Name: Bestimmung des mitochondrialen Membranpotentials und Reactive Oxygen Species in Live Rat kortikalen Neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Lernen Sie die Bestimmung des mitochondrialen Membranpotentials und reaktiver Sauerstoffspezies in lebenden kortikalen Neuronen mit den Fluoreszenzsonden TMRM und H2D CFDA. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Monitoring mitochondrialer Dynamiken.

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Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (K22NS050137 zu JCB) unterstützt.

1. Zellkultur <ol><li> Kortikalen Neuronen isoliert und gezüchtet Verwendung der vorher beschriebenen Techniken und plattiert auf Kulturschalen mit Glasboden (MatTek Corporation, Ashland, MA) mit Poly-D-Lysin und Laminin 1 beschichtet. </li></ol> 2. Vorbereitung der Stammlösungen für die fluoreszierenden Sonden TMRM und H 2 DCF-DA <ol><li> Bereiten Sie eine 10-mM Stammlösung von TMRM durch Auflösen von 5,0 mg TMRM in 1 ml wasserfreiem Dimethylsulfoxid. Vortex es für 1 min. Dann machen Aliquots und lagern Sie sie bei -20 ° C, vor Licht schützen, und innerhalb von 1 Monat. </li><li> Als nächstes bereiten ein 10-mM Stammlösung von H 2 DCF-DA durch Auflösen von 4,87 mg H 2 DCF-DA in 1 ml wasserfreiem DMSO. Ebenso Vortex es für 1 min. Dann machen Aliquots und lagern Sie sie bei -20 ° C, vor Licht schützen, und innerhalb von einer Woche. </li></ol> 3. Loading Ratte kortikalen Neuronen mit TMRM und H 2 DCF-DA TMRM ist eine potentiometrische, zellpermeablen fluoreszierenden Indikator dafür, dass in der stark negativ geladenen Inneren der Mitochondrien akkumuliert. Es ist wichtig, die geringen Konzentrationen (10-50 nM-Bereich) von TMRM nutzen, um auto-Abschrecken der mitochondrialen TMRM zu vermeiden. Dann kann das Fluoreszenzsignal TMRM direkt Zusammenarbeit im Zusammenhang mit ΔΨm über die innere Membran der Mitochondrien. Ein Verlust von ΔΨm Ursachen TMRM von Mitochondrien, woraus ein Verlust der Fluoreszenzintensität auslaufen. H 2 DCF-DA ist zellpermeablen Sonde in DCF-DA durch intrazelluläre Esterasen umgewandelt, und die Oxidation führt in fluoreszierenden DCF. Die Endkonzentration von H 2 DCF-DA liegt zwischen 2-10 um und es sollte empirisch in Neuronen aus verschiedenen Hirnregionen abgeleitet getestet werden, da hohe Belastung Konzentrationen in der Sättigung des DCF-Fluoreszenz auch in Abwesenheit von H 2 O 2 entstehen könnten. Das Vorhandensein einer endogenen oder exogenen Oxidationsmittel (z. B. Stickstoffmonoxid, Wasserstoffperoxid) erhöht DFC Fluoreszenzintensität. Nachfolgend stellen wir ein Protokoll für die Be-Ratte kortikalen Neuronen mit TMRM und H 2 DCF-DA. <ol><li> Zum Laden der Ratte kortikalen Neuronen mit TMRM zunächst, waschen Sie die kultivierten Neuronen 3-mal mit Tyrode-Puffer (Text-Overlay: TB: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Glukose, 1,5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2 und 10 mM HEPES; pH-Wert auf 7,4 mit NaOH). Dann bereiten 20 nM von TMRM durch Verdünnen der 10 mM TMRM Lager 1 / 1000 mal in TB und fügen Sie dann 2 ul verdünnt TMRM pro 1 ml TB. Inkubieren Sie die Neuronen mit TMRM für 45 min im Dunkeln bei Raumtemperatur. Nach 45 min, montieren Sie die Kulturschale auf der Bühne des Mikroskops und starten Bildgebung. </li><li> Zum Laden der Ratte kortikalen Neuronen mit H 2 DCF-DA, waschen Sie die kultivierten Neuronen 3-mal mit TB. Als nächstes bereiten 2 uM von H 2 DCF-DA durch Verdünnen der 10 mM H 2 DCF-DA Lager 1 / 10 mal in TB und fügen Sie dann 2 ul der verdünnten H 2 DCF-DA pro 1 ml TB. Dann inkubieren die Neuronen mit H 2 DCF-DA für 45 min im Dunkeln bei Raumtemperatur. Nach 45 min, waschen Sie die Neuronen 4 mal mit TB, um überschüssige Fluoreszenzindikator vor Gewinnung von Bildern zu entfernen. </li></ol> 4. Live-Darstellung von Neuronen mit TMRM inkubiert, um ΔΨm bestimmen <ol><li> So führen Sie Live-Aufnahmen von Neuronen mit TMRM, konfokale Laser Scanning Mikroskopie (Text-Overlay: LSM 510, Carl Zeiss Inc.) inkubiert, mit der Anwendung von Live-Time-Serie Programm verwendet wird. Bewerben mit niedriger Auflösung und gedämpft Laserleistung (Text-Overlay: niedrige Auflösung: 256 x 256; Laserleistung: 1%), um die benötigte Zeit, um Bilder zu erhalten und zu vermeiden, Bleichen zu minimieren. </li><li> . Als nächstes stellen Sie den Fokus des montierten Neuronen mit TMRM geladen mit reflektiertem Licht. Untersuchen Sie die TMRM Fluoreszenz-Beleuchtung bei 514 nm und Detektion bei 570 nm. Stellen Sie die Erkennung Gewinn von einer Kamera direkt unterhalb der Sättigung. </li><li> Wenn alle Parameter, die Auflösung, Laserleistung, Erkennung Gewinn von einer Kamera, und Zeitraffer-Intervall gehören zu erlangen Bilder gesetzt werden; nicht ändern diese Einstellungen zwischen den Experimenten. Als nächstes ändern Sie das Feld. Starten Sammeln von Bildern. </li><li> Um zu testen, Änderungen in ΔΨm, können Reize wie 1 uM FCCP oder 2 pg / ml Oligomycin, angewandt werden, die deutlich depolarisieren oder hyperpolarisieren des mitochondrialen Membranpotentials, bzw.. Diese Veränderungen werden durch einen Rückgang in TMRM Fluoreszenzintensität im Vergleich zum Ausgangswert Fluoreszenzintensität bei FCCP, oder eine Erhöhung der TMRM Fluoreszenzintensität bei Oligomycin reflektiert werden. </li></ol> 5. Live-Darstellung von Neuronen mit H 2 DCF-DA inkubiert, um festzustellen, ROS <ol><li> So führen Sie Live-Aufnahmen von Neuronen mit H 2 DCF-DA zunächst inkubiert, montieren Sie die Kulturschale auf der Bühne eines Mikroskops. Stellen Sie den Fokus der Zellen unsIng. reflektierte Licht. Untersuchen DCF-Fluoreszenz durch Anregung bei 488 nm und Emission bei 515 nm. </li><li> Als nächstes stellen Sie die Laserleistung auf 5-7%, Detektor zu gewinnen, und die Auflösung von 256 x 256. Ändern Sie diese Einstellungen zwischen den Experimenten. Dann legen Sie die Frequenz für den Erhalt von Live-Bildern mit der Zeitreihen-Programm. </li><li> Wählen Sie ein neues Feld und beginnen Erfassen von Bildern. Um Veränderungen in ROS Ebenen zu behandeln Zellen mit 100-200 um H 2 O 2. Dies wird durch einen Anstieg der DCF-Fluoreszenz-Intensität im Vergleich zum Ausgangswert Ebene reflektiert werden. </li></ol> 6. Datenanalyse <ol><li> Verwenden region of interest (Text-Overlay: ROI)-Tool aus dem LSM-Programm, um die Bereiche auszuwählen. Dann messen Sie die TMRM oder ROS Fluoreszenzintensitäten. Wählen Sie ROIs von mitochondrialen Regionen oder ROIs aus dem gesamten Zellkörper in abgebildet Zellen, die Fluoreszenz-Intensitäten der TMRM oder ROS bzw. zu messen. </li><li> Berechnen Sie die durchschnittliche Fluoreszenz-Intensitäten von allen ROIs jeder Zelle für TMRM oder aus ganzen Zellkörper für alle abzubildenden Zellen für ROS für jeden Zeitpunkt. Wählen Sie Regionen neben den Zellen, die Hintergrund-Fluoreszenz-Intensität zu berechnen. Nehmen Sie mehrere Messungen und Berechnung der durchschnittlichen Hintergrund Intensität. </li><li> Subtrahieren Sie die durchschnittliche Hintergrund Fluoreszenzintensität von durchschnittlich Fluoreszenzintensitäten ROIs in jeder Zelle für jeden Zeitpunkt mit Microsoft Excel. Nach Abzug Hintergrund Intensität, normalisieren die TMRM oder DCF-Fluoreszenz-Intensität auf die Grundlinie Fluoreszenz mit dieser Formel (Text-Overlay: AF = FF o / F o x 100, wobei F = Fluoreszenz-Intensität zu jedem Zeitpunkt, Fo = baseline Fluoreszenz). Verwenden Sie dann die Sigma Plot Programm, um die grafische Darstellung der Veränderungen in der Fluoreszenz-Intensität im Laufe der Zeit zu generieren. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 1A zeigt ein Fluoreszenz-Bild der Ratte kortikalen Neuronen mit TMRM inkubiert. Die Zugabe von FCCP, eines mitochondrialen Entkoppler, führt zu mitochondrialen Depolarisation und einen Verlust von TMRM Fluoreszenzintensität (Abb. 1B). Die Baseline TMRM Fluoreszenz Ebene bleibt vor der Zugabe von FCCP (die ersten 350 sec.; Abb. 1C) stabil. Quantitative Analyse der TMRM Fluoreszenz ändert sich im Laufe der Zeit zeigt eine signifikante Abnahme in TMRM Fluoreszenz nach Zugabe von FCCP (Abb. 1C). 1D zeigt die Fluoreszenz-Bild der Ratte kortikalen Neuronen mit DCF geladen. Die Zugabe von H 2 O 2 führt zu einer erhöhten DCF Fluoreszenz-Intensität in Zellkörper (Abb. 1E). Die Baseline-DCF-Fluoreszenz-Ebene bleibt unverändert (die ersten 120 sec) vor dem Auftragen von H 2 O 2. Zeitraffer-Messungen der DCF-Fluoreszenz zeigen seine stetige Ebenen, die Zunahme nach H 2 O 2-Behandlung (Abb. 1F). <img src="/files/ftp_upload/2704/2704fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Einschätzung der mitochondrialen Membranpotentials und ROS Ebenen in lebenden Ratte kortikalen Neuronen. (A) Repräsentative Fluoreszenzbild der kortikalen Neuronen mit TMRM geladen. Nach dem Scannen der Grundlinie TMRM Fluoreszenz wurden Neuronen mit dem protonophore FCCP (1 uM) behandelt. Auf der rechten Seite ist eine Falschfarbendarstellung Intensität bar TMRM Fluoreszenz mit leuchtend gelben und schwarzen vertreten maximalen und minimalen Intensität, jeweils. Der Verlust von TMRM Fluoreszenz von der mitochondrialen Regionen zeigt den Zusammenbruch des ΔΨm auf FCCP Behandlung (Panel B). Die quantitative Darstellung der Veränderung in TMRM Fluoreszenzintensität zu verschiedenen Zeitpunkten vor und nach FCCP Behandlung ist in Panel C (D) Fluoreszenzbild Ratte kortikalen Neuronen mit H2DCF-DA geladen angezeigt. Nach der Bestimmung der Baseline-DCF-Fluoreszenz wurden die Zellen mit 200 uM H 2 O 2 behandelt, und die Veränderung der DCF-Fluoreszenz wurde beurteilt. Eine Erhöhung des DCF-Fluoreszenz spiegelt der Anstieg der ROS Ebenen auf H 2 O 2-Behandlung (E). Quantitative Analyse des Wandels in DCF-Fluoreszenz vor und nach der H 2 O 2-Behandlung ist in Panel F. Skala bar = 10 pm gezeigt Video.7.1 - labmedia 2704_Joshi.avi Live Cell Imaging von TMRM in kortikalen Neuronen vor und nach FCCP zusätzlich mit 40X-Objektiv. Die Falschfarben-Intensität zeigt ein Maximum (leuchtend gelb, bevor FCCP Addition) und zurück (rote Farbe, nach FCCP Addition) TMRM Fluoreszenzintensität nach FCCP hinaus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2704/supplemental_video1.avi">Klicken Sie hier, um Video anzusehen</a> Video. 7,5 - labmedia 2704_Joshi.avi Live Cell Imaging von DCF in kortikalen Neuronen vor und nach der H 2 O 2-Zugabe mit 40X-Objektiv. Die Baseline-DCF-Fluoreszenz hat hellgrüne Farbe in Zellkörper und H2O2 Zusätzlich erhöht sich die DCF Fluoreszenzintensität auf leuchtend grüne Farbe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2704/supplemental_video2.avi">Klicken Sie hier, um Video anzusehen</a>

<ol><li>Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+dissociated+mouse+cortical+neuron+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li>
<li>Scaduto, R. C. Jr, Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys. J. 76, 469-477 (1999).</li>
<li>Ward, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+%28AICD%29+disrupts+actin+dynamics+and+mitochondrial+bioenergetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The amyloid precursor protein intracellular domain (AICD) disrupts actin dynamics and mitochondrial bioenergetics.</a> J. Neurochem. 113, 275-284 (2010).</li>
<li>Gunasekar, P. G., Kanthasamy, A. G., Borowitz, J. L., Isom, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor+activation+produces+concurrent+generation+of+nitric+oxide+and+reactive+oxygen+species%3A+implication+for+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor activation produces concurrent generation of nitric oxide and reactive oxygen species: implication for cell death.</a> J. Neurochem. 65, 2016-2021 (1995).</li>
</ol>

Wir haben eine Schritt-für-Schritt-Verfahren beschreiben, wie ΔΨm und ROS in Ratte kortikalen Neuronen mit dem fluoreszierenden Indikatoren TMRM und H 2 DCF-DA, bzw. festzustellen, vorgestellt. Für andere Zelltypen, ist es wichtig, empirisch bestimmt die endgültige Konzentration und Ladezeit für TMRM oder H 2 DCF-DA. Im Allgemeinen TMRM Konzentrationen liegen im Bereich von 20 bis 200 nM, und die Zelle Inkubationszeit mit TMRM variiert von 20 bis 60 min. Die Endkonzentration von H 2 DCF-DA reicht von 2-10 um, und die Inkubation von Zellen in einem Laden-Lösung mit diesem Indikator variiert von 30 bis 45 min. Es ist wichtig, die Laserleistung und Scan-Geschwindigkeit von unter die Bilder, um sowohl photo-Toxizität für die Zellen und Veränderungen in der Fluoreszenz-Intensität (z. B. Flackern TMRM Fluoreszenz) in Ermangelung einer Stimulus zu vermeiden optimieren. Das optimierte optische Einstellungen sollten in einem Fluoreszenz-Signal, das nicht über oder unter gesättigten (Schwelle) in Abwesenheit des Stimulus führen. Die optimalen Bedingungen, um die Bilder aus einem ausgewählten Feld an einer bestimmten Laserleistung und eine Scan-Geschwindigkeit sammeln werden erzielt, wenn es keine Änderungen in der Fluoreszenz-Intensität der Sonde in das Fehlen jeglicher Anreiz für 10-15 min von Live-Bildgebung. Andere Fluoreszenz-Sonden an ΔΨm bestimmen, sind Rhodamin 123 und Tetra methyl Rhodamin Ethylester (TMRE). Allerdings waren sie zu finden, um die Atemwege Prozesse in isolierten Mitochondrien 2 hemmen. Wichtig ist, dass TMRM keinen Einfluss auf die mitochondriale Atmung bei niedrigen Konzentrationen 2 und hat einen geringen Phototoxizität und Ausbleichen 3 im Vergleich mit anderen Sonden. H 2 DCF-DA ist ein guter Indikator für ROS, wie sie ist gut in den Zellen erhalten und erkennt verschiedene Oxidantien, wie Peroxide, Superoxide und Salpetersäure Oxid 4.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenz </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> Glasboden Kulturschale </td><td> MatTek Inc. </td><td> P35G-1,5-14-C </td></tr><tr><td> NbActive4 </td><td> BrainBits </td><td> NbActive4 </td></tr><tr><td> TMRM </td><td> Invitrogen </td><td> T668 </td></tr><tr><td> H 2 DCF-DA </td><td> Invitrogen </td><td> C400 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S6191 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P3911 </td></tr><tr><td> CaCl 2 • 2H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3306 </td></tr><tr><td> MgCl 2 • 6H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M2670 </td></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> Sigma </td><td> G6152 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td></tr></tbody></table>

bestimmung des mitochondrialen membranpotentials und reactive oxygen species in live rat kortikalen neuronen

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Mitochondrialen Membranpotentials (ΔΨm) ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der physiologischen Funktion der Atmungskette zur ATP zu generieren. Ein signifikanter Verlust von ΔΨm macht Zellen von Energie mit anschließender Tod erschöpft. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind wichtige Signalmoleküle, aber ihre Häufung in pathologischen Zuständen führt zu oxidativem Stress. Die beiden wichtigsten Quellen von ROS in der Zelle sind Umweltgifte und den Prozess der oxidativen Phosphorylierung. Mitochondriale Dysfunktion und oxidativer Stress in der Pathophysiologie vieler Krankheiten in Verbindung gebracht, daher die Fähigkeit, ΔΨm und ROS bestimmen kann wichtige Hinweise über die physiologischen Zustand der Zelle und die Funktion der Mitochondrien liefern. Mehrere Fluoreszenzsonden (Rhodamin 123, TMRM, TMRE, JC-1) kann verwendet werden, um Δψm in einer Vielzahl von Zelltypen zu bestimmen, und viele Fluoreszenz-Indikatoren (Dihydroethidium, Dihydrorhodamin 123, H 2 DCF-DA) kann verwendet werden, um ROS bestimmen . Fast alle der verfügbaren Fluoreszenz-Sonden verwendet werden, um ΔΨm oder ROS beurteilen einzigen Wellenlänge Indikatoren, die erhöhen oder verringern ihre Fluoreszenzintensität proportional auf einen Stimulus, erhöht oder verringert die Höhe der ΔΨm oder ROS. So ist es unerlässlich, die Fluoreszenz-Intensität dieser Sonden an der Grundlinie auf und nach der Anwendung eines spezifischen Reiz zu messen. Dies erlaubt es, den Prozentsatz der Änderung in der Fluoreszenzintensität zwischen der Grundlinie Ebene und einen Stimulus zu bestimmen. Diese Änderung in der Fluoreszenz-Intensität spiegelt die Veränderung der relativen Werte von ΔΨm oder ROS. In diesem Video zeigen wir, wie die Fluoreszenz-Indikator, TMRM, in Ratte kortikalen Neuronen beziehen sich auf die prozentuale Veränderung in TMRM Fluoreszenzintensität zwischen der Grundlinie auf und nach der Anwendung FCCP, eines mitochondrialen Entkoppler zu bestimmen. Die unteren Ebenen der TMRM Fluoreszenz aus FCCP Behandlung spiegeln die Depolarisation des mitochondrialen Membranpotentials. Wir zeigen auch, wie die Fluoreszenz-Sonde H 2 DCF-DA beziehen sich auf die Ebene von ROS in kortikalen Neuronen, zuerst an der Basislinie zu beurteilen und dann nach der Anwendung von H 2 O 2. Dieses Protokoll (mit kleinen Änderungen) kann auch verwendet werden, um Änderungen in ΔΨm und ROS in verschiedenen Zelltypen und in Neuronen von anderen Hirnregionen isoliert zu bestimmen.

Wir demonstrieren die Anwendung der Fluoreszenz-Indikator, TMRM, in kortikalen Neuronen, die relativen Veränderungen in TMRM Fluoreszenzintensität vor und nach der Anwendung eines bestimmten Stimulus zu bestimmen. Wir zeigen auch die Anwendung der Fluoreszenz-Sonde H<sub&gt; 2</sub&gt; DCF-DA auf die relative Höhe der reaktiven Sauerstoffspezies in kortikalen Neuronen zu beurteilen.

Bestimmung des mitochondrialen Membranpotentials und Reactive Oxygen Species in Live Rat kortikalen Neuronen

Das mitochondriale Membranpotenzial (&Delta;&Psi;m) ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der physiologischen Funktion der Atmungskette zur Generierung von ATP. Ein ...

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das mitochondriale Membranpotential und die Konzentrationen reaktiver Sauerstoffspezies in primären kortikalen Neuronen mithilfe der fluoreszierenden Sonden TMRM bzw. H 2D CFD zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Stammlösungen und Arbeitskonzentrationen von TMRM und H 2D CFDA hergestellt werden. Im zweiten Schritt werden die kortikalen Neuronen 45 Minuten lang bei Raumtemperatur in Thai-Roads-Puffer mit TMRM und H 2D CFDA inkubiert.Der dritte Schritt besteht darin, die Fluoreszenzintensität von TMRM und DCF in lebenden kortikalen Neuronen unter Verwendung von 515/517 nm bzw. 488/515 nm Anregungs- und Emissionswellenlängen zu messen. Die Änderungen der TMR-Fluoreszenz werden in Gegenwart des mitochondrialen Entkopper FCCP überwacht, während die Änderungen der DCF-Fluoreszenz in Gegenwart von Wasserstoffperoxid beobachtet werden. Der letzte Schritt dieses Verfahrens ist die Sammlung, Normalisierung und Analyse der Daten.Schließlich werden die Ergebnisse durch die Erstellung eines Diagramms erhalten, das die relativen Konzentrationen der TMRM- und DCF-Fluoreszenzintensität vor und nach der Behandlung mit FCCP bzw. Wasserstoffperoxid zeigt. Hallo, ich bin Joanna Koska. Willkommen in meinem Labor an der Loyola University Chicago.Heute zeigen wir Ihnen, wie man das mitochondriale Membranpotential und reaktive Sauerstoffspezies in kortikalen Neuronen von Ratten misst. Das Verfahren wird von dhi demonstriert. Hallo, ich bin Denise Jossi.Mithilfe dieses Verfahrens kann das mitochondriale Membranpotential auf Einzelmitochondrien-Ebene und die reaktiven Sauerstoffspezies auf Einzelzell-Ebene gemessen werden. Beginnen wir also. Bereiten Sie einen 10-Millimolar-Stock von TMRM vor, indem Sie fünf Milligramm TMRM in einem Milliliter wasserfreiem Dimethylsulfoxid auflösen und eine Minute lang verwirbeln.Anschließend Aliquots herstellen und diese bei minus 20 Grad Celsius lagern. Vor Licht schützen und innerhalb eines Monats verwenden. Danach einen 10-Millimolar-Stock von H2DCFDA herstellen, indem 4,87 Milligramm H2DCFDA in einem Milliliter wasserfreiem Dimethylsulfoxid gelöst werden.Entsprechend wirbeln Sie eine Minute lang und stellen Aliquots her, die bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Schützen Sie vor Licht und verwenden Sie innerhalb einer Woche, um die kortikalen Rattenneuronen zuerst mit TMRM zu beladen. Waschen Sie die kultivierten Neuronen dreimal mit Tyro-Puffer.Dann bereiten Sie 20 Nanomolar TMRM vor, indem Sie den 10-Millimolar-TMRM-Stammlösung 1000-fach in TB verdünnen. Geben Sie anschließend zwei Mikroliter der verdünnten TMRM pro Milliliter TB hinzu. Inkubieren Sie die Neuronen 45 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur mit TMRM.Nach 45 Minuten die Kulturschale auf den Mikroskoptisch montieren und die Bildaufnahme beginnen, um die kortikalen Rattenneuronen mit H 2D CFDA zu beladen; danach die kultivierten Neuronen dreimal mit tb waschen. Anschließend zwei Mikromolar H 2D CFDA herstellen, indem der 10-Millimolar-H 2D CFDA-Stammlösung 10-mal in tb verdünnt wird. Danach zwei Mikroliter verdünntes H 2D CFDA pro ein Milliliter tb hinzufügen.Anschließend inkubieren Sie die Neuronen nach 45 Minuten 45 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur mit H2DCFDA. Waschen Sie die Neuronen viermal mit TB, um überschüssigen fluoreszierenden Indikator zu entfernen, bevor Bilder aufgenommen werden, um eine Live-Bildgebung der mit TMRM inkubierten Neuronen mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie durchzuführen, wobei ein Live-Zeitreihen-Programm verwendet wird. Wenden Sie niedrige Auflösung und abgeschwächte Laserleistung an, um die zur Bildaufnahme benötigte Zeit zu minimieren und eine Photo-Bleiche zu vermeiden.Als Nächstes stellen Sie die Fokussierung der mit TMRM beladenen, montierten Neuronen unter Verwendung von reflektiertem Licht ein. Untersuchen Sie die TMRM-Fluoreszenz durch Beleuchtung bei fünf 14 Nanometer und Detektion bei fünf 70 Nanometer. Stellen Sie die Detektionsverstärkung der Kamera knapp unterhalb des Sättigungsniveaus ein, sobald alle Parameter – einschließlich Auflösung, Laserleistung, Detektionsverstärkung der Kamera und Zeitrafferintervall zur Bildaufnahme – festgelegt sind.Ändern Sie diese Einstellungen zwischen den Experimenten nicht. Ändern Sie anschließend das Feld. Beginnen Sie mit der Aufnahme von Bildern, um Änderungen des Delta-PSI-M-Stimulus zu testen, beispielsweise kann ein Mikromolar FCCP oder zwei Mikrogramm pro Milliliter Oligomycin zugegeben werden, wodurch das mitochondriale Membranpotenzial jeweils signifikant depolarisiert oder hyperpolarisiert wird.Diese Veränderungen äußern sich in einer Abnahme der TMRM-Fluoreszenzintensität im Vergleich zur Basislinien-Fluoreszenzintensität im Fall von FCCP oder in einer Zunahme der TMRM-Fluoreszenzintensität. Im Fall eines LIGA myin sin zur Durchführung der Live-Bildgebung von Neuronen, die zuvor mit H2DCFDA inkubiert wurden, montieren Sie zunächst die Kulturschale auf dem Objekttisch eines Mikroskops und stellen Sie die Fokussierung der Zellen mithilfe von Reflexlicht ein. Untersuchen Sie die DCF-Fluoreszenz durch Anregung bei 488 Nanometern und Emission bei 515 Nanometern.Als Nächstes stellen Sie die Laserleistung auf fünf bis 7 % ein, um eine Verstärkung und eine Auflösung von 256 mal 256 zu detektieren. Ändern Sie diese Einstellungen zwischen den Experimenten nicht. Stellen Sie anschließend die Frequenz zur Aufnahme von Live-Bildern ein.Wählen Sie mithilfe des Zeitreihenprogramms ein neues Feld aus und beginnen Sie mit der Aufnahme von Bildern, um Änderungen der ROS-Spiegel zu detektieren. Behandeln Sie die Zellen mit 100 bis 200 Mikromolar Wasserstoffperoxid. Dies wird sich in einer Zunahme der DCF-Fluoreszenzintensität im Vergleich zum Ausgangsniveau widerspiegeln.Verwenden Sie das Werkzeug für den Bereich von Interesse (ROI) aus dem LSM-Programm, um die Bereiche auszuwählen. Wählen Sie anschließend ROIs aus mitochondrialen Regionen oder ROIs aus dem gesamten Zellkörper in den Bildzellen aus, um die Fluoreszenzintensitäten von TMRM bzw. ROS zu messen.Wählen Sie Bereiche neben den Zellen aus. Um die Hintergrund-Fluoreszenzintensität zu berechnen, nehmen Sie mehrere Messungen vor und ermitteln den Durchschnittswert der Hintergrundintensität. Subtrahieren Sie anschließend die durchschnittliche Hintergrund-Fluoreszenzintensität von den durchschnittlichen Fluoreszenzintensitäten der interessierenden Bereiche in jeder Zelle für jeden Zeitpunkt mithilfe von Microsoft Excel. Nach der Subtraktion der Hintergrundintensität normalisieren Sie die TMRM- oder DCF-Fluoreszenzintensität auf die Basislinien-Fluoreszenz.Mithilfe dieser Formel verwenden Sie anschließend das SigmaPlot-Programm, um die Darstellung der Änderungen der Fluoreszenzintensität über die Zeit zu erstellen. Hier sehen Sie ein Beispiel eines Fluoreszenzbildes von kortikalen Rattenneuronen, die mit TMRM inkubiert wurden. Die Zugabe von F-C-C-P-A, einem mitochondrialen Entkoppler, führt zu einer mitochondrialen Depolarisation und einem Verlust der TMRM-Fluoreszenzintensität.Das Ausgangsniveau der TMRM-Fluoreszenz bleibt vor der Zugabe von FCCP stabil. Die quantitative Analyse der zeitlichen Änderungen der TMRM-Fluoreszenz zeigt eine signifikante Abnahme der TMRM-Fluoreszenz nach der Zugabe von FCCP. Hier sehen Sie ein Beispiel eines Fluoreszenzbildes von mit DCF beladenen kortikalen Rattenneuronen.Das Ausgangsniveau der DCF-Fluoreszenz bleibt unverändert in den ersten 120 Sekunden vor der Zugabe von Wasserstoffperoxid. Die Zugabe von Wasserstoffperoxid führt zu einer Zunahme der DCF-Fluoreszenzintensität in den Zellkörpern. Zeitverzögerte Messungen der DCF-Fluoreszenz zeigen konstante Werte, die nach Behandlung mit Wasserstoffperoxid angestiegen sind.Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, eine niedrige Laserleistung und eine hohe Abtastgeschwindigkeit zu verwenden, um Artefakte durch Photobleichen und Phototoxizität zu vermeiden. Viel Erfolg bei Ihrem Experiment.

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Das mitochondriale Netzwerk ist extrem komplex, was die Analyse sehr schwierig macht. Ein neuartiges MATLAB-Tool analysiert konfokal abgebildete Mitochondrien in Zeitrafferbildern, führt jedoch zu einem großen Ausgabevolumen, das individuelle manuelle Aufmerksamkeit erfordert. Um dieses Problem zu lösen, wurde eine Routineoptimierung entwickelt, die eine schnelle Dateianalyse ermöglicht.

Optimierte automatisierte Analyse der homöostase-Modulation lebender neuronaler Mitochondrien durch isoformspezifische Retinsäurerezeptoren

Dieses Protokoll stellt einen Arbeitsablauf für die Vermehrung, Differenzierung und Färbung von kultivierten SH-SY5Y-Zellen und primären Hippocampusneuronen der Ratte für die Visualisierung und Analyse der mitochondrialen Ultrastruktur unter Verwendung der stimulierten Emissionsverarmungsmikroskopie (STED) dar.

Verwendung von Lebendzell-STED-Bildgebung zur Visualisierung der mitochondrialen Innenmembran-Ultrastruktur in neuronalen Zellmodellen

In dieser Studie beschreiben wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll und betonen die wichtigsten Details zur Bestimmung morphologischer Eigenschaften von Mitochondrien in lebenden Zellen, einschließlich Probenvorbereitung, Bildaufnahme und Datenanalyse. Diese Methode wird häufig verwendet, um die mitochondriale Morphologie zur Untersuchung verschiedener Erkrankungen zu untersuchen.

Bestimmung der mitochondrialen Morphologie in lebenden Zellen mittels konfokaler Mikroskopie

Lernen Sie die Bestimmung des mitochondrialen Membranpotentials und reaktiver Sauerstoffspezies in lebenden kortikalen Neuronen mit den Fluoreszenzsonden TMRM und H2D CFDA. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Monitoring mitochondrialer Dynamiken.

Bestimmung des mitochondrialen Membranpotentials und Reactive Oxygen Species in Live Rat kortikalen Neuronen

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