Vorhersage von HIV-1 Korezeptor Usage (Tropismus) durch Sequenzanalyse mit einem Genotypische Ansatz

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Co-Rezeptor-Nutzung von HIV 1 für die Verabreichung einer neuen Klasse von antiretroviralen Medikamenten vorherzusagen. Dies wird erreicht, indem die viralen genomischen Nukleinsäuren, die virale RNA oder die provirale DNA aus dem Blut des Patienten nach Amplifikation der Hüllregion isoliert werden. Die virale V-3-Region, die die Hauptdeterminante für den Tropismus ist, wird durch verschachtelte PCR amplifiziert.

Als nächstes wird das V-3-Amplikon mit verschiedenen Primern sequenziert, um eine Fasta-Datei zu erzeugen. Es werden Ergebnisse erhalten, die den viralen Tropismus und die Anfälligkeit für Korezeptorantagonisten basierend auf der Falsch-Positiv-Rate oder FPR zeigen, wie sie mit dem Online-Interpretationstool geno to pheno coreceptor erhalten wurde. Je nach Verwendung des CORECEPTOR werden HIV-Viren als R fünf oder X vier klassifiziert.

Miri Rock bindet über den CCR-Fünf-Rezeptor und hemmt so den Eintritt von R-Fünf-Viren in die Zielzelle. Im Verlauf der Erkrankung können vier Viren auftauchen und die Viren R fünf überholen. Die Beendigung der Rezeptoranwendung, auch Tropismus genannt, ist daher vor der Verabreichung von Maraviroc obligatorisch, wie von EMA und FDA gefordert.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass man sehr einfach parallel die Resistenz gegen andere antiretrovirale Wirkstoffklassen bestimmen kann. Diese Methode ermöglicht eine viel persönlichere Medizin, da die Grenzwerte für die Tropismusergebnisse je nach den Bedürfnissen des Patienten geändert werden können. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals Anfang der neunziger Jahre, als wir die molekularen Grundlagen des unterschiedlichen Zellkulturwachstums von HIV-Stämmen und den Krankheitsverlauf bei Patienten kennenlernen wollten.

Die Proben werden am klinischen Standort als EDTA-Blut entnommen und an das Labor geschickt, um mit der Isolierung von HIV-Nukleinsäuren aus 1000 Mikrolitern Vollblut, Serum oder Plasma mit dem mag pure compact-System und dem Nukleinsäure-Isolationskit gemäß den Anweisungen des Herstellers zu beginnen. Die gewonnene RNA oder DNA wird dann in 50 Mikroliter TE-Puffer eingespeist. Der nächste Schritt besteht darin, die Hüllregion der Nukleinsäure durch reverse Transkriptions-PCR für RNA oder einfach PCR für DNA, wie im Text beschrieben, zu amplifizieren, die Reaktion sollte ein 1.245 Basenpaar langes Produkt erzeugen, das den Großteil der Hüllproteinregion umfasst, um die V-3-Region des Hüllproteins zu amplifizieren, gefolgt von einer verschachtelten PCR unter Verwendung von fünf Mikrolitern aus der ersten PCR-Reaktion als Vorlage.

Bereiten Sie die Reaktionen mit dem Mastermix für die nested Inhouse-PCR vor, wie im Text beschrieben. Dort werden auch Parameter für die Ausführung der verschachtelten PCR beschrieben. Nach der Amplifikation der V-3-Region wird das PCR-Produkt analysiert, um das erwartete Produkt bei einer Länge von 902 Basenpaaren durch Gelelektrophorese vor der Sequenzierung zu verifizieren.

Reinigen Sie das PCR-Produkt wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Sobald das PCR-Produkt aufgereinigt wurde, führen Sie die Sequenzierungsreaktion nach Abschluss der Reaktion wie im Text beschrieben durch. Reinigen Sie die Sequenzierproben mit Cidex G 50 superfein und einer Multi-Screen-Filterplatte mit Durapore-Membran gemäß den Anweisungen im schriftlichen Teil dieses Verfahrens, um das gereinigte Produkt zu sequenzieren, bereiten Sie den Sequenzierer vor, indem Sie das Polymer überprüfen und den Puffer wechseln.

Laden Sie dann die Samples, legen Sie die Bedingungen fest, und starten Sie den Lauf. Nach dem Sequenzlauf. Das DNA-STAR-Laser-Genprogramm kann verwendet werden, um die Sequenzen auszurichten und zu bearbeiten.

Das V-Amplikon mit drei Amplikon wird mit mindestens einem Vorwärts- und einem Rückwärts-Primer sequenziert. Das Laser-Gen gleicht die vom Sequenzierer erhaltenen ABI-Dateien mit den Referenzsequenzen ab. V drei, Konsensus B und Hülllaser-Gen erstellt eine Konsensussequenz der analysierten Probe unter Verwendung aller verfügbaren Rohdaten, jedoch nicht der Referenzen, und speichert sie als FASTA-Datei.

Die FASTA-Datei ist eine Textdatei, die einen Header mit dem Namen der Probe und der Nukleotidsequenz enthält. Um mit der Dateninterpretation und der Tropismusvorhersage zu beginnen, laden Sie die FASTA-Datei in das webbasierte Interpretationssystem hoch. Geno Tono Co-Rezeptoren wählen den FPR-Cutoff, bis zu dem das Virus als R fünf klassifiziert wird.

Nach den deutschen Richtlinien wird das Virus als R fünf eingestuft. Wenn die FPR größer oder gleich 20 % und X vier ist, wenn die FPR weniger als 12,5 % beträgt, wählen Sie alle zusätzlichen klinischen Parameter aus, falls verfügbar, und wählen Sie dann aus, richten Sie sie aus und sagen Sie sie voraus. Dieser Server übersetzt die Nukleotidsequenz in Aminosäuren, gleicht sie mit der B-Konsensussequenz von V drei aus und erstellt eine Subtypklassifizierung. Darüber hinaus generiert es eine Vorhersage der Co-Rezeptor-Nutzung, ausgedrückt als FPR.

Die Ausgabe zeigt eine abgestufte Interpretation, abhängig von der Wahrscheinlichkeit der Co-Rezeptor-Nutzung. Bei hohen FPR-Werten ist man sich ziemlich sicher, dass das Virus nicht X vier ist, und bei niedrigen FPR ist man sich nicht sicher, wie das Virus aussieht, wenn die Interpretation, der Text und die Hintergrundfarbe grün sind. Eine sichere Verabreichung von Ravi Rock ist angezeigt, während Gelb auf ein mögliches geringes Risiko für die Anwendung von Ravi Rock hinweist und Rot darauf hinweist, dass Ravi Rock nicht verschrieben werden sollte.

Zusätzlich generiert der Server einen PDF-Bericht, der ausgedruckt und an den Arzt gesendet werden kann. Zusätzliche Daten wie der Name des Patienten oder das Datum der Blutentnahme können manuell mit einem PDF-Writer-Programm eingefügt werden. In der Privatsphäre des Computers des Benutzers können auch spezifische Kommentare hinzugefügt werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die viralen Hacken mit dem Geno-Phänorezeptor-Tool bestimmen können. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, regelmäßig Qualitätskontrollen durchzuführen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit HIV extrem gefährlich sein kann, daher sollten immer Vorsichtsmaßnahmen und autorisierte biologisch sichere Laboratorien verwendet werden.