Bestimmung des mitochondrialen Membranpotentials und Reactive Oxygen Species in Live Rat kortikalen Neuronen

Ziel dieses Verfahrens ist es, das mitochondriale Membranpotential und den Gehalt an reaktiven Sauerstoffspezies in primären kortikalen Neuronen mit den Fluoreszenzsonden TMRM bzw. H 2D CFD zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Rohmaterial- und Arbeitskonzentrationen des TMRM und des H 2D CFDA vorbereitet werden. Der zweite Schritt besteht darin, die kortikalen Neuronen mit TMRM und H 2D CFDA bei Raumtemperatur für 45 Minuten in thailändischem Straßenpuffer zu inkubieren.

Der dritte Schritt besteht darin, die Fluoreszenzintensität von TMRM und DCF in lebenden kortikalen Neuronen unter Verwendung von 5 15 5 17 Nanometern bzw. 4 88 5 15 Nanometern Anregungsemission abzubilden. Die Änderungen der TMR in der Fluoreszenz werden in Gegenwart des mitochondrialen unco FCCP überwacht, während die Änderungen der DCF-Fluoreszenz in Gegenwart von Wasserstoffperoxid überwacht werden. Der letzte Schritt dieses Verfahrens ist die Erfassung, Normalisierung und Analyse von Daten.

Letztendlich werden die Ergebnisse durch die Erstellung eines Diagramms erhalten, das die relativen Niveaus der TMRM- und DCF-Fluoreszenzintensität vor bzw. nach der FCCP- bzw. Wasserstoffperoxid-Behandlung zeigt. Hallo, ich bin Joanna Koska. Willkommen in meinem Labor an der Loyola University Chicago.

Heute zeigen wir Ihnen, wie Sie das mitochondriale Membranpotenzial und die reaktiven Sauerstoffspezies in kortikalen Neuronen von Ratten messen können. Das Verfahren wird von dhi demonstriert. Hallo, ich bin de Denise Jossi.

Mit diesem Verfahren kann das mitochondriale Membranpotential an einzelnen mitochondrialen Markierungen und reaktive Sauerstoffspezies an einzelnen Zellmarkierungen gemessen werden. Also lasst uns loslegen. Bereiten Sie eine 10-Millimolar-Brühe TMRM vor, indem Sie eine Minute lang fünf Milligramm TMRM in einem Milliliter wasserfreiem Dimethylsulfoxid-Wirbel auflösen.

Dann Aliquots herstellen Lagern Sie die Aliquots bei minus 20 Grad Celsius. Vor Licht schützen und innerhalb eines Monats verbrauchen. Bereiten Sie als Nächstes eine 10 Millimolar Brühe H 2D CFDA vor, indem Sie 4,87 Milligramm H 2D CFDA in einem Milliliter wasserfreiem Dimethylsulfoxid auflösen.

Auf ähnliche Weise eine Minute lang vortexen, dann Aliquots herstellen und bei minus 20 Grad Celsius lagern. Vor Licht schützen und innerhalb einer Woche verwenden, um die kortikalen Neuronen der Ratte zuerst mit TMRM zu belasten. Waschen Sie die kultivierten Neuronen dreimal mit Tyros Puffer.

Bereiten Sie dann 20 nanomolare TMRM vor, indem Sie den 10 millimolaren TMRM-Stamm 1000-mal in TB verdünnen. Fügen Sie dann zwei Mikroliter des verdünnten TMRM pro Milliliter TB hinzu. Inkubieren Sie die Neuronen mit TMRM für 45 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur.

Montieren Sie nach 45 Minuten die Kulturschale auf dem Tisch des Mikroskops und beginnen Sie mit der Bildgebung, um die kortikalen Neuronen der Ratte mit H 2D CFDA zu beladen, waschen Sie die kultivierten Neuronen dreimal mit TB. Bereiten Sie als Nächstes zwei Mikromolare H 2D CFDA vor, indem Sie die 10 Millimolar H 2D CFDA-Aktie 10-mal in TB verdünnen. Und dann fügen Sie zwei Mikroliter verdünntes H 2D CFDA pro einem Milliliter TB hinzu.

Dann inkubieren Sie die Neuronen nach 45 Minuten 45 Minuten lang 45 Minuten lang mit H 2D CFDA im Dunkeln bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Neuronen viermal mit TB, um überschüssige Fluoreszenzindikatoren zu entfernen, bevor Sie Bilder erhalten, um eine Live-Bildgebung von Neuronen durchzuführen, die mit der konfokalen TMRM-Laserscanning-Mikroskopie unter Anwendung des Live-Zeitreihenprogramms inkubiert wurden. Wenden Sie eine niedrige Auflösung und eine abgeschwächte Laserleistung an, um die für die Bildaufnahme benötigte Zeit zu minimieren und Photo-Bleaching zu vermeiden.

Passen Sie als Nächstes den Fokus der mit TMRM beladenen montierten Neuronen mithilfe des reflektierten Lichts an. Untersuchen Sie die TMRM-Fluoreszenz durch Beleuchtung bei fünf 14 Nanometern und Detektion bei fünf 70 Nanometern. Stellen Sie die Erkennungsverstärkung der Kamera knapp unter den Sättigungsgrad ein, sobald alle Parameter, einschließlich Auflösung, Laserleistungserkennung, Verstärkung der Kamera und Zeitrafferintervall zur Bildaufnahme, eingestellt sind.

Ändern Sie diese Einstellungen nicht zwischen den Experimenten. Ändern Sie als Nächstes das Feld. Beginnen Sie mit dem Sammeln von Bildern, um Veränderungen des Delta-PSY-M-Stimulus zu testen, z. B. kann ein Mikromolar FCCP oder zwei Mikrogramm pro Milliliter Oligomycin angewendet werden, wodurch das mitochondriale Membranpotenzial signifikant depolarisiert bzw. hyperpolarisiert wird.

Diese Veränderungen spiegeln sich in einer Abnahme der TMRM-Fluoreszenzintensität im Vergleich zur Ausgangsfluoreszenzintensität im Falle von FCCP oder in einer Erhöhung der TMRM-Fluoreszenzintensität wider. Im Falle einer LIGA myin sin zur Durchführung von Live-Bildgebung von Neuronen, die mit H 2D CFDA inkubiert wurden, montieren Sie zuerst die Kulturschale auf dem Tisch eines Mikroskops und stellen Sie den Fokus der Zellen mit reflektiertem Licht ein. Untersuchen Sie die DCF-Fluoreszenz durch Anregung bei 4 88 Nanometern und Emission bei fünf 15 Nanometern.

Stellen Sie als Nächstes die Laserleistung auf fünf bis 7% ein, um eine Verstärkung und Auflösung von 2 56 x 2 56 zu erkennen. Ändern Sie diese Einstellungen nicht zwischen den Experimenten. Legen Sie dann die Häufigkeit für den Erhalt von Live-Bildern fest.

Wählen Sie mit dem Zeitreihenprogramm ein neues Feld aus und beginnen Sie mit der Erfassung von Bildern, um Änderungen der R os-Pegel zu erkennen. Behandeln Sie die Zellen mit 100 bis 200 Mikromolar Wasserstoffperoxid. Dies spiegelt sich in einer Erhöhung der DCF-Fluoreszenzintensität im Vergleich zum Ausgangswert wider.

Verwenden Sie das Tool "Region of Interest" aus dem LSM-Programm, um die Bereiche auszuwählen. Wählen Sie dann ROIs aus mitochondrialen Regionen oder ROIs aus dem gesamten Zellkörper in Bildzellen aus. Zur Messung der Fluoreszenzintensitäten von TMRM bzw. ROS.

Wählen Sie Regionen neben den Zellen aus. Um die Hintergrundfluoreszenzintensität zu berechnen, führen Sie mehrere Messungen durch, und um die durchschnittliche Hintergrundintensität zu berechnen, subtrahieren Sie mit Microsoft Excel die durchschnittliche Hintergrundfluoreszenzintensität von den durchschnittlichen Fluoreszenzintensitäten der interessierenden Bereiche in jeder Zelle für jeden Zeitpunkt. Nachdem Sie die Hintergrundintensität abgezogen haben, normalisieren Sie die TMRM- oder DCF-Fluoreszenzintensität auf die Ausgangsfluoreszenz.

Verwenden Sie diese Formel und verwenden Sie dann das Sigma-Plot-Programm, um das Diagramm zu erstellen, das die Änderungen der Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit zeigt. Hier ist ein Beispiel für ein Fluoreszenzbild von kortikalen Neuronen der Ratte, die mit TMRM inkubiert wurden. Die Zugabe von F-C-C-P-A mitochondrialem Unco führt zu einer mitochondrialen Depolarisation und einem Verlust der TMRM-Fluoreszenzintensität

Der TMRM-Fluoreszenzwert zu Studienbeginn bleibt vor der Zugabe von FCCP stabil. Die quantitative Analyse der TMRM-Fluoreszenzänderungen im Laufe der Zeit zeigt eine signifikante Abnahme der TMRM-Fluoreszenz nach Zugabe von FCCP. Hier ist ein Beispiel für ein Fluoreszenzbild von kortikalen Neuronen der Ratte, die mit DCF beladen sind.

Der DCF-Fluoreszenzwert zu Studienbeginn bleibt in den ersten 120 Sekunden vor der Anwendung von Wasserstoffperoxid unverändert. Die Zugabe von Wasserstoffperoxid führt zu einer Erhöhung der DCF-Fluoreszenzintensität in den Zellkörpern. Zeitraffermessungen der DCF-Fluoreszenz zeigen ihre konstanten Werte, die nach Wasserstoffperoxid-Behandlungen gestiegen sind.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, eine geringe Laserleistung und eine schnelle Scangeschwindigkeit zu verwenden, um Artefakte durch Photobleiche und Phototoxizität zu vermeiden. Viel Erfolg bei Ihrem Experiment.