Name: Maus Sperma Kryokonservierung und Recovery mit der I · Cryo-Kit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Erfahren Sie die Kryokonservierung von Mäusesperma mit dem I·Cryo-Kit für reproduktionsbiologische Forschung. Diese Methode ermöglicht die effiziente Archivierung genetisch modifizierter Mauslinien durch IVF.

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Die Forschung hier vorgestellte wurde von Charles River unterstützt. Die Autoren sind sehr dankbar, dass der gentechnisch veränderte Models and Services-Gruppe und der Embryologie Mitarbeiter für die Tierpflege und Hormon-Einspritzung.

1. Maus Spermien Kryokonservierung <ol><li> Für jede Zeile kryokonserviert werden, bereiten Sie die folgenden Punkte, bevor Anfang. <ol><li> 1 gut einer 4-Well Platte mit 240 l Kit CPA </li><li> 15 Samen Kryokonservierung Strohhalme wie folgt <ol><li> Schließen Sie das 0,25 ml Pailletten, die 1 ml Spritzen mit dem Wattebausch am nächsten an der Spritze. In jedem Strohhalm, Last 8 cm (ca. 160 ul) IVF-Medium, dann 1 cm Luft. Beschriften Sie die Strohhalme mit den Namen der Linie erhalten bleiben. </li></ol></li></ol></li><li> LN 2 sollte 15 cm tief in den Schaumstoff-Box werden. Schließen Sie den Deckel. </li><li> Euthanize 2 männliche Mäuse aus jeder Zeile zu kryokonserviert werden. Mäuse sollten zwischen 10 und 60 Wochen alt sein. Entfernen Sie die beiden kaudalen Nebenhoden zusammen mit der Samenleiter von jeder Maus. </li><li> Setzen Sie den Nebenhoden in die zuvor vorbereiteten CPA-haltigen Vertiefung einer 4-Well Schale (Schritt 1.1). </li><li> Machen Sie 5-7 Längsschnitte in jedem Nebenhoden und sanftSqueeze jedem Samenleiter Spermien verdrängen. </li><li> Schütteln Sie die CPA und Nebenhoden Mischung von Hand vorsichtig bei Raumtemperatur für 3-5 Minuten. Damit können Spermien schwimmen. </li><li> Mit dem zuvor vorbereiteten Stroh, absaugen 5 mm (ca. 10 ul) der Spermien Federung und dann 1 cm Luft. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang mit bis zu insgesamt 15 Strohhalme. Laden und Dichtung Strohhalme innerhalb von 10 Minuten für die besten Spermien überleben. </li><li> Heißsiegel beiden Seiten des Stroh sorgfältig. Legen Sie die Strohhalme in den Gefrierpunkt Kanister mit dem Sperma Säule zuerst. </li><li> Bringen Sie die 1 ml Pipette als Teil des Kits zu den Kanister mit dem Griff erstrecken. Setzen Sie den Kanister in LN 2 in der Schaum-Box durch das Loch in den Deckel. Lassen Sie den Kanister vertikal Schwimmer in der LN 2 für 10 Minuten. </li><li> Tauchen Sie den Kanister in das LN2. Das Sperma wird nun kryokonserviert und können zu langfristigen LN 2-Speicherung verschoben werden. </li><li> Der Behälter sollte nicht verwendet werden fürdie nächste Zeile, bis es sich auf Raumtemperatur erwärmt. </li></ol> 2. Maus Superovulation <ol><li> Im Allgemeinen benutzen jungen weiblichen Mäusen des gleichen Hintergrund wie der Samenspender. </li><li> Mäuse sollten ~ 12 g (3-4 Wochen alt) werden. </li><li> Führen Sie eine intraperitoneale Injektion mit 5-10 IE Pregnant mare serum-Gonadotropin (PMSG). </li><li> Warten Sie 46-48 Stunden. </li><li> Führen Sie eine intraperitoneale Injektion mit 5-10 IU humanes Chorion-Gonadotropin (hCG). </li><li> Ernte-Oozyten 14-16 h nach hCG-Injektion, wie unten beschrieben. </li></ol> 3. Mausspermien Erholung und IVF <ol><li> Vor IVF, für jeden Strohhalm aufgetaut werden, bereiten die folgenden und für mindestens eine Stunde ins Gleichgewicht in einem 37 ° C CO 2-Inkubator. <ol><li> Sperm Inkubation Schüssel: eine 35 mm Petrischale mit einem 90 ul Tropfen Sperma Behandlung Medium (STM) mit Öl bedeckt. </li><li> Cutting Gericht: Für Eizellenentnahme von maximal 10 superovulated Weibchen, einer 35 mm Petrischale mit 3 ml IVF Medium. </li><li> IVF gut: Für jede Gruppe von 5 superovulierten Weibchen für IVF, eine Vertiefung einer 4 gut Schüssel mit 500 ul IVF Medium (wenn Sie mit 10 superovulierten Weibchen sind, zum Beispiel, Sie erhalten 2 Brunnen benötigen...) </li><li> Washing Schüssel: eine 35 mm Petrischale mit 3 ml Kalium-simplex optimierten Medium (KSOM) zum Waschen jeder Vertiefung der 4-und IVF Gericht verwendet </li><li> Kulturschale: eine 35 mm Petrischale mit 50 ul Tropfen KSOM Medium mit Öl für die Embryo-Kultur aus jedem Well der IVF Schüssel abgedeckt. </li></ol></li><li> Nehmen Sie einen Strohhalm aus LN 2 und in einem 37 ° C Wasserbad für 2-3 Minuten. </li><li> Entfernen Sie das Stroh aus dem Wasserbad und wischen, um überschüssiges Wasser zu entfernen. Machen Sie den ersten Schnitt in der Nähe der ersten Luftsäule nächst der Wattebausch. Schneiden Sie das Stroh in der IVF-Medium gibt es noch eine Luftsäule sichtbar, bevor die Spermien Spalte werden. </li><li> Dann schneiden Sie das Ende des Strohs in den sZWEITEN Luftsäule, wobei darauf zu vermeiden, schneiden die Spermien Spalte. Cut bei einem 45 ° Winkel - das macht es viel einfacher, das Sperma absaugen. </li><li> Saugen Sie die Spermien Suspension aus dem distalen Ende des Strohs mit einer 200 ul Pipette. </li><li> Legen Sie die Spermien Suspension in der Mitte des STM Drop und inkubieren Sie die Schale für 45-60 Minuten in einem 37 ° C 5% CO 2-Inkubator. </li><li> Während die Spermien Inkubation sezieren die Eileiter der superovulierten Weibchen in die Schneiden Gericht. Verwenden Sie eine 30 g Nadel oder Pinzette zu jedem Eileiter reißen, die Freigabe der Kumulus-Eizell Komplexe (KOK). Vermeiden Sie Fett und Blut in der IVF-Medium wie verschmutzte Medien für zusätzliche Waschschritte macht. </li><li> Nachdem alle die Eileiter wurden abgerissen, übertragen Sie die KOK von 5 Hündinnen zu jedem IVF Brunnen. Die Zahl der KOK durch Superovulation produziert ist sehr belasten abhängig. </li><li> Sammeln 10-15 ul von Spermien aus der Peripherie des STM Drop und befruchten IVF und etwa 14-16 Stunden post hCG injection. Wiederholen Sie die Befruchtung für jeden gut genutzt. Finale Spermienkonzentration werden ca. 1 Mio. / ml sein. </li><li> Cokultur Spermien und Eizellen für 4-6 Stunden in einem 37 ° C 5% CO 2-Inkubator. </li><li> Waschen Sie die Embryonen mit KSOM mindestens 2 Mal und Kultur in KSOM Tropfen für die Entwicklung in einem 37 ° C 5% CO 2-Inkubator. </li><li> IVF-Rate wurde in zwei Zell-Embryonen aus insgesamt Eizellen nach Übernacht-Kultur verwendet berechnet. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Sperma von 5 Charles River Maus Inzuchtstämme wurde eingefroren. Schutz Verhältnisse sind, indem gefrorenen Sperma Beurteilung Werte von frischem Sperma Bewertung berechnet. Schutz-Verhältnisse von Spermien-Motilität wurden 60,2%, 81,3%, 78,6%, 66,5%, 61,0% für C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl und BALB / cAnNCrl jeweils. Schutz-Verhältnisse für schnellen progressiven Motilität wurden 47,3%, 69,4%, 57,0%, 52,8%, 54,1% in C57BL/6NCrl, 129S2/SvPas<html> CRL, FVB / NCrl, DBA/2NCrl und BALB / cAnNCrl bzw. (Abb. 1). Die IVF Raten mit aufgetauten Spermien wurden 55,7%, 26,4%, 87,3%, 87,8% und 26,2% in C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl und BALB / cAnNCrl bzw. (Abb. 2) . Über einen 1,5 Jahre Zeitraum wurden 49 GM Mauslinien durch Spermien Kryokonservierung archiviert. Diese Linien wurden später erfolgreich wiederhergestellt (wie Live-Welpen geboren definiert) durch IVF in 4 weiblichen Stämmen (C57BL / 6, BALB / c, DBA / 1 und 129Sv) (Abb. 3). <img alt="Abbildung 1." src="/files/ftp_upload/3713/3713fig1.jpg" /> Abbildung 1. Der Schutz Ratios von Spermien-Motilität und schnellen progressiven Motilität in Mäuse <img alt="Abbildung 2." src="/files/ftp_upload/3713/3713fig2.jpg" /> Abbildung 2. In-Vitro-Fertilisation mit aufgetauten Sperma in Mäuse 3713fig3.jpg &quot;/&gt; Abbildung 3. In-vitro-Fertilisation mit aufgetauten Sperma in GM Mäuse

<ol><li>Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+in+the+presence+of+raffinose+and+glycerol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fertil%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol.</a> J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).</li>
<li>Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+normal+young+following+transfer+of+mouse+embryos+obtained+by+in+vitro+fertilization+using+cryopreserved+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Jikken+Dobutsu%22%5BJournal%5D)">Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa.</a> Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).</li>
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<li>Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+numbers+of+mice+established+by+in+vitro+fertilization+with+cryopreserved+spermatozoa%3A+implications+and+applications+for+genetic+resource+banks%2C+mutagenesis+screens%2C+and+mouse+backcrosses%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm.+Genome%22%5BJournal%5D)">Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses.</a> Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).</li>
<li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+fertilization+with+cryopreserved+inbred+mouse+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm.</a> Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).</li>
<li>Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+freezing+and+in+vitro+fertilization+in+three+substrains+of+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Assoc.+Lab.+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).</li>
<li>Nakagata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+and+in+vitro+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization.</a> Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).</li>
<li>Mazur, P., Koshimoto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+intracellular+ice+formation+the+cause+of+death+of+mouse+sperm+frozen+at+high+cooling+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates.</a> Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).</li>
<li>Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+by+which+mouse+spermatozoa+are+injured+during+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing.</a> J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).</li>
<li>Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+signaling+pathways+involved+in+sperm+acquisition+of+fertilizing+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity.</a> J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).</li>
<li>Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserving%2C+distributing+and+managing+genetically+modified+mouse+lines+by+sperm+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation.</a> PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).</li>
</ol>

Die Autoren sind Mitarbeiter von Charles River, der Hersteller des Kits.

Seit 1990 ist die grundlegende Sperma Einfrieren Protokoll mit 18% Raffinose und 3% Magermilch erwiesen in viele Stämme von Mäusen zuverlässig und eine große Anzahl von Mauslinien wurden 1,2,3,4,5,6,7 kryokonserviert. Die wichtigsten Ursachen für Schäden an Spermien während der Frost-Tau-Prozess haben mit Eisbildung 8,9 und reaktiven Sauerstoff-Spezies 10 in Verbindung gebracht. Supplementierung mit Radikalfängern, wie Aminosäuren und Reduktionsmittel, wie z. B. Monothioglycerol, in dem Einfriermedium wurde untersucht und bewiesen deutlich zu erhöhen IVF-Rate mit aufgetauten Samenzellen in Inzuchtstämme einschließlich der C57BL / 6 11,6. Im vorliegenden Protokoll, entwickelten wir einen neuen I • Cryo-Kit für Mausspermien Kryokonservierung durch die Optimierung der grundlegenden CPA mit handelsüblichen Antioxidantien und Eis-Blocker und durch Veränderung der Spermien Einfrieren und IVF-Verfahren. Schutz-Verhältnisse von Spermien-Motilität(&gt; 60%) und schnellen progressiven Motilität (&gt; 45%) wurden für die Spermien von fünf Inzucht-Mausstämmen mit dem I • Cryo-Kit eingefroren gesehen. Die 2-Zell-Stadium der Embryonalentwicklung Rate mit aufgetauten Samenzellen in 5 Maus Inzuchtstämme war deutlich im Vergleich zu dem mit den grundlegenden CPA 11,6 verbessert. In Verwendung des Kits erstellt der Benutzer eine konzentrierte Sperma Suspension durch das Einfrieren von Spermien 2 Rüden für jede Zeile. Mit nur Einfrieren 15 Strohhalme der Prozess ist schnell, einfach und belegt weniger Speicherplatz für kurze oder langfristige Lagerung. Die meiste Zeit kann Mauslinien durch Auftauen nur 1 oder 2 Strohhalme wiederhergestellt werden.

<table><tbody><tr><td>CPA</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Wird mit dem Kit bereitgestellt</td></tr><tr><td>STM</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Wird mit dem Kit bereitgestellt</td></tr><tr><td>IVF-Medium</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Wird mit dem Kit bereitgestellt</td></tr><tr><td>0,25-ml-Kunststoffröhrchen</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Wird mit dem Kit bereitgestellt</td></tr><tr><td>Spermafriekanister</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Wird mit dem Kit bereitgestellt</td></tr><tr><td>Träger und Schale</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Wird mit dem Kit bereitgestellt</td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td>Sollte embryotestet sein</td></tr><tr><td>KSOM-Medium</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>35-mm-Petri-Schale</td><td>Falcon BD</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Heißsiegelgerät</td><td>ABTEC</td><td>TISH-200</td><td></td></tr><tr><td>Mehrfachplatte mit 4 Vertiefungen</td><td>Nalge Nunc international</td><td>73521-424</td><td></td></tr><tr><td>Pipettierer</td><td>Gilson, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen</td><td>Verschiedene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C + 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-Inkubator</td><td>Verschiedene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LN&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-Lagersystem</td><td>Verschiedene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C-Wasserbad</td><td>VWR international</td><td>89032-196</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>hCG</td><td>Intervet Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>EMD Millipore</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>1-cc-Spritze mit 26G-3/8-Nadel</td><td>BD Biosciences</td><td>BD309625</td><td></td></tr><tr><td>Mikrochirurgische Schere</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5602</td><td></td></tr><tr><td>30-Gauge-&amp;frac12;-Nadel</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6802</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5135, RS-5110, RS-5005</td><td></td></tr></tbody></table>

maus sperma kryokonservierung und recovery mit der i · cryo-kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Tausende von neuen gentechnisch veränderten (GV) Stämme von Mäusen haben seit dem Aufkommen der Transgenese und Knockout-Technologien geschaffen worden. Viele dieser wertvollen Tiere existieren nur als lebende Tiere, ohne Backup-Plan für den Notfall. Die Kryokonservierung von Embryonen können dieses Backup bieten, ist aber teuer, kann ein langwieriges Verfahren sein, und erfordert in der Regel eine große Anzahl von Tieren für den Erfolg. Seit der Entdeckung, dass Mausspermien erfolgreich mit einer grundlegenden kryoprotektive Agent (CPA), bestehend aus 18% Raffinose und 3% Magermilch kryokonserviert werden, hat Sperma Kryokonservierung zu einem akzeptablen und kostengünstiges Verfahren für die Archivierung, Verteilung und Rückgewinnung dieser wertvollen Stämme . Hier zeigen wir ein neu entwickeltes I • Cryo-Kit für Mausspermien Kryokonservierung. Sperma aus fünf am häufigsten verwendeten Stämme von Inzucht-Mäusen wurden eingefroren mit diesem Kit und dann wiederhergestellt. Besserer Schutz-Verhältnisse von Spermien-Motilität (&gt;60%) und schnellen progressiven Motilität (&gt; 45%) im Vergleich zur Kontrollgruppe (unverwässert CPA) wurden für die Spermien mit diesem Kit in 5 Inzucht-Mausstämmen eingefroren gesehen. Zwei-Zell-Stadium der Embryonalentwicklung nach IVF mit dem Sperma gewonnen wurde konsequent in allen 5 untersuchten Mausstämme verbessert. Über einen 1,5 Jahre Zeitraum wurden 49 GM Mauslinien durch Spermien Kryokonservierung mit dem I • Cryo-Kit archiviert und später durch IVF gewonnen.

Hier zeigen wir den neu entwickelten I • Cryo-Kit für Mausspermien Kryokonservierung. Zwei-Zell-Stadium der Embryonalentwicklung mit aufgetauten Sperma wurde konsequent in 5 Mausstämme mit dem Einsatz dieses Kits verbessert. Über einen 1,5 Jahre Zeitraum wurden 49 genetisch veränderte Mauslinien durch Spermien Kryokonservierung mit dem I • Cryo-Kit archiviert und später erfolgreich durch IVF gewonnen.

Maus Sperma Kryokonservierung und Recovery mit der I · Cryo-Kit

Seit der Einführung der Transgenese und der Knockout-Technologien wurden Tausende neuer genetisch modifizierter (GM) Mausstämme erzeugt. Viele dieser ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Mäusesperma einzufrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Sperma aus Mäuse-EPIs unter Verwendung von Kryokonservierungsrohrchen gesammelt wird. Die Röhrchen werden anschließend in flüssigem Stickstoff eingefroren und dort gelagert, bis sie durch Auftauen in warmem Wasser wiederhergestellt werden.Die gewonnenen Mausspermien werden letztendlich für die In-vitro-Fertilisation verwendet. Der Hauptvorteil dieses Kits im Vergleich zu bestehenden Methoden liegt darin, dass es alle notwendigen Materialien zur Kryokonservierung und Wiedergewinnung von Mausspermien enthält. In der Regel haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten beim Handhaben und Befüllen der Strohhalme. Beginnen Sie damit, 15 Spermien-Kryokonservierungs-Strohhalme pro Mauslinie vorzubereiten, die kryokonserviert werden soll. Verbinden Sie zunächst jeden 0,25-Milliliter-Strohhalm mit einer Ein-Milliliter-Spritze, wobei der Wattepfropfen am nächsten zur Spritze liegt. Laden Sie danach acht Zentimeter IVF-Medium in jeden Strohhalm, gefolgt von einem Zentimeter Luft. Kennzeichnen Sie anschließend jeden der 15 Strohhalme mit dem Namen der Linie, die für jede zu kryokonservierende Linie erhalten werden soll.Füllen Sie eine Vertiefung einer Vier-Vertiefungs-Schale mit 240 Mikrolitern kryoschützendem Mittel. Bringen Sie eine Ein-Milliliter-Pipette am Griff des Gefriermessings an, um diesen zu verlängern. Füllen Sie schließlich die mit dem Kit bereitgestellte schaumstoffisolierte Box mit 15 Zentimetern flüssigem Stickstoff und schließen Sie den Deckel.Zwei fruchtbare erwachsene männliche Mäuse. Entfernen Sie für jede zu kryokonservierende Linie chirurgisch deren kaudalen EPIs. Legen Sie die Maus in dorsale Rekumbenz und öffnen Sie die ventrale Körperwand.Ziehen Sie vorsichtig am großen Samenstrang und entfernen Sie überschüssiges Fett. Suchen Sie danach den Nebenhoden und entfernen Sie ihn zusammen mit einem kleinen Stück des kurzen Samenstrangs vollständig. Geben Sie die EPIs in eine Vertiefung der vorbereiteten Vier-Vertiefungs-Schale, die mit CPA gefüllt ist, unter dem Stereomikroskop.Führen Sie fünf bis sieben Längsschnitte in jedem Nebenhoden durch. Drücken Sie dann mit einer Pinzette vorsichtig jeden Schnittabschnitt aus, um die Spermien herauszudrücken. Inkubieren Sie die Mischung aus Kälteschutzmittel und Nebenhoden bei Raumtemperatur für drei bis fünf Minuten.Bewegen Sie die Schale während der Inkubation von Hand sanft zwei bis drei Mal. Dadurch können die Spermien durch Aspiration austreten. Füllen Sie jedes vorbereitete Röhrchen mit fünf Millimetern der Spermien-Suspension, gefolgt von einem Zentimeter Luft.Es ist wichtig für den Einfrierprozess, dass alle Strohhalme gleichmäßig befüllt werden. Nachdem alle 15 Strohhalme befüllt sind, sorgfältig beide Enden jedes Strohhalms verschweißen. Um das Überleben der Spermien sicherzustellen, den gesamten Vorgang für alle 15 Strohhalme innerhalb von 10 Minuten abschließen.Nachdem alle Strohhalme vorbereitet wurden, laden Sie sie in die Spermakolonne des Einfrierbehälters. Stellen Sie zunächst den Behälter in die Schaumstoffbox und lassen Sie ihn senkrecht im flüssigen Stickstoff schwimmen. Der Behälter muss 10 Minuten lang senkrecht schwimmen, da sonst die Einfriergeschwindigkeit der Spermien beeinträchtigt wird.Danach das Gefäß in flüssigen Stickstoff tauchen. Die Spermien werden auf diese Weise kryokonserviert und sind bereit für die Langzeitlagerung in flüssigem Stickstoff. Ungefähr 60 Stunden vor einer geplanten Spermienentnahme.Befolgen Sie die schriftliche Anleitung zur Superovulation von Weibchen vor der IVF. Für jeden aufzutauenden Strohhalm bereiten Sie alle Medien mindestens eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid vor und äquilibrieren Sie diese. Zu diesen Materialien gehört eine 35 Millimeter große Petrischale mit einem 90 Mikroliter großen Tropfen Spermiensuspensionsmedium, der mit Öl bedeckt ist.Eine 35-Millimeter-Petri-Schale mit drei Millilitern IVF-Medium dient als Schneideschale. Pro fünf superovulierte Weibchen bereiten Sie eine IVF-Schale vor, die aus einem Brunnen einer Vier-Brillen-Schale mit 500 Mikrolitern IVF-Medium besteht. Für jede IVF-Schale bereiten Sie eine Waschschale vor, bestehend aus einer 35-Millimeter-Petri-Schale mit drei Millilitern KSOM, sowie eine Embryokulturschale, bestehend aus einer 35-Millimeter-Petri-Schale mit 50-Mikroliter-Tropfen KSOM-Medium, die mit Öl bedeckt sind. Nachdem alle erforderlichen Materialien vorbereitet sind, entnehmen Sie rasch einen Strohhalm aus der Lagerung und legen ihn für zwei bis drei Minuten in ein Wasserbad mit 37 Grad Celsius.Trocknen Sie den Strohhalm ab. Dann führen Sie einen schrägen Schnitt in der Luftsäule unterhalb des Wattepfropfens durch. Am anderen Ende des Strohhalms führen Sie einen weiteren schrägen Schnitt über einer weiteren Luftsäule durch.Vermeiden Sie es, die Spermienkolonne zu durchtrennen. Aspirieren Sie nun die Spermien-Suspension mit einer 200-Mikroliter-Pipette vom Ende des Strohhalmes und geben Sie sie in die Mitte des Spermienbehandlungsmediums ab. Anschließend inkubieren Sie die Petrischale 45 bis 60 Minuten lang.Während der Spermieninkubation isolieren Sie die Uterus-Hornkanäle (ucs) der superovulierten Weibchen und überführen sie in die Schneidenschale. Benutzen Sie eine 30-Gauge-Nadel oder eine Pinzette, um jeden Eileiter aufzutrennen und so die Cumulus-Zell-Komplexe freizusetzen. Überführen Sie die CCs von fünf Weibchen in jedes IVF-Gerät.Nun, mit einem minimalen Mediumsvolumen. Vermeiden Sie die Übertragung von Fett und Blut, da verunreinigtes Medium die Befruchtungseffizienz hemmt. Sammeln Sie nach der Inkubation 10 bis 15 Mikroliter der Spermien-Suspension vom Rand des STM-Tropfens und geben Sie die Suspension in eine IVF.Ko-kultivieren Sie die Zellen nun vier bis sechs Stunden lang zur Befruchtung. Nach der Befruchtung lassen Sie die Embryonen mindestens zwei 2K-SOM-Waschungen in der Waschschale durchlaufen. Danach kultivieren.Die Embryonen verbleiben in KSOM, bis der gewünschte Entwicklungsstadium erreicht ist. Spermien aus fünf inzüchtigen Mausstämmen von Charles River wurden eingefroren. Die Schutzraten für Spermienmotilität und rasch progressive Motilität lagen bei diesen Spermien über die fünf Stämme hinweg zwischen 81 % und 47 %.Die IVF-Raten mit gefrorenen und aufgetauten Spermien variierten über eineinhalb Jahre hinweg zwischen verschiedenen Stämmen von 26 bis 88 %. Insgesamt wurden 49 gentechnisch modifizierte Mauslinien durch Spermienkryokonservierung archiviert und später mittels IVF in vier verschiedenen weiblichen Stämmen wiederhergestellt. C57BL/6, DBA/1 und 129/Sv. Sobald die Technik der Spermienkryokonservierung beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von 30 Minuten durchgeführt werden.Für dieses Verfahren ist es wichtig, dass die Strömung vertikal zum Kolben und flüssigem Stickstoff erfolgt.

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Forschung

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Biologie

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Mit einem vergleichenden Arten Ansatz zur Neurobiologie der väterlichen Responses Untersuchen

In diesem Video demonstrieren wir eine ultraschnelle Kryo-Vitrifikationsmethode zur Konservierung biologischer Proben. Die Methode beinhaltet die Verwendung einer Kombination von Kryoprotektiva, um das biologische Gewebe vor Frostschäden zu schützen, indem die Bildung intrazellulärer Eiskristalle verhindert wird.

Vitrifikationsbasierte Kryokonservierung: eine ultraschnelle Kühltechnik zur Konservierung biologischer Proben bei sehr niedrigen Temperaturen für die Langzeitlagerung

MicroSecure Vitrification wurde als nicht-kommerzielles, aseptisches, geschlossenes Vitrifikationssystem entwickelt, das den guten Herstellungs- und Gewebehandhabungspraktiken der FDA entspricht. Aufgrund der Rücknahme von hydrophoben verstopften Embryonalhalmen aus der Industrie wurde das Vitrifikationsverfahren dahingehend geändert, dass eine innere Versiegelung vor dem standardmäßigen internen Baumwollstopfen vorgesehen ist.

Modifizierte MicroSecure Vitrifikation: Eine sichere, einfache und sehr effektive Kryokonservierung Verfahren für Human Blastozysten

Das Hauptziel dieser Studie war die Nadel anpassen Verglasung (NIV) Verfahren um ganze Zebrafisch Hoden Ovarialgewebe eingetaucht. Darüber hinaus wurde die Reproduzierbarkeit der Methode in fünf verschiedenen Zebrafisch-Sorten getestet.

Kryokonservierung von Zebrafisch-Spermatogonien durch ganze Hoden Nadel eingetaucht, ultra-schnelle Abkühlung

Protokolle für die Europäischen Aals Reifung und Sperma Kryokonservierung wurden in den letzten Jahren verbessert. Dieser Artikel beschreibt die beste Protokoll über humanes Choriongonadotropin (hCG) zur Induktion Reifung und Methanol als Kryoprotektivum verfügbar.

Handhabung und Behandlung der männlichen europäischen Aal (Anguilla Anguilla) für die hormonelle Reifung und Kryokonservierung von Spermien

Hier stellen wir eine modifizierte Methode zur Kryokonservierung von Einzellembryonen sowie ein Protokoll vor, das die Verwendung von gefriergetauten Embryonen und Elektroporation für die effiziente Erzeugung genetisch veränderter Mäuse koppelt.

Verwendung von gefriergetauten Embryonen für die hocheffiziente Produktion von gentechnisch veränderten Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt einen halbautomatischen Weg zur Verbesserung der Effizienz und Kapazität der Verarbeitung und Kryokonservierung von Spermien bedrohter Korallenarten, mit dem Ziel, die genetische Vielfalt zu sichern und die Bemühungen zur Wiederherstellung von Riffen zu unterstützen.

Ein halbautomatischer Workflow für die Kryokonservierung von Korallenspermien zur Unterstützung von Biobanking und Aquakultur

Erfahren Sie die Kryokonservierung von Mäusesperma mit dem I·Cryo-Kit für reproduktionsbiologische Forschung. Diese Methode ermöglicht die effiziente Archivierung genetisch modifizierter Mauslinien durch IVF.

Maus Sperma Kryokonservierung und Recovery mit der I · Cryo-Kit

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