Ein Protokoll für die Computer-Based Protein Structure and Function Prediction

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ausgehend von der Aminosäuresequenz computergestützt die dreidimensionalen Strukturen und die biologische Funktion von Proteinmolekülen vorherzusagen. Dies wird erreicht, indem zunächst mittels maschinellen Lernens die Sekundärstruktur der Proteine vorhergesagt wird. Anschließend werden die Sequenzen und die vorhergesagte Sekundärstruktur mit den aufgeklärten Strukturen in der PDB-Bibliothek abgeglichen, um die bestmöglichen Strukturvorlagen zu identifizieren.

Dieses Verfahren wird als „Threading“ bezeichnet. Nach dem Threading-Verfahren teilt das IT-AER-Programm die Vorlagen basierend auf den Sequenzvorlagenalignments in Fragmente auf und setzt diese Fragmente im dritten Schritt zu Modellen voller Länge wieder zusammen. Vollständige atomare Modelle werden durch Verfeinerungen auf atomarer Ebene konstruiert, um Wasserstoffbrückennetzwerke zu optimieren und sterische Überlappungen zu entfernen.

Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die biologische Funktion der Proteine zu bestimmen, indem die vorhergesagten Strukturen mit Proteinen bekannter Funktion in der Funktionsbibliothek abgeglichen werden. Der Hauptvorteil von ITER gegenüber bestehenden Strukturmodellierungsmethoden ist der integrierte Ansatz der Strukturfragmentzusammenstellung, der die Fadenläufungsalignment kontinuierlich in Richtung des nativen Zustands lenken kann. Diese hochwertigen Strukturmodelle bilden zudem die Grundlage für genaue, strukturbasierte funktionelle Annotationen, was die Nutzung von ITER in der wissenschaftlichen Gemeinschaft fördert.

Unser Labor hat eine Website bereitgestellt, auf der die Proteinsequenzen für iter eingereicht werden können. Diese Website fungiert als zentrale Schnittstelle, über die Benutzer weltweit eine Verbindung zu einem Computercluster registrieren können, der ITER-Simulationen verwaltet und ausführt. Ein ITER-Simulationsauftrag besteht aus mehr als einem Dutzend kleinerer Teilsimulationen.

Solche Simulationen können auf einem einzelnen Computer mit einem einzelnen Prozessorkern über hundert Stunden in Anspruch nehmen. Der Computercluster des Zang-Labors übernimmt diese Teilsimulationen und verteilt sie auf Hunderte von Computern und ist in der Lage, über 2000 Simulationen durchzuführen. Gleichzeitig mit unserem Computercluster können wir täglich Hunderte von I-Taster-Simulationen abschließen.

Auch bei dieser Kapazität muss noch viel Arbeit geleistet werden, um das System zu optimieren und die Wartezeit für unsere Online-IT-AER-Nutzer zu minimieren. Um mit dem Experiment zur Struktur- und Funktionsmodellierung zu beginnen, melden Sie sich auf der IT-AER-Webseite an. Die URL-Adressen für alle hier besprochenen relevanten Webseiten finden sich im schriftlichen Protokoll.

Kopieren und fügen Sie die Aminosäuresequenz in das vorgesehene Formular ein, oder laden Sie die Sequenz direkt hoch, indem Sie auf die Schaltfläche „Durchsuchen“ klicken. Geben Sie eine E-Mail-Adresse und einen Namen für den Auftrag an. Benutzer können optional externe Restriktionen für Kontakte oder Abstände zwischen Resten angeben.

Fügen Sie während des Strukturmodellierungsprozesses eine zusätzliche Vorlage hinzu oder schließen Sie bestimmte Vorlagenproteine aus. Um die Sequenz einzureichen, klicken Sie auf die Schaltfläche „run it taser“. Überprüfen Sie den Status des eingereichten Auftrags, indem Sie die IT-taser-Warteschlangenseite aufrufen.

Klicken Sie auf den Suchreiter und verwenden Sie die Auftrags-ID-Nummer oder die Abfolgeabfrage, um nach dem eingereichten Auftrag zu suchen. Nach Abschluss der Struktur- und Funktionsmodellierung wird eine Benachrichtigungs-E-Mail mit einem Bild der vorhergesagten Strukturen und einem Web-Link an die angegebene E-Mail-Adresse gesendet. Klicken Sie auf diesen Link, um die Ergebnisse anzusehen und herunterzuladen.

Beginnen Sie die Strukturanalyse mit der Untersuchung der Sekundärstrukturvorhersage, die als H für Alpha-Helix, S für Beta-Faltung oder C für Coil dargestellt wird. Berücksichtigen Sie außerdem die Vertrauenswürdigkeit der Vorhersage für jeden Rest. Suchen Sie nach Bereichen mit langen Abschnitten regelmäßiger Sekundärstrukturvorhersagen, um den Kernbereich des Proteins abzuschätzen.

Die strukturelle Klasse des Proteins kann ebenfalls anhand der Verteilung der sekundären Strukturelemente analysiert werden. Zeigen Sie die vorhergesagte Löslichkeitszugänglichkeit an, um vergrabene und lösungsmittelzugängliche Bereiche zu identifizieren. Bei den Abfrageergebnissen reicht die Skala der vorhergesagten Löslichkeitszugänglichkeit von einem Wert von null für einen vergrabenen Rest bis zu einem Wert von neun für einen exponierten Rest.

Bereiche, die hauptsächlich vergrabene Reste enthalten, können verwendet werden, um den Kernbereich des Proteins abzugrenzen, während Bereiche mit lösungsmittel-exponierten und hydrophilen Resten potenzielle Hydratations- oder Funktionsstellen darstellen. Um die vorhergesagten tertiären Strukturen des Anfrageproteins anzusehen, scrollen Sie nach unten zum angezeigten interaktiven JMO-Applikat links. Klicken Sie auf das Applikat, um die Darstellung der angezeigten Struktur zu ändern.

Vergrößern Sie einen bestimmten Bereich, wählen Sie spezifische Resttypen im vorhergesagten Modell aus oder berechnen Sie die Abstände zwischen Resten. Analysieren Sie die Konfidenzwerte der Strukturmodellierung, um die Qualität der vorhergesagten Strukturen einzuschätzen. Csco-Werte liegen typischerweise im Bereich von minus fünf bis zwei, wobei ein höherer Wert ein Modell besserer Qualität widerspiegelt.

Die geschätzte TM-Score- und RMSD-Werte des ersten Modells werden als geschätzte Genauigkeit von Modell eins angezeigt. Klicken Sie auf den Link „Weitere Informationen zu csco“. Um die Clustergröße und Clusterdichte von csco aller Modelle zu analysieren, untersuchen Sie die 10 besten Fadenvorlagen des Abfrageproteins, die von Low-Mets-Fadenprogrammen identifiziert wurden.

Indem Sie die Ergebnisseite nach unten scrollen, können Sie den normalisierten Z-Score zur Analyse der Qualität der Threading-Alignments einsehen. Alignments mit einem normalisierten Score größer als eins weisen auf eine verlässliche Ausrichtung hin und besitzen höchstwahrscheinlich denselben Faltungsmodus wie das Anfrageprotein. Untersuchen Sie die Sequenzidentität im Bereich des Threading-Alignments sowie für die gesamte Kette, um die Homologie zwischen dem Anfrage- und den Vorlagenproteinen zu beurteilen.

Eine hohe Sequenzidentität ist ein Hinweis auf verwandtschaftliche evolutionäre Beziehungen zwischen den Proteinen der Abfrage und der Vorlage. Betrachten Sie die farblich hervorgehobenen, im Threading ausgerichteten Reste, um konservierte Reste oder Motive in den Proteinen der Abfrage und der Vorlage visuell zu identifizieren. Eine höhere Sequenzidentität im Bereich der Threading-Ausrichtung im Vergleich zur Ausrichtung der gesamten Kette weist ebenfalls auf das Vorhandensein konservierter struktureller Motive oder Domänen in der Abfrage hin. Beurteilen Sie die Abdeckung der Threading-Ausrichtung durch Untersuchung der Ausrichtung.

Wenn die Abdeckung der besten Alignierung niedrig ist und nur auf einen kleinen Bereich des Query-Proteins beschränkt ist oder für einen langen Abschnitt der Query-Sequenz fehlt, deutet dies darauf hin, dass das Query-Protein mehr als eine Domäne enthält. In diesem Fall wird empfohlen, die Sequenz zu teilen und die Domänen einzeln zu modellieren. Sehen Sie sich die nächste Tabelle der Ergebnisseite an, um die 10 besten strukturellen Analoga des ersten vorhergesagten Modells zu ermitteln, wie sie vom Strukturalignierungsprogramm TM-align identifiziert wurden.

Ein TM-Score größer als 0,5 zeigt an, dass der ermittelte Analogon und das Modell eine ähnliche Topologie aufweisen und zur Bestimmung der strukturellen Klasse oder Proteinfamilie des Anfrageproteins verwendet werden können. Werte mit einem TM-Score unter 0,3 deuten auf eine zufällige strukturelle Ähnlichkeit hin. Analysieren Sie die Sequenzidentität und den RMSD im strukturell alignierten Bereich, um die Erhaltung räumlicher Motive im Modell und dem strukturellen Analogon zu beurteilen.

Überprüfen Sie visuell die farbigen und ausgerichteten Restepaare in der Alignierung, um diese strukturell konservierten Reste und Motive zu identifizieren. Sehen Sie sich die Tabelle der vorhergesagten EC-Nummern an, um die fünf wahrscheinlichsten enzymatischen OGs des Anfrageproteins einzusehen. Das Vertrauensniveau der EC-Nummernvorhersage unter Verwendung dieser Vorlagen wird als EC-Score basierend auf einer Benchmark-Analyse angezeigt.

Die funktionelle Ähnlichkeit zwischen der Anfrage- und der Vorlagenproteins kann zuverlässig anhand eines EC-Scores interpretiert werden, der größer als 1,1 ist. Prüfen Sie anschließend, ob bei den Vorlagen, die denselben Faltungsstruktur wie das Anfrageprotein aufweisen, eine funktionelle Übereinstimmung besteht. Wenn mehrere Vorlagen dieselbe EC-Nummer besitzen und der EC-Score größer als 1,1 ist, ist das Vertrauen in die Vorhersage sehr hoch.

Wenn jedoch die EC-Score hoch ist, aber unter den identifizierten Treffern kein Konsens besteht, wird die Vorhersage weniger zuverlässig, und die Nutzer sollten die Genontologie konsultieren. In der Ansicht der Termmvorhersagen wird die Tabelle der vorhergesagten Genontologie-Terme angezeigt, um die 10 besten Homologen des Anfrageproteins in der PDB-Bibliothek zu identifizieren, die mit Genontologie-Termen annotiert sind; jedes Protein ist in der Regel mit mehreren Genontologie-Termen assoziiert, die seine molekularen Funktionen, biologischen Prozesse und zellulären Lokalisationen beschreiben. Klicken Sie auf jeden Term, um die Amigo-Website zu besuchen und dessen Definition sowie Abstammung zu analysieren.

Analysieren Sie die Spalte mit dem funktionellen Homologiescore, um die funktionelle Ähnlichkeit zwischen den Anfrage- und Vorlagenproteinen zu beurteilen. Das Vertrauensniveau für die Übertragung der funktionellen Annotation von diesen Proteinen kann ebenfalls geschätzt werden. Rufen Sie die Konsensvorhersage der Genontologie-Terme-Tabelle auf, um die Übereinstimmung der Funktionen zwischen den Vorlagen zu analysieren.

Diese gängigen Funktionen dienen der Vorhersage der Genontologie-Terme des Anfrageproteins und der Bewertung des Konfidenzniveaus der Geo-Termen-Vorhersagen. Scrollen Sie schließlich bis zum Ende der Seite, um die 10 besten Vorhersagen für Ligandenbindungsstellen des Anfrageproteins anzuzeigen. Die vorhergesagten Bindungsstellen sind nach der Anzahl der vorhergesagten Ligandenbestätigungen sortiert, die sich eine gemeinsame Bindungstasche teilen. Die bestidentifizierte Bindungsstelle wird bereits in der JM OL-Applikation angezeigt.

Klicken Sie auf die Optionsfelder, um andere Vorhersagen zu analysieren und die mit dem Liganden wechselwirkenden Reste zu visualisieren. Der BS-Score zeigt die lokale Ähnlichkeit zwischen der Modellstruktur und der Bindungsstelle der Vorlagen an. Ein BS-Score größer als 1,1 weist auf eine hohe Sequenz- und Strukturähnlichkeit in der Nähe der vorhergesagten Bindungsstelle hin.

Im Modell im Vergleich zur bekannten Bindungsstelle in der Vorlage ist das IT eine Hauptwebseite, die Links zu weiteren nützlichen Funktionen enthält. Die Forenfunktion ermöglicht es dem Benutzer, ein Online-Konto zu erstellen und von anderen ITER-Nutzern Hilfe bei der Strukturmodellierung oder bei der Interpretation der Ergebnisse zu erhalten. Über die Download-Funktion können Benutzer iter und verwandte Pakete herunterladen und auf ihrem Computer installieren.

Dies hilft, die Zeit für die Durchführung der Modellierungsversuche zu verkürzen. Über die Warteschlangenfunktion kann der Status aller eingereichten Aufträge auf der IT a Q-Seite eingesehen werden. Benutzer können außerdem das Bild der modellierten Strukturen für abgeschlossene Aufträge visuell überprüfen.

Auf dieser Seite, die ebenfalls die erwartete TM-Score und die erwartete RMSD des ersten Modells sowie das hier angezeigte Einreichungsdatum zeigt, befindet sich ein Auszug aus der IT AER-Ergebnisseite, der die schneller formatierte Abfragesequenz, die vorhergesagte sekundäre Struktur sowie die zugehörigen Konfidenzwerte und die vorhergesagte Lösungsmittelzugänglichkeit der Reste darstellt. Der analysierte Kernbereich und die potenzielle Hydratationsstelle in der Abfrage sind jeweils mit cyan- und roten Rechtecken hervorgehoben. Hier werden die Vorhersagen der tertiären Struktur für die abgefragten Proteine gezeigt.

Die vorhergesagten Modelle werden in einer interaktiven JML-App-Ansicht angezeigt, die es dem Benutzer ermöglicht, die Darstellung des Moleküls zu ändern. Die Modelle können auch durch Klicken auf die Download-Links heruntergeladen werden; die Vertrauensbewertung zur Abschätzung der Modellqualität wird als csco angegeben. Ein Beispiel der itta A Ergebnisseite, die die 10 besten identifizierten Threading-Vorlagen und Alignments durch die Loomis-Threading-Programme zeigt, wird dargestellt.

Die Qualität der Fadenzuordnungen wird anhand des normalisierten Z-Scores bewertet, wobei ein Wert größer als eins eine verlässliche Zuordnung widerspiegelt. In der Vorlage ausgerichtete Reste, die mit den entsprechenden Anfrageresten identisch sind, werden farblich hervorgehoben, um das Vorhandensein eines konservierten Rests oder Motivs anzuzeigen. Umgekehrt weist das Fehlen einer Ausrichtung in den meisten der besten Vorlagen auf das Vorhandensein mehrerer Domänen im Anfrageprotein hin, und die nicht ausgerichteten Reste entsprechen den Domänenverknüpfungsbereichen.

Diese Tabelle zeigt die 10 besten identifizierten strukturellen Analoga und strukturellen Alignments, die vom TM-alignierten Strukturalignment-Programm ermittelt wurden. Die Rangfolge der Analoga basiert auf dem TM-Score des strukturellen Alignments. Ein TM-Score größer als 0,5 zeigt an, dass die beiden verglichenen Strukturen eine ähnliche Topologie aufweisen.

Während ein TM-Score unter 0,3 eine Ähnlichkeit zwischen zwei zufälligen Strukturen bedeutet, werden strukturell alignierte Restpaare basierend auf ihren Aminosäureeigenschaften farblich hervorgehoben, während nicht alignierte Bereiche durch einen Bindestrich angezeigt werden. Hier sehen Sie ein Beispiel der ITR-Ergebnisseite, die identifizierte Enzymhomologe des Anfrageproteins in der PDB-Bibliothek zeigt.

Die Vertrauensstufe der EC-Nummernvorhersage wird basierend auf der EC-Score analysiert, wobei ein EC-Score von mehr als 1,1 auf funktionelle Ähnlichkeit zwischen dem Anfragenprotein und dem Vorlagenprotein hinweist. Die Vorhersagetabelle für die Genontologie-Terme des Anfragenproteins enthält funktionelle Homologe des Anfragenproteins aus der Genontologie-Vorlagenbibliothek, die nach ihrem funktionellen Homologiescore sortiert sind. Gemeinsame funktionelle Merkmale dieser am höchsten bewerteten Treffer werden abgeleitet, um die endgültigen Vorhersagen der Genontologie-Terme für das Anfragenprotein zu generieren.

Die Qualität der vorhergesagten Gene-Ontology-Terme wird anhand des Geo-Scores geschätzt, wobei ein Geo-Score größer als 0,5 eine zuverlässige Vorhersage anzeigt, wie hier beispielhaft auf der Ergebnisseite von IT AZA gezeigt, die die Top-10-Vorhersagen für Protein-Liganden-Bindungsstellen mithilfe des Cofaktor-Algorithmus darstellt. Die Rangfolge der vorhergesagten Bindungsstellen basiert auf der Anzahl der vorhergesagten Ligandenbestätigungen, die sich eine gemeinsame Bindungstasche teilen. Der BS-Score der Abfrage ist ein Maß für die lokale Sequenz- und Strukturähnlichkeit zwischen der vorhergesagten Bindungsstelle und den Vorlagenbindungsstellen und ist nützlich zur Analyse der Erhaltung von Bindungsstellen-Taschen.

Obwohl ISER einer der effizientesten Algorithmen zur Vorhersage von Proteinstruktur und -funktion ist, ist es wichtig zu bedenken, dass es sich lediglich um eine Vorhersage durch Computer-Algorithmen handelt. Jede experimentelle Daten- oder Funktionsinformation, beispielsweise Informationen über Restkontaktbindungen, ist äußerst nützlich, um die Genauigkeit der Vorhersagen zu erhöhen. Der IT AER-Server verfügt über ein Portal, um diese Informationen während des Modellierungsverfahrens einzubeziehen, um dem wachsenden Interesse daran Rechnung zu tragen.

Aer hat das Zang-Labor die IT-AER-Software kostenlos für die nichtkommerzielle Forschung freigegeben. Wir entwickeln aktiv die IT-AER-Software weiter und verbessern den Eye Taster, in der Hoffnung, dass ihre Verfügbarkeit zu einer breiten Anwendung außerhalb des Zang-Labors führen und die Forschung in der wissenschaftlichen Gemeinschaft voranbringen und beflügeln wird.