert: Senkt die langfristigen Kosten der Stammhaltung und reduziert das Risiko eines irreversiblen Verlusts von Linien aufgrund von Züchtungsfehlern, genetischem Drift oder pathogenen Ausbrüchen.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung genetisch modifizierter Linien für die Archivierung basierend auf ihrem strategischen Wert, bei gleichzeitig hoher Zuversicht in ihre zukünftige Rekultivierbarkeit.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert technische Sachkenntnis in der Sammlung von Spermien, der Handhabung von Strohhalmen und dem Heißversiegeln, um die Probenechtheit sicherzustellen.
- Hängt von Zugang zu flüssigem Stickstoff zur Lagerung und kontrollierten Auftaueinrichtungen (Wasserbad bei 37 °C) ab, um eine gleichbleibende Leistung nach dem Auftauen zu gewährleisten.
- Setzt standardisierte Kulturmedien für die In-vitro-Fertilisation und Superovulationsprotokolle voraus, um zuverlässige Befruchtungsergebnisse und Embryokulturbedingungen zu erzielen.
- Die Leistung kann je nach genetischem Hintergrund variieren, was eine stammspezifische Optimierung der Inkubations- und Waschschritte erforderlich macht.
- Eingeschränkt durch die Notwendigkeit fruchtbarer Weibchen und Fachkenntnisse in der In-vitro-Fertilisation zur Gewinnung der Spermien, wodurch die direkte Anwendung auf natürliche Paarungsassays begrenzt ist.
