Peptid-basierte Identifizierung von Functional Motive und ihre Bindungspartner

Dieses Video zeigt eine Reihe von vier Experimenten, die zur Identifizierung von funktionellen HIV-1-NPH-Proteinmotiven und zur Entwicklung peptidbasierter Inhibitoren verwendet wurden. Spezifische kurze Peptide, die von Motiven abgeleitet sind, die in Proteinen in voller Länge vorkommen, behalten beide ihre biologische Funktion bei und hemmen kompetitiv die Funktion des Proteins in voller Länge, um apoptotische Motive zu identifizieren. Bei HIV werden NEF-Jerk-Cat-Zellen NEF-Scanning-Peptiden ausgesetzt und ein Tunnel-Apoptose-Assay wird durchgeführt, um Peptide zu identifizieren, die Apoptose induzieren.

Ein zweiter Satz von Peptiden, die Variationen eines NEF-Sekretionsmotivs enthalten. Die Sekretionsmodifikationsregion oder SMR wird zusammen mit dem NPH-GFP-Funktionsverlust aufgrund kompetitiver Hemmung in die Zellen transfiziert, was durch eine verminderte Sekretion von nph angezeigt wird. GFP wird durch Fluorometrie untersucht, um zelluläre Faktoren zu identifizieren, die mit der Sekretionsmodifikationsregion (SMR) von nef interagieren.

Die Niederschläge werden mit SMR-Wildtyp NPH als Köder durchgeführt. Um zu testen, ob diese Wechselwirkungen die Sekretion beeinflussen, werden schließlich Antikörper gegen identifizierte Bindungspartner in Zellen transfiziert. Um zu beurteilen, ob sie die Sekretion des NF-Motivs antagonisieren, identifizieren die erhaltenen Ergebnisse zwei funktionelle apoptotische Motive in NEF und ein Inhibitorpeptid, das ein funktionelles NEF-Sekretionsmotiv sowie seine zellulären Bindungspartner, die für die Sekretion erforderlich sind, antagonisiert.

Das übergeordnete Ziel dieser Reihe von vier Experimenten ist es, die Identifizierung funktioneller Motive in Zielproteinen zu beschleunigen und diese Daten dann zur Entwicklung von Peptid-Base-Inhibitoren dieser funktionellen Motive zu nutzen. Diese Protokolle waren für unsere Gruppe nützlich, da sie uns geholfen haben, Schlüsselfragen im Zusammenhang mit der HIV-Pathogenese zu beantworten, wie z.B. das Verständnis der Rolle der nephgesteuerten Sekretion in der Pathogenese und die Entschlüsselung der Mechanismen, die der Fähigkeit von Neff zugrunde liegen, den exosomalen Transportweg zu manipulieren. Heute wird Dr. Ming Bo Huang, der Forschungslehrer in meinem Labor ist, die Verfahren demonstrieren.

Beginnen Sie dieses Verfahren mit einer Reihe von Peptiden, die den für dieses Experiment interessierenden Bereich scannen. 20 Mer-Peptide mit einer Überlappung von 10 Aminosäuren, die sich über das gesamte HIV-1-NPH-Protein erstrecken, wurden aus dem AIDS-Reagenzienprogramm gewonnen. Um apoptotische NPH-Motive zu identifizieren, führen Sie einen Apoptose-Assay mit den NEF-Scan-Peptiden einzeln wie folgt durch, fügen Sie einen Milliliter Kulturmedium mit 10 Nanogramm pro Milliliter Peptid pro 35-Millimeter-Platte Jerk-Hat, Zellkulturen hinzu und inkubieren Sie die Kulturen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Nach der Inkubation ist ein terminaler Desoxynukleotidtransferase-vermitteltes DUTP, Biotin-Nick- und Markierungs- oder Tunnelassay zur Beurteilung der Apoptose durchzuführen. Um dies zu tun, waschen Sie zuerst die Zellen mit PBS, dann aspirieren Sie das PBS und fügen Sie 4%Paraformaldehyd in PBS hinzu, inkubieren Sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Zellen zu fixieren, waschen Sie sie mit PBS und fügen Sie Triton X 100 hinzu, inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur, um sie zu permatisieren. Nach der Fixierung und Durchlässigkeit der Zellen wird das Tunnelreagenz hinzugefügt und die Zellen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubiert.

Spülen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Bestimmen Sie dann den Prozentsatz der gefärbten Zellen durch Epi-Fluoreszenz auf einem computergesteuerten Mikroskopiesystem. Nach der Transektion von jca-Zellen mit NPH, GFP-Plasmid und verschiedenen Variationen des SMR-Peptids unter Verwendung eines Chariot-Protein-Delivery-Reagenzien-Kits, wie im Begleitdokument beschrieben, wird das Medium zur Bestimmung der Transfektionseffizienz durch Fluoreszenzmikroskopie entnommen

Nehmen Sie Fluoreszenz- und Hellfeldbilder auf und bestimmen Sie den Prozentsatz der Zellen. Um dann die Hemmung der NPH-GFP-Sekretion zu beurteilen, werden 100 Mikroliter des zellfreien konditionierten Mediums in einzelne Vertiefungen einer schwarzen Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen übertragen. Verwenden Sie ein Fluorimeter mit einer Anregungswellenlänge von 485 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 515 Nanometern, um die GFP-Fluoreszenz im Medium in relativen Fluoreszenzeinheiten zu messen.

Nachdem das Lesen abgeschlossen ist, übertragen Sie die Daten auf einen PC. Stellen Sie den GFP-Fluoreszenzwert im Kontrollmedium auf 100 % ein Vergleichen Sie diesen dann mit dem GFP-Fluoreszenzniveau im Medium von Zellen, die mit verschiedenen SMR-Peptiden transfiziert wurden, um Veränderungen in der NPH-GFP-Sekretion zu bestimmen. Die Co-IP zur Isolierung von Motivbindungspartnern ist ein schwieriger Schritt.

Stellen Sie sicher, dass die Kügelchen während der Inkubation richtig gerührt werden und dass bei jedem Waschschritt so viel Flüssigkeit wie möglich aus den Kügelchen entfernt wird. Züchten Sie Jerk-Hat-Zellen in einem RPMI 1640-Medium, das 10 % FBS bei 37 Grad Celsius enthält, in einer T 75-Gewebekultur-Pelletzelle durch Zentrifugation bei 1000-fachem G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter PBS und geben Sie es in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Eine Minute lang mit dem 1000-fachen G drehen. Dann resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Anti-Flag-Lyse. Puffer durch schonendes Pipettieren differenziell Mikrozentrifuge.

Die Aufhängungen bei 2000 mal G für fünf Minuten und bei 13.000 mal G für 10 Minuten. Um die Zelltrümmer bzw. die DNA zu pelletieren, sammelt man den Überstand, der im Folgenden als Lysat bezeichnet wird. Nach Bestimmung der Proteinkonzentration fügen Sie ein Milligramm Lysatprotein und ein Mikrogramm entweder des SMR-Wildtyps oder des SMR-mutierten Peptids zu 20 Mikrolitern Anti-Flag M Zwei-Affinitätsgel hinzu.

Dieses Affinitätsgel wird im Folgenden als das Harz bezeichnet, das die Mischung auf ein Endvolumen von einem Milliliter in Co-IP-Puffer bringt. Bereiten Sie auch eine Negativkontrolle vor, bei der das Lysat in Abwesenheit eines der beiden Peptide mit Harz kombiniert wird. Inkubieren Sie die Mischungen über Nacht bei vier Grad Celsius mit einer End-over-End-Rotation.

Am nächsten Tag pelletieren Sie das Harz durch Mikrozentrifugation bei 5.000 bis 8.000 G für 30 Sekunden. Warten Sie nach dem Schleudern ein bis zwei Minuten, bevor Sie die Proben anfassen, damit sich das Harz im Röhrchen absetzen kann. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipettenspitze mit schmalem Ende oder einer Hamilton-Spritze und achten Sie darauf, dass kein Harz übertragen wird.

Waschen Sie das Harz viermal durch Reanimation, suspendieren Sie es in 500 Mikrolitern Waschpuffer, gefolgt von einer Mikrozentrifugation. Zur Eluierung der gebundenen zellulären Proteine. Geben Sie 15 Mikrogramm überschüssiges Drei-fach-Flaggen-Peptid in das Röhrchen in 50 Mikroliter Waschpuffer und inkubieren Sie auf einem Wippenschüttler 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, nachdem Sie die Inkubationszentrifuge 30 Sekunden lang bei 5.000 bis 8.000 Mal G inkubiert haben.

Nachdem Sie die Röhrchen zwei Minuten lang abgesetzt haben, sammeln und bewahren Sie den Überstand mit den entgangenen Proteinen auf. Nach der Konzentration der EITs durch Acetonfällung werden die Proben in Laly-Probenpuffer gekocht. Trennen Sie dann die Proteine nach SDS-Seite auf einem 40 bis 20%triss, HCL-Kriterium vorgefertigten Gel, färben Sie das Gel mit Kumasi Brilliant Blue R zwei 50.

Zur Beurteilung der Antikörperhemmung für transfizierte JCA-Zellen mit NGFP und entweder Antifa-Tubulin oder Anti-Mortalitäts-Antikörper unter Verwendung eines Chariot-Protein-Verabreichungsreagenzien-Kits, wie im Begleitdokument beschrieben, entnehmen Sie das zellfreie konditionierte Medium aus den geernteten Zellen. Übertragen Sie 100 Mikroliter in einzelne Vertiefungen einer schwarzen Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen. Messen Sie dann die GFP-Fluoreszenz im Medium mit einem Fluorimeter mit einer Anregungswellenlänge von 485 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 515 Nanometern in relativen Fluoreszenzeinheiten.

Nachdem Sie die Platte gelesen haben, übertragen Sie die Daten auf einen PC und stellen Sie den GFP-Fluoreszenzgrad in der Anti-Fett-Tubulin-Kontrolle auf 100 % einVergleichen Sie dies mit dem Niveau der GFP-Fluoreszenz im Medium von Zellen, die mit Anti-Mortalitäts-Antikörpern transfiziert wurden, um Veränderungen in der NEF-GFP-Sekretion zu bestimmen und apoptotische Motive von HIV zu kartieren NPH-Proteine Die Peptid-Scanning-Analyse wurde wie in diesem Video beschrieben durchgeführt. Die Y-Achse zeigt den Prozentsatz der Zellen, die tunnelmarkiert sind, und die x-Achse zeigt den Behandlungszustand, wie hier gezeigt, wurden zwei separate Regionen von HIV und ein NEF identifiziert, die Apoptose induzieren. Diese werden durch eine vermehrte Tunnelmarkierung von Zellen angezeigt, die Neph-Peptiden ausgesetzt sind.

Die Apoptose-Peaks werden durch Motiv eins und Motiv zwei bezeichnet, um die kompetitive Hemmung der Nephsekretion durch SMR-Wildtyp-Peptide zu bewerten, Kulturmedium aus Jerk-CAT-T-Zellen, die mit einem NPH-GFP-Klon durchtrennt wurden, und verschiedene SMR-Peptide wurden auf exoomale NPH-Sekretion getestet, wie durch GFP-Fluoreszenz in den Mediumpeptiden gezeigt, die ein oder mehrere Wildtyp-NPH-SMR-Sequenzmotive enthielten, die die Sekretion von exo omal NEF hemmten Während Alanin, die Substitution einer Aminosäure in dieser Region, die Wirksamkeit der Peptide stark reduzierte. Dies deutet darauf hin, dass das SM R-Wildtyp-Peptid exo omal nph hemmt, eine mit 11 Aminosäuren vermischte Version des apoptotischen Motivs von neff. Eine SM, die zuvor beschrieben und aus Sigma Genesis gewonnen wurde, wurde als Negativkontrolle verwendet und hatte keinen Einfluss auf die exo-omale NEP-Sekretion.

Dieses Bild des kumasi-gefärbten SDS-Seitengels zeigt die Co-Immunpräzipitation von vier Proteinen durch das SMR-Wildtyp-Peptid mit den Größen 60, 65, 75 und 250 Kilodalton. Das SMR-mutierte Peptid der Negativkontrolle erfasste diese Proteine nicht, und diese Proteine interagierten nicht unspezifisch mit dem Affinitätsharz. In Abwesenheit des SMR-Wildtyp-Peptids deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die konfessionierten Proteine spezifisch mit den SMR-Motiven des SMR-Wildtyp-Peptids interagierten.

Der Plate Reader Assay zeigt, dass die Transfektion des antimortalen Antikörpers mit dem neph-Expressionsplasmid die exo omale NPH-Sekretion vollständig aufhob. Der nicht verwandte Antikörper hatte keinen Einfluss auf die exo omale Sekretion. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine intakte NM-Talentinteraktion für die exoomale Nephsekretion erforderlich ist.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Sie nach dem Anschauen dieses Videos ein gutes Verständnis dafür entwickelt haben sollten, wie Sie die beschriebenen Techniken zur Identifizierung funktioneller Motive in Zielproteinen verwenden und diese Daten zur Entwicklung von Peptid-Base-Inhibitoren dieser funktionellen Motive verwenden können. Beim Versuch des Co-IP-Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, bei der Durchführung der Inkubationswaschungen sorgfältig darauf zu achten, dass die Kügelchen während der Inkubationen richtig gerührt werden und dass bei jedem Waschschritt so viel Flüssigkeit wie möglich aus den Kügelchen entfernt wird. Auch während der Zell- und Lysatharzwäsche kann sich das Harz nach der Zentrifugation immer absetzen.

Verwenden Sie die Pipettenspitzen mit schmalem Ende und führen Sie vier Wäschen durch, um den Hintergrund angemessen auf ein akzeptables Maß zu reduzieren.